十二章免疫细胞化学

免疫细胞和组织化学技术一、免疫组化概念免疫组织化学是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。特异、灵敏、准确，定位、定量、定性，形态、机能、代谢，系分子病理学研究的常用手段。二、基本特点三、免疫组化的染色过程抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化标记物与抗体集合形成标记抗体标本的处理抗原抗体反应和呈色反应显微镜下观察结果一、抗原二、抗体三、免疫细胞化学反应四、标记物第一节免疫细胞化学原理抗原：凡能刺激机体产生抗体并能与抗体特异结合的物质称为抗原抗原性：物质所具有的这种特性称为抗原性一、抗原细胞中具有抗原性的化学成分有：蛋白质多肽脂蛋白多糖脂多糖糖蛋白核蛋白这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗?从生物学功能来看都包括了哪些物质?酶、受体、抗体、细胞外基质激素、细胞结构蛋白、病原体等具有抗原性的物质包括：二、抗体CCFcFabNNNNCCFab片段具有抗体活性，决定某种抗体与抗原结合的能力和特异性Fc片段决定该抗体本身作为抗原刺激机体产生抗体的能力和特异性决定其本身抗原性抗体的结构免疫细胞化学技术中所用的抗体有两种：抗血清—多克隆抗体，是用提纯的抗原免疫动物后从动物血清制备得到的。单克隆抗体—是指由单个产生特异抗体的Ｂ淋巴细胞分化增殖形成的细胞克隆产生的抗体。原理：把组织细胞中的特异分子作为抗原，用在显微镜下可见的标记物标记特异抗体(或者标记抗原抗体复合物)使特异的免疫化学反应具有可见性,从而间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。三、免疫细胞化学反应组织抗原抗体标记物标记抗体1荧光2酶3亲和技术4金标抗原免疫细胞化学反应过程为：＋标记物间接法直接法两种免疫反应方法直接法：优点：简单方便，易于操作，省时省力缺点：敏感度不够，特异性不强，标记抗体需自己制备。间接法：优点：敏感度高，特异性强，可购买不同的标记二抗，不必对一抗作标记，避免标记造成对抗体与抗原结合的影响。缺点：操作比直接法复杂1.免疫荧光技术2.免疫酶技术3.免疫亲和技术4.胶体金技术四、标记物标记物使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可的物质免疫荧光技术将荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位（一）免疫荧光技术免疫荧光显微镜技术海马细胞微管蛋白绿色(胞体、树突)轴突终末蛋白红色(突触)培养的成纤维细胞微管呈绿色核呈蓝色是将酶作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位。（二）免疫酶技术1.反应产物定位准确，颜色对比清晰2.反应后标本材料可长期保存3.能用于电镜观察免疫酶技术优点：酶抗原一抗二抗酶标二抗酶—抗酶抗体复合物抗酶抗体酶标抗体法抗酶抗体法复合物法酶标记的三种形式用交联剂将酶与抗体联接成酶标抗体用于直接法和间接法酶标抗体法用酶免疫动物获得抗酶抗体，通过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连接在一抗上,再加入酶及其底物，达到用酶标记抗原抗体反应的效果由于产生抗酶抗体的动物与产生第一抗体的动物是同一种属，两种抗体具有相同的免疫源性，所以在反应中本来针对一抗的二抗也能与抗酶抗体结合抗酶抗体法或称酶桥法先获得抗酶抗体并将抗酶抗体与酶一起预先制成酶－抗酶抗体复合物在反应中，由二抗的桥梁作用把复合物与一抗连接在一起最后加入底物，从而达到用酶标记抗原抗体反应的效果优点:1、抗体活性高2、灵敏度高酶－抗酶抗体复合物法常用的标记酶：1.辣根过氧化物酶2.碱性磷酸酶常用的两种方法是：（1）过氧化物酶标记抗体法（2）过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）一抗与组织抗原特异结合二抗又将PAP复合物与第一抗体连接在一起然后加入HRP的天然底物H2O2和捕捉底物DAB光镜-棕黄色反应产物(组织抗原的定位)１.辣根过氧化物酶（hoseradishperoxidase,HRP）单核细胞呈弥散弱阳性中性粒细胞呈粗颗粒强阳性２.