邹全瑛主编免疫部分文稿sh-3f第三章 免疫球蛋白

第三章 免疫球蛋白 1890年学者Behring等用白喉外毒素免疫动物后，在其血清中发现有能够中和这种外毒素的物资，称之为抗毒素，其后人们将血清中这类能够发生特异性反应的组分称为抗体（antibody,Ab）。现在人们普遍认为抗体是B细胞受抗原刺激增殖分化为浆细胞后产生的能与该抗原发生特异性结合的球蛋白。具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白（immunoglobulin,lg），分为分泌型和膜型两类，分泌型主要存在于血清和组织液中，具有抗体的功能，而膜型则是B细胞表面的抗原受体。抗体是生物学功能方面的概念，所有的抗体都是lg；lg则是化学和结构方面的概念，lg不一定都是抗体。 第一节 免疫球蛋白的结构 多发性骨髓瘤是由浆细胞无限增殖形成的细胞克隆，其瘤细胞分泌的骨髓瘤蛋白是均一的无抗体活性的lg，易于纯化和大量提取，是研究lg结构的主要材料。目前lg结构已基本了解。 一.免疫球蛋白的基本结构及分类 lg的单体是由对称的四条肽链组成的“Y”型结构。其中两条相同的分别由450～550个氨基酸残基组成的长链称重链（heavy chain,H链），分子量约为50～75kD；另外两条相同的分别由214个氨基酸残基组成的短链称轻链（light chain,L链），分子量约为25 kD。重链和重链、重链和轻链之间有二硫键连接，构成lg的基本单位（图3－1）。 图3－1 免疫球蛋白结构示意图 在每条轻链内有两个由链内二硫键连接构成的环肽。根据化学结构和抗原性的差异，轻链分为κ和λ两型。虽然同一个天然Ig分子上轻链的型总是相同的，但同一个体的lg，轻链可有不同的型。生物种属不同，体内λ型和κ型轻链的比例不同，正常人血清中的κ：λ约为2：1。 在每条重链内，有4～5个由链内二硫键连接构成的环肽。根据氨基酸排列顺序、空间结构和抗原性的差异，lg重链分为μ链、γ链、α链、δ链和ε链五类，其与L链连接后构成完整的lg分子，分别相应被称为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。 在Ig分子肽链的氨基端（N端），轻链约1/2（含108～111个氨基酸残基）、重链约1/4（含118个氨基酸残基）的区域内，氨基酸种类和排列顺序随抗体特异性不同而有很大变化,人们因此称之为可变区(variable region,V区)。在每个V区中，均有一由链内二硫键连接形成的肽环，每个肽环约含67～75个氨基酸残基，其种类和排列顺序变化较大。轻链和重链的V区分别称为VL和VH，在VL和VH中各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变异性，称为高变区（hypervariable region,HVR），与抗原表位互补，为抗体与抗原结合的位置，因而又称之为互补决定区（complementarity-determining region,CDR），同时该区也是Ig分子独特型决定簇（idiotypic determinant）主要存在的区域。VL中的高变区通常分别位于第24～34、50～60、89～97位氨基酸；VH的高变区则通常分别位于第30～35、50～63、95～102位氨基酸。VL和VH的这三个高变区分别称为HVR1、HVR2和HVR3，通常HVR3具有更高的变化程度，而重链在与抗原结合中起更重要的作用。在可变区的非HVR区域中，氨基酸组成与排列顺序变化相对较小,主要发挥支撑空间构象作用,故称之为骨架区(framework region,FR)。VL和VH各有4个FR（FR1、FR2、FR3、FR4），分隔各HVR。 在Ig分子肽链的羧基端（C端），轻链约1/2（含105个氨基酸残基）、重链约3/4（从119位氨基酸至C端）的区域内，氨基酸种类和排列顺序相对稳定，变化很小，称之为恒定区（constant region,C区）。重链和轻链的C区分别称为CH和CL，不同类Ig的CL长度基本一致，而CH长度则不一，有的是CH1～CH3，有的是CH1～CH4。同一种属个体产生的针对不同抗原的同一类别Ig，其C区氨基酸组成和排列顺序较恒定，即具有相同的免疫原性，此为制备抗抗体的理论基础。C区与Ig的多种生物学效应相关。 IgG、IgD、IgE和血清型IgA均为单体；分泌型IgA含2个单体，称二聚体；IgM由5个单体组成，称五聚体。在这些多聚体Ig中，单体由肽链J链（joining chain）连接。J链是一种酸性含糖肽链，由浆细胞合成，分子量约15kD，由124个氨基酸残基组成，其中有8个半胱氨酸残基，可通过二硫键结合在Ig的重链上，从而将Ig单体连接成为稳定的多聚体。在分泌型IgA分子中，还有一辅助结构即分泌片（secretory piece，SP），其分子量约75kD，也是一种含糖肽链。其由粘膜上皮细胞合成，以非共价形式与IgA二聚体结合，使其成为分泌型IgA（SIgA）。分泌片的作用是使IgA分泌至粘膜表面同时保护IgA,使之免受蛋白酶的降解（图3－2）。 图3－2 免疫球蛋白多聚体示意图 二.免疫球蛋白的功能区 Ig分子的肽链可通过链内二硫键的连接折叠成数个球形结构，这些结构各自具有特定的功能，故称之为功能区（domain）。每个功能区由约110个氨基酸组成。轻链有VL和CL两个功能区。不同种类Ig，其重链的功能区不同，IgG、IgA和IgD的重链各有四个功能区，即一个可变区（VH）和三个恒定区（CH1、CH2和CH3）；IgM和IgE的重链较长，各有五个功能区，即一个可变区（VH）和四个恒定区（CH1、CH2、CH3和CH4）。 各功能区发挥不同作用：VL和VH是与抗原结合的部位，其中HVR是V区中与抗原决定簇（或表位）互补结合的位点，每个Ig分子单体有2个抗原结合位点；CL和CH上具有部分同种异型的遗传标记；IgG的CH2有补体Clq结合点，能通过经典途径激活补体且与母体IgG通过胎盘有关；IgG的CH3具有结合免疫细胞Fc段受体的功能而IgM的CH3则有补体结合位点；IgE的CH2和CH3可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面IgE的Fc段受体结合，和Ⅰ型超敏反应的发生有关。 在CH1和CH2之间，有一段由约30个氨基酸残基组成的能自由折叠的肽链，称铰链区（hinge region）。IgE和IgM无此结构。该区富含脯氨酸残基和二硫键,不易构成氢键形成α-螺旋，故呈伸展状态，可发生一定程度的转动。当VL、VH与相应抗原结合时，此区可发生扭曲，使Ig分子上两个抗原结合位点能更好地与两个抗原决定簇互补；该区的转动可致CH2和CH3构型变化，显露出补体结合位点等功能位点，发挥激活补体、结合组织细胞等生物学作用。该区对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶敏感，Ig分子在这些蛋白酶的作用下常于此处断裂。 三.免疫球蛋白的水解片段 为了更好研究 Ig的结构和功能，人们常用蛋白酶将Ig分子水解为各种片断。 用木瓜蛋白酶处理IgG（图3－3），可于铰链区链间二硫键连接的两条重链的近N端处将其切断,获得三个片段，即两个相同的Fab段和一个Fc段。Fab段是抗原结合段（fragment of antigen binding），分子量为54kD，含一完整的轻链和一约为1/2的重链（N端）。其中重链部分称为Fd段，约含225个氨基酸残基，包括VH、CH1和部分铰链区。Fab段具抗体活性，可与抗原结合，但一个Fab段只能与一个抗原决定簇结合，故表现为单价，不能形成凝集或沉淀反应。Fc段在低温下可结晶，故又称为可结晶段（fragment crystallizable），分子量约50kD，由两条重链（C端）的一半及链间二硫键组成,包含CH2和CH3。Fc段不能结合抗原，但保留了Ig分子重链原有的抗原性和生物学活性。 图3－3 木瓜蛋白酶作用示意图 用胃蛋白酶处理IgG（图3－4），可于铰链区链间二硫键连接的两条重链的近C端处将其切断,获得一个大的片段即F（ab'）2和一些小分子多肽碎片（pFc'）。pFc'可继续为胃蛋白酶所水解而失去其生物学活性。F（ab'）2由两个Fab及饺链区组成，因此能同时与两个抗原决定簇结合，表现为双价，与抗原结合可发生凝集和沉淀反应。F（ab'）2无Fc段，故不能固定补体和结合细胞膜表面Fc受体，且抗原性大为降低，但又保留了结合相应抗原的生物学活性，因而在生物制品的制备工作中有相当大的实用价值。目前人们使用的精制抗毒素，就是用胃蛋白酶水解后提取的F（ab'）2制品，其仍具有中和毒素的作用，但引起超敏反应的机率大为降低。 图3－4 胃蛋白酶作用示意图 四.免疫球蛋白的血清型 Ig是蛋白质，具有抗原性，在不同种属动物之间及同种异体动物之间甚至在自身体内都可作为抗原引起特异性免疫应答，产生相应抗体。这种抗原性可用血清学方法测定和分析，故称其为Ig的血清型，分为同种型、同种异型和独特型。 （一）同种型 同种型（isotype）指同一种属内所有个体的Ig分子共有的抗原特异性，不同的种属，其同种型抗原特异性不同。亦即同种型抗原免疫机体，产生的抗体可与同种属所有个体的同类Ig结合，但不能同与其他种属个体的同类Ig结合。同种型为非遗传性标志，其抗原决定簇位于Ig分子的恒定区，包括Ig的类、亚类，型和亚型。 