碱性磷酸酶（Alkalinephosphotase,AKP）碱性磷酸酶技术常用的两种方法：(1)碱性磷酸酶标记抗体(2)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（APAAP）（Alkalinephosphotase－Antialkalinephosphotase）APAAP法的原理：以碱性磷酸酶为标记物,再通过与其底物的细胞化学反应使抗原抗体反应可见常用的底物是萘酚,偶联剂是固蓝、固红等NAP染色结果(+)—(++++)固紫-B利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子亲和物质具有多价能力的物质，与亲和物质有高度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标记物(荧光素、酶、胶体金等)结合最常用的亲和物质系统：1、生物素（biotin）与亲和素（avidin）两者结合能力为不可逆的2、葡萄球菌A蛋白与免疫球蛋白IgG（三）亲和细胞化学技术(1)标记亲和素－生物素技术（Labeledavidinbiotin,LAB）(2)桥式亲和素－生物素技术（Bridgedavidinbiotin,BAB）(3)亲和素－生物素-酶复合物技术（Avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，ABC）1.生物素系统标记技术的基本方法生物素化酶生物素化抗体亲和素—生物素—酶复合物生物素亲和素生物素与抗体共价偶联后加入与过氧化物酶（或荧光素）结合的亲和素利用生物素－亲和素之间的结合，间接显示组织细胞中的抗原标记亲和素生物素法利用亲和素为桥梁连接生物素化的抗体和生物素化的酶桥式亲和素－生物素法亲和素－生物素-酶复合物技术亲和素与生物素偶联的过氧化物酶组合成亲和素－生物素－酶复合物①特异性抗体（一抗）先与组织细胞中的抗原结合，②生物素化抗体（二抗）再与一抗结合③复合物与生物素化抗体结合①→③→②→葡萄球菌A蛋(StaphylocalproteinA,SPA)◆是金黄色葡萄球菌细胞壁含有的一种蛋白简称为A蛋白或蛋白A◆SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG呈非特异性结合又能与标记物结合经标记的SPA可代替相应标记的二抗2.葡萄球菌A蛋白与IgG系统（四）免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以光镜和电镜下都可见的胶体金作为抗体或Ａ蛋白的标记物，间接显示组织细胞中特异分子的技术胶体金颗粒大小一般在5--60nm胶体金颗粒 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面带负电荷，蛋白质表面带正电荷，蛋白质在等电点或偏碱时被吸附于金颗粒表面,形成一个蛋白层阻止了金颗粒的相互接触，使免疫金处于稳定状态胶体金对蛋白质的标记:胶体金A蛋白1.免疫金法※(ImmunogoldstainingIGS)2.免疫金银法（Immunogoldsilverstaining,IGSS)3.彩色免疫金银法（ColouredIGSS,CIGSS）免疫胶体金技术常用方法免疫金法一抗与抗原结合金标抗体或金标A蛋作为二抗与抗原抗体复合物结合抗原抗体反应部位在光镜下呈现红色，在电镜下呈高电子密度1、采用不同大小的金颗粒(通常5-20nm)标记不同抗体或A蛋白，达到双重甚至多重标记定位多种抗原的目的2、金颗粒便于计数，可对反应作定量分析3、可用于透射、扫描电镜和冷冻蚀刻标本可将结果与光镜免疫金技术结果进行对照免疫交体金体金优点：                                                     胶体金标记技术免疫细胞化学技术是在原位检测细胞中抗原基本过程:抗原固定↓抗原与抗体结合反应↓标记系统反应第二节免疫细胞化学方法一、样本制备标本的处理组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。标本的固定与保存固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。好的固定剂：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应标本的固定与保存冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构的破坏。石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法，可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但是抗原的保存量不如冰冻切片。标本的固定与保存室温，2min1％聚甲醛细胞悬液室温，3～10min10％甲醛类脂质4℃，30～60min四氯化磺室温，5～10min丙酮，无水乙醇病毒室温，3～10min丙酮、甲醇细菌4℃，4～5h1％聚甲醛激素4℃，30min四氯化磺酶4℃，30min丙酮免疫球蛋白室温，3～15min95％乙醇蛋白质固定温度与时间固定剂抗原各种抗原的固定酶消化处理石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。