根据氨基酸排列顺序、空间结构和抗原性的差异，lg重链分为μ链、γ链、α链、δ链和ε链五类，其与L链连接后构成完整的lg分子，亦分别相应被分为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE五类，各类lg重链的抗原性不同，相互间不会引起交叉反应。 在同一类Ig分子中，重链恒定区氨基酸组成和二硫键数目也有不同，因此抗原性也有差异，据此可将同一类Ig分为不同的亚类。人类IgG有IgG1～IgG4四个亚类；IgA和IgM各有两个亚类，即IgA1、IgA2和IgM1、IgM2；IgD和IgE尚未发现有亚类。抗原性的差异在亚类间比不同类之间小。 lg分子的轻链根据化学结构和抗原性的差异，分为κ和λ两型，lg据此也相应分为κ和λ两型。在λ型lg分子中，其轻链恒定区有个别氨基酸残基存在差异，因此又可进一步将其分为λ1、λ2、λ3和λ4四个亚型。 （二）同种异型 同种异型（allotype）指同一生物物种的不同个体间的Ig分子抗原性的差异。这种差异往往只有一个或几个氨基酸残基的不同，可能是由于编码Ig的结构基因发生点突变所致，因此可作为遗传标记。同种异型的抗原决定簇主要分布在CH和CL，抗原性较弱。目前已知IgG和IgA有异型，IgG的同种异型抗原以Gm表示，IgA的同种异型抗原用Am表示，κ型轻链的同种异型抗原标记为Km。IgM、IgD、IgE和λ型轻链无同种异型抗原。 （三）独特型 独特型（idiotype）指同一个体内各lg分子的可变区具有的抗原特异性，这种抗原特异性主要由VL和VH中的高变区的氨基酸排列顺序和构型决定。不同B细胞克隆产生的lg分子，结合抗原的特异性不同，其独特型也各不相同。独特型的抗原决定簇称独特位(idiotope)，lg分子每一Fab段均含5～6个独特位。独特型不仅存在于lg分子中,也存在于B细胞和T细胞的抗原受体上。独特型在种属间不同，同种异体间不同，甚至在自体内也可引起特异性免疫应答，产生相应抗体，即抗独特型抗体（anti-idiotype antibody,AId）。独特型和抗独特型抗体构成了一个复杂的网络，对免疫应答的调节发挥重要作用。 第二节 免疫球蛋白的生物学特性 1. 免疫球蛋白的主要生物学功能 （一）特异性的识别、结合抗原 1．Ig的特异性结合抗原特性是由其V区（尤其是V区中的高变区）的空间构型所决定的。Ig的重链和轻链高变区组成其特异性的抗原结合位点，可与相应抗原上的表位互补结合，这种结合可以借助静电力、氢键以及范德华力等次级键形成，且这种结合是可逆的，受pH、温度和电解质浓度的影响。 2．由于Ig可为单体、二聚体和五聚体，故其结合抗原表位的数目不同。Ig结合抗原表位的个数称为抗原结合价。IgV区与抗原结合后，其Fc段变构,从而具有其他生物学活性，如中和作用、调理作用、激活补体等。V区本身也可中和毒素、阻断病原入侵。故Ig最显著的生物学特点就是能够特异性地与相应的抗原如细菌、病毒、寄生虫、某些药物或侵入机体的其他异物结合，从而有利于机体发挥溶菌、杀菌等生物学作用。 （二）活化补体 1．IgM、IgG1、IgG2和IgG3可通过经典途径活化补体。IgG1～IgG3和IgM与相应抗原结合后，可因构型改变而使其CH2/CH3功能区内的补体结合点暴露，从而激活补体经典途径。当抗体与相应抗原结合后，IgG的CH2和IgM的CH3暴露出结合C lq的补体结合点，开始活化补体。 2．IgM通过经典途径激活补体的能力最强,IgA和IgE不能通过经典途径激活补体,但其凝聚物可激活补体旁路途径。凝聚的IgA、IgG4和IgE等可通过替代途径活化补体。 （三）结合Fc受体 人体内的巨噬细胞、淋巴细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞和血小板等均可表达Fc受体。不同细胞表面具有不同Ig的Fc受体，分别用FcγR、FcεR、FcαR等来表示。Ig Fc段可与多种细胞表面的Fc受体结合。根据Ig与不同细胞上Fc受体结合，发挥的不同的生物学作用，这种可分为以下几种： 1．与肥大细胞表面Fc受体结合 IgE抗体由于其Fc段结构特点，可在游离情况下与有相应受体的细胞（如嗜碱性粒细胞、肥大细胞）结合，称为亲细胞抗体（cytophilic antibody）。I型超敏反应中机体产生的IgE可与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面IgE高亲力FcεR受体细胞结合，刺激细胞脱颗粒，释放组胺，合成炎性介质如白三烯、前列腺素等，引起Ⅰ型变态反应。 2．与吞噬细胞表面Fc受体结合 IgG的Fc段能与吞噬细胞表面Fc受体结合,介导调理作用（图3－5）。调理作用（opsonization）指抗体、补体等调理素(opsonin)能够覆盖在颗粒性抗原表面，有利于吞噬细胞发挥吞噬作用的效应。（见下图）。其中由于补体对热不稳定，因此被称为热不稳定调理素（heat-labile opsonin），而抗体又称热稳定调理素（heat-stable opsonin）。抗体的调理机制一般认为是：①抗体在抗原颗粒和吞噬细胞之间“搭桥”，从而拉近了吞噬细胞和靶抗原之间的距离；②抗体与相应颗粒性抗原结合后，改变抗原表面电荷，降低吞噬细胞与抗原之间的静电斥力；③抗体可中和某些细菌表面的抗吞噬物质如肺炎链球菌的荚膜，使吞噬细胞易于吞噬。 图3－5 调理作用示意图 3．与NK细胞、中性粒细胞表面Fc受体结合 IgG抗体的Fab段与带有相应抗原的靶细胞结合后，其Fc段可与带有FcγR的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞等效应细胞结合，发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC），此时IgG不仅起到连接靶细胞和效应细胞的作用，同时还可以刺激效应细胞合成和分泌肿瘤坏死因子和γ干扰素等细胞因子溶解靶细胞。例如嗜酸性粒细胞可以通过ADCC作用脱颗粒释放碱性蛋白等，在杀伤寄生虫如蠕虫中发挥重要作用（图3－6）。 图3－6 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用示意图 此外，人IgG的Fc段能非特异地与葡萄菌A蛋白（staphylococcus proteinA,SPA)结合。SPA为菌细胞壁的一种表面蛋白，当机体受到细菌感染后，可产生相应的IgG。IgG的Fab段与相应的抗原特异性结合后，Fc段又能非特异地与SPA结合，产生凝集反应，故可应用SPA纯化IgG等抗体，或代替第二抗体用于标记技术。 （四）通过胎盘 在人类，IgG是唯一可通过胎盘，从母体转移给胎儿的Ig。正常胎儿仅合成微量IgG,其抗感染免疫主要依赖于由母体转移来的IgG。目前已证实,胎盘母体一侧滋养层细胞能摄取各类血清Ig,但其吞饮泡内仅含FcγR，使IgG能选择性地与胎盘母体一侧的滋养层细胞结合，转移到滋养层细胞的吞饮泡内，并主动外排到胎儿血循环中。IgG通过胎盘的这种作用是一种重要的自然被动免疫，对于新生儿抗感染有重要作用。 2. 各类免疫球蛋白的特性和功能 　　同一种属的个体可以产生五类Ig。不同的Ig，其合成部位、合成时间、血清含量、分布、半衰期以及生物学活性有所差别。 　　（一）IgG 　　IgG主要由脾脏、淋巴结中的浆细胞合成和分泌，以单体形式存在。在出生后第3个月开始合成，3～5岁接近成年人水平。IgG是再次体液免疫应答产生的主要Ig,是血清中含量最高的抗体成分，约占血清总Ig的75%。IgG分布于全身所有组织及体液(包括脑脊液)，在血浆和组织液中约各占50%。根据IgG分子中γ链抗原性差异，人IgG分为4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4（小鼠4个亚类是IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）。IgG的半衰期相对较长，约为20～30天。不同的IgG亚类，其生物学活性有所差异。由于IgG在体内含量高、分布广,且较其他Ig更易透过毛细血管壁弥散至组织间隙,故在人体内发挥着重要的抗感染、中和毒素及调理作用。并且IgG可通过经典途径活化补体，其固定补体的能力依次是IgG3＞IgG1＞IgG2,在小鼠为IgG2b＞IgG2a＞IgG3，人的IgG4和小鼠的IgG1无固定补体的能力。IgG是唯一能通过胎盘的Ig，所以在新生儿抗感染免疫中起着重要作用。多数抗菌性、抗病毒性抗体属IgG类，某些自身抗体（如SLE患者的抗核抗体、抗甲状腺球蛋白抗体、引起II、III型超敏反应的抗体、可促进肿瘤生长的封闭性抗体等）也多属IgG。 （二）IgM IgM的产生部位主要在脾脏和淋巴结中,主要分布于血液中,具有较强的抗全身感染的作用。血清中IgM是由5个单体通过一个J链和二硫键连接成五聚体，是5类Ig中分子量最大者,又称巨球蛋白。理论上，IgM的抗原结合价为10价,但与大分子抗原结合时,由于受空间结构限制,实际仅为5价。由于IgM有较高的结合价,故属高效能抗微生物抗体,其杀菌、溶菌、溶血、促吞噬以及凝集作用比IgG高500～1000倍。IgM可中和毒素和病毒，人体缺乏IgM可能发生致死性败血症。IgM占血清总Ig的5%～10%。在生物进化过程中IgM是最早出现的免疫球蛋白，如八目鳗可产生IgM。IgM是初次体液免疫应答早期阶段产生的主要Ig，IgM在感染早期即已产生,所以检测IgM水平可用于传染病早期诊断。IgM也是在个体发育过程中最早出现的抗体,胚胎晚期已能合成，IgM不能过胎盘，所以新生儿脐带血中若出现针对某种病原微生物的IgM，表示胚胎期有相应病原微生物如梅毒螺旋体、风疹或巨细胞毒等感染，称为胚胎感染或垂直感染。IgM具有强大的激活补体经典途径的作用,亦为引起II、III型超敏反应的抗体。巨球蛋白血症、SLE等患者血清中有较高浓度的IgM,类风湿因子、冷凝集素、天然血型抗体等均为IgM。 （三）IgA IgA主要由粘膜相关淋巴样组织产生，其中大部分是由消化道粘膜固有层中的浆细胞产生，少部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜组织合成。哺乳期产妇腺组织含有大量IgA产生细胞，这些细胞主要来自胃肠。在人类，还有少量的IgA来自骨髓。IgA在出生后4～6月开始合成，4～12岁血清中含量达成人水平。人体内的IgA有血清型和分泌型两种。 1.血清型IgA 主要由肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生，占总Ig的10%左右，半衰期约5～6天。IgA有IgA1和IgA2两个亚类。血清型IgA 主要存在于血清中，多(85%)为单体，具有抗菌、抗毒、抗病毒作用,对支原体和某些真菌可能也有作用。血清IgA具有多种抗体活性,如同种血凝素、抗胰岛素、抗布氏菌、抗白喉毒素、抗脊髓灰质炎病毒抗体等。有人认为IgA与组织抗原具有特殊结合力,从而可消除进入循环中的此类抗原,防止这些抗原诱导的炎症或自身免疫应答。体内IgA缺乏,可伴有抗甲状腺球蛋白、肾上腺组织、DNA等的自身抗体水平升高。 2.分泌型IgA(SIgA) 是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处粘膜固有层中浆细胞所产生。SIgA 主要存在于初乳、唾液、泪液、胃肠液、支气管分泌液等外分泌液中，是由J链连接形成的双聚体，其通过粘膜或浆膜上皮细胞向外分泌时,与上皮细胞所产生的分泌片连接成完整的SIgA,释放到分泌液中。SIgA水平降低的幼儿易患呼吸道或消化道感染；老年性支气管炎也可能与呼吸道SIgA合成功能降低有关。由于外分泌液中SIgA含量多,且不易被一般蛋白酶破坏,故成为机体抗感染、抗过敏的重要免疫“屏障”。存在于呼吸道、消化道黏膜部位的特异性SIgA，其无需补体参与即能中和局部病毒。产妇可通过初乳将分泌型IgA传递给婴儿，这也是一种重要的自然被动免疫。此外，SIgA对由食物摄入或空气吸入的某些抗原物质具有封闭作用,使这些抗原游离于分泌物,易于被排除,或使抗原物质限制于粘膜表面,不致进入机体,从而避免超敏反应的发生。 　 （四）IgD 　　IgD主要由扁桃体、脾等处浆细胞产生，人血清中IgD浓度为3～40μg/ml,不到血清总Ig的1%，在个体发育中合成较晚。IgD铰链区很长，且对蛋白酶水解敏感，因此IgD半衰期很短，仅2.8天。 血清IgD功能尚不清楚。有报道IgD可能与某些超敏反应有关,如抗青霉素和牛奶过敏性抗体以及SLE、类风湿性关节炎、甲状腺炎等自身免疫病中的自身抗体,有属IgD者。IgD是B细胞的重要表面标志：幼稚B细胞分化过程中,表面先出现mIgM,后出现mIgD；B细胞若仅表达mIgM,接受抗原刺激后易致耐受性，若同时表达mIgM与mIgD,则受抗原刺激后可被激活。 　　（五）IgE IgE又称反应素或亲细胞Ig，分子量为188kD，血清中含量极低，仅占血清总Ig的0.002%，在个体发育中合成较晚。IgE主要由鼻咽部、扁桃体、支气管、胃肠等处粘膜固有层的浆细胞产生，这些部位常是变应原入侵和I型变态反应发生的场所。在鼻液、支气管分泌液、乳汁及尿液中可检出IgE,其水平与血清IgE相似。某些寄生虫病、某些真菌感染和某些金黄色葡萄球菌感染后,可诱导IgE大量产生。某些肝病和骨髓瘤时,IgE含量也异常升高。 人类五种免疫球蛋白的重要特性 见表3-1 表3-1人类五种免疫球蛋白的重要特性 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA1 IgA2 IgD IgE 重链 分子量（kD） 主要存在形式 开始合成时间 成人血清水平 （mg/ml） 血清中半寿期 （天） 经典途径活化 补体 替代途径活化 补体 穿过胎盘 结合吞噬细胞 结合肥大细胞 和嗜碱性粒细胞 与SPA结合 中和作用 NK细胞介导 的ADCC γ1 140 单体 γ2 146 单体 γ3 165 单体 γ4 146 单体 μ 970 五聚体 α1 160 单体、双体 α2 160 单体 δ 184 单体 ε 188 单体 出生后3个月 胚胎后期 出生后4~6个月 任何时期 较晚 9 3 1 0.5 1.5 3.0 0.5 0.03 5×10-5 21 ++ - +++ +++ - + ++ ++ 20 + - + - - + ++ - 7 +++ - ++ +++ - ± ++ ++ 21 - - ± - - + ++ - 10 +++ + - - - - + - 6 - - - + - - ++ - 6 - - - + - - ++ - 3 - - - - - - - - 2 - - - - - - - - 免疫作用 抗菌、抗病毒抗体,抗毒 素，自身抗体 早期防御作 用，溶菌、溶 血，天然血型 抗体，类风湿 因子，mIgM为 B 细胞抗原受 体 黏膜局部 免疫作用 MIgD为成 熟B细胞 抗原受体, B细胞分 化成熟的 标志 I型超敏反应,抗 寄生虫 感染 第三节　抗体的人工制备 　　 抗体在疾病诊断和免疫防治中发挥重要作用，故对抗体的需求越来越大。人工制备抗体是大量获得抗体的重要途径。目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 抗体三类。 　　 一.多克隆抗体 早年人工制备抗体的方法主要是以相应抗原免疫动物，获得抗血清。由于大多数抗原是由大分子蛋白质组成，常含多种不同抗原表位，而每一决定簇都可刺激机体一种抗体形成细胞,产生一种特异性抗体，故传统上通过接种动物所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物,称为多克隆抗体(polyclonal antibody)。它是由多株B细胞及其子代在多种抗原表位刺激下所产生。此类抗血清用于分析鉴定抗原时常发生交叉反应,即使经免疫吸收处理后亦难以避免,更不适用于抗体结构和基因组成的研究。经多年实践，用于制备抗血清的动物由早期的小鼠、大鼠、兔、羊等小动物发展到马等大动物，但所获抗体的质与量均不敷现代医学生物学之需。因此如何能获得均一性抗体成为关注的问题。 　　 二.单克隆抗体 体内免疫法很难获得单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。如能将所需要的抗体形成细胞选出,并能在体外进行培养,即可获得已知特异性的单克隆抗体。1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞（sheep rue blood cell），SRBC）免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合,建立了体外细胞融合技术，获得免疫小鼠脾细胞与恶性浆细胞瘤细胞融合的杂交瘤细胞，产生的抗体仅针对某一特定抗原决定簇,纯度很高,称为单克隆抗体，从而使得规模化制备高特异性、均质性的抗体成为可能。 杂交瘤技术的原理是:骨髓瘤细胞(一种浆细胞的瘤细胞)可大量无限繁殖,但不能产生特异性抗体;免疫的B细胞能产生抗体，但不能在体外无限制繁殖。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后产生杂交瘤细胞,它继承了两个亲代细胞的特点，既保存了骨髓瘤细胞无限制迅速繁殖的特点,又继承了免疫B细胞可合成和分泌特异性抗体的能力,因而可按人们意愿生产大量均一的mAb。杂交瘤技术的建立不仅具有广泛的实用价值,且为研究抗体生成理论和抗体遗传控制提供了有效手段。 单克隆抗体因为其由单个B细胞(即基因完全相同的杂交瘤细胞)增殖而形成的细胞纯系所产生，所以具有高度的均一性。由于mAb具有性质纯、效价高、特异性强、少或无血清交叉反应等特点,已广泛应用于医学生物学各领域。例如：用于检测各种抗原,包括肿瘤抗原、细胞表面抗原及受体、激素、神经递质以及细胞因子等活性物质；mAb与抗癌药物、毒素或放射性物质偶联,可制成生物导弹,用于肿瘤患者的体内定位诊断和治疗，是一种新型免疫治疗方法，有可能提高对肿瘤的疗效。单克隆抗体的应用极大提高了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性，并且极大推动了基础免疫学和临床免疫学研究进展,被视为免疫学发展史的里程碑。 三.基因工程抗体 自1975年单克隆抗体杂交瘤技术问世以来，单克隆抗体在医学中被广泛地应用于疾病的诊断及治疗。但目前绝大数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药时体内产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱或消失。因此目前较好的解决 办法 鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载企业年金办法下载企业年金办法下载 是研制基因工程抗体(genetically engineering antibody),以代替鼠源单克隆抗体用于临床。 基因工程抗体又称重组抗体,其原理为：借助DNA重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰,重新组装成新型抗体分子。基因工程抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少了无关结构,并赋予抗体分子以新的生物学活性,故比天然抗体具有更广泛的应用前景。 　　迄今已经成功地构建出了多种基因工程抗体，包括人－鼠嵌合抗体、改型抗体、单链抗体、小分子抗体及抗体库等。其中以嵌合抗体的研究较多，也较成熟。单链抗体及小分子抗体虽具有结构简单、分子小等优点但其临床应用的前景尚待证实。 第四节 抗原抗体在体外的反应 抗原抗体在体外的反应传统上称为血清学反应，是由于试验时多采用人或动物血清作为抗体标本。但随着单克隆抗体技术和基因工程抗体技术的建立与实际应用，抗体的来源已不再局限于动物血清，故已被广义的抗原抗体反应所取代。 近年来，随着免疫化学、细胞生物学和分子生物学的新进展，以及各种现代高新技术在免疫学中的应用，在各种抗原物质和生物活性分子的分离、纯化与鉴定，特异性抗体的制备等方面取得了突破性进展。因此不断地更新和充实以抗原抗体反应为基础的现代免疫学实验技术，已成为当今生命科学各个领域中实验研究的重要手段。本节中主要介绍抗原抗体反应的原理及其类型。 一.抗原抗体反应的原理 抗原与抗体在体外的特异性结合，主要基于抗原和抗体分子在结构及立体上的互补及二者分子间引力参与的可逆性免疫化学反应。根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。 (一)抗原抗体的亲和力 抗原抗体的结合就像酶与底物的结合、激素与其受体的结合一样是由非共价键结合的。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间较强的亲和力。空间构型互补程度越高，则亲和力越强。这种亲和力是依靠下列各种分子间引力所促成。 1.静电引力作用 抗原和抗体之间带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引使之结合。 2.范德华引力（van der Wal’s attraction force） 由抗原与抗体分子的外层电子之间相互作用产生的一种引力，引起分子吸引而发生结合。 这种引力的能量小于静电引力。这种引力作用的关键在于分子的空间构型。抗原抗体分子的互补空间关系有助于该引力发挥作用，它可以增加两种分子结合在一起的倾向，形成抗原抗体特异性复合物。 3.氢键（hydrogen bond）作用 在具有亲水基团的抗体与相应的抗原相互接近时，可形成相对微弱和可逆的氢键桥梁，通过氢键使抗原和抗体相互结合。由于氢键结合必须存在有互补的供氢者和接受基团的分子，所以其作用力更具有特异性，且比范德华引力的结合力强。 4.疏水作用（hydrophobic interaction） 抗原抗体分子侧链上的某些氨基酸为疏水性，在水溶液中与水分子之间不形成氢键。当抗原与抗体分子表面上的此种疏水基团密切接触时，可排斥水分子，在二者之间产生引力而相互结合。 (二)抗原抗体的胶体特性与极性基的吸附作用 抗体作为免疫球蛋白和大多数蛋白质一样在水溶液中具有胶体性质，并带有电荷。同时蛋白质胶体粒子含有羧基、氨基及肽链等强极性基团，与水分子有很强的亲和力，在粒子外周构成水化膜，使蛋白质成为亲水胶体。同种胶体粒子在一定PH值的水溶液中带有相同电荷，互相排斥。 抗原与抗体之间有相对应的极性基，当二者由于物理和化学特性相吻合互相吸引而结合后，不能再与环境中水分子结合，因而失去亲水性能，成为憎水胶体系统。倘若此时有一定浓度的电解质存在，如NaCl生理溶液等，可以中和胶体粒子表面所带电荷，促使其发生凝集或沉淀。 二.抗原抗体反应的类型 根据抗原与抗体特异性结合后产生的现象和结果不同，将经典的抗原抗体反应分为以下四种类型： (一)凝集反应 是颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的反应。细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集反应（agglutination）。此类反应可检测到1μg∕ml 水平的抗体。 1.直接凝集反应 将细菌、螺旋体或红细胞等颗粒性抗原与相应的特异性抗体混合，经过一定的时间后出现凝集现象。试验中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。常用玻片法和试管法两种试验。前者是用已知抗体与相应抗原在玻片上反应，用于抗原的定性检测，如ABO血型鉴定、细菌鉴定；后者是在试管中连续稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原，用于抗体的定量检测，如诊断伤寒病的肥达试验。 2.间接凝集反应 将可溶性抗原（或抗体）吸附在一种与免疫无关的隋性载体颗粒表面，使其成为致敏载体，然后与相应抗体（或抗原）结合，在电解质存在的条件下，载体颗粒被动地发生凝集，因此称为间接凝集反应或被动凝集反应。常用的载体颗粒有人O型红细胞，聚苯乙烯乳胶颗粒、活性炭粒等。间接凝集反应的灵敏度比直接凝集反应高2-8倍，适用于抗体和各种可溶性Ag 的检测，且微量、快速、操作简便，无需昂贵的实验设备，应用范围广泛。 3.Coombs试验 此试验是1954年由Coombs建立的一种抗球蛋白抗体参与的血凝试验，又称抗球蛋白试验（antiglobulin test），用于检测抗红细胞不完全抗体。所谓不完全抗体，多为7S的Ig G型抗体，因其体积小，长度短，只能与一方红细胞抗原的决定簇结合，而不能同时与双方红细胞的抗原决定簇相连，因此不能发生凝集反应，此时如加入抗人IgG抗体后，通过二抗把一抗与红细胞的复合物相连接，即可出现凝集现象。此试验常用于新生儿溶血症、自身免疫性溶血症等的检查及红细胞抗原不相容性输血所产生的血型抗体进行检测。 (二)沉淀反应 沉淀反应（precipitation）指可溶性抗原与相应杭体在液相中特异性结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的沉淀现象。根据试验中使用的介质和检测方法不同，沉淀反应可分为液体的沉淀反应和凝胶内沉淀反应两种类型。其中液体内沉淀反应主要分为絮状沉淀试验、环状沉淀试验、免疫浊度测定，在此主要介绍凝胶内沉淀反应。 1.单向免疫扩散试验（single immunodiffusion test） 此法是一种定量试验，一般是用已知抗体测定未知量的相应抗原。试验时先将抗体加入琼脂凝胶中混匀，制成含抗体的琼脂板，然后于琼脂板上打孔，孔中加入一定量的待测抗原。由于抗体已与琼脂凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散。因此称为单向免疫扩散试验。结果可在小孔周围出现可见的沉淀环，其大小与抗原量成正相关。 每次试验需用不同浓度的标准抗原，在相同条件下测定。以测得的沉淀环直径为横坐标，相应的抗原量为纵坐标，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，再根据所形成沉淀环的直径在标准曲线中查得待检标本的抗原含量。本法常用于定量测定血清IgG、IgM、IgA和C3等。 2.双向免疫扩散试验（double immunodiffusion test） 此法是一种定性试验。将抗原、抗体分别加入琼脂凝胶上相对应的小孔中，使两者互相扩散，在比例适当处形成可见的沉淀线。若反应中含有两种以上抗原-抗体系统，则小孔间出现两条以上沉淀线。观察沉淀线的位置、数量、形状，可对抗原或抗体进行定性分析，常用于抗原和抗体的纯度鉴定。 (三)补体结合反应（Complement fixation reaction） 抗原抗体结合后能够激活系统内的补体产生细胞溶解。利用这种特性用抗体与红细胞表面的抗原结合，根据产生的溶血现象判定试验结果。补体结合试验和溶血空斑试验均属此类反应。 （四）中和反应（neutra lization） 中和试验是免疫学和病毒学中常用的一种抗原抗体反应试验方法，用以测定抗体中和病毒感染或细菌毒素的生物学效应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体称为中和抗体；凡能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体称为抗毒素。中和试验可在敏感动物体内进行，也可以在体外组织或试管内进行。观察特异性抗体能否保护易感的实验动物免于死亡及测定抗体的其他生物学效应，例如抗链球菌溶血毒素“O”试验及流感病毒血凝抑制试验等，均属于中和试验范畴。 （ 范虹 李曼君） PAGE 13