抗体制备：特异抗体主要从购买获得(也可自行制备特异抗血清甚至单克隆抗体)抗体标记:直接法对每种一抗进行标记，很少用间接法对二抗进行标记(标记二抗使用十分普遍)标记抗体的方法：1.荧光素标记抗体方法2.酶标记抗体3.生物素化抗体4.胶体金标记抗体或A蛋白二、抗体准备抗体稀释抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应鲜明，背景应浅或不着色。抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。三、基本实验过程（一）免疫染色标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。（一）免疫染色对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。2.非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物组织上的带电荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。（二）标识物的选择用量微小，容易在光镜或电镜下识别机体内无同一物质或类似物质物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定目前常用标识物质有荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶等（三）设立对照实验为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。（1）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。（四）常见方法举例1.石蜡切片脱蜡至水2.3%H2O2/甲醇阻断内源性过氧化物酶5min3.PBS洗，吹干4.抗原修复5.正常羊血清(二抗的正常血清)1:20室温封闭20min。降低背景着色。6.适当稀释一抗(兔抗体)孵育保湿盒30-60min。7.PBS洗8.适当稀释二抗(羊抗体)孵育保湿盒30min9.PBS洗10.适当稀释兔PAP复合物孵育30min37度11.PBS洗12.0.04%DAB+0.03%H2O2显色，充分水洗终止反应13.苏木素衬染,封片14.光镜观察棕褐色阳性反应沉淀物过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法（PAP法）ABC技术1.石蜡切片脱蜡至水2.3%H2O2/甲醇阻断内源性酶5min3.PBS洗，吹干4.抗原修复5.无关血清1:20室温封闭20min，降低背景着色。6.适当稀释一抗(兔抗体)孵育保湿盒30-60min。7.PBS洗8.生物素化二抗孵育保湿盒30min37度9.PBS洗10.适当稀释ABC复合物孵育30-60min11.PBS洗12.0.04%DAB+0.03%H2O25-10min显色，充分水洗终止反应13.苏木素衬染,封片注意事项1.内源性生物素活性及其消除生物素是一种辅酶，存在于某些组织和细胞内，在应用ABC染色时会与生物素结合而产生非特异性染色。因此，在应用ABC方法前应预先以0.01%的抗生物素，以消除内源性生物素结合活性，每次作用后用PBS洗5min，更换3次。2.ABC复合物的配制生物素与亲合素一定要按照试剂盒要求的比例混合。3.ABC试剂保存温度以4℃为佳，据报告保存可达两年之久，仍能获得满意效果，而在-20℃生物活性在短期内即被破坏。80nm左右厚度超薄切片置于镍网上1-10%H2O2蚀刻1%BSA室温封闭适当稀释一抗孵育室温1%BSA室温封闭适当稀释的10-20nm金标A含2%戊二醛/3%多聚甲醛固定铀、铅染色电镜观察高电子密度的金颗粒2.电镜包埋后胶体金细胞化学反应1.石蜡切片脱蜡至水2.3%H2O2/甲醇阻断内源性酶5min3.PBS洗，吹干4.抗原修复5.无关血清1:20室温封闭20min，降低背景着色。6.适当稀释一抗(兔抗体)孵育保湿盒30-60min。7.PBS洗8.酶标SPA湿盒孵育30min，37度9.PBS洗10.PBS洗11.0.04%DAB+0.03%H2O25-10min显色，充分水洗终止反应13.苏木素衬染，封片SPA法(葡萄球菌A蛋白免疫酶法)第三节免疫组化的结果判断无分布规律，某一片均匀着色同一部位呈不同程度显色显色程度无特定部位，无结构性特定，具有结构性显色定位细胞和间质均匀染色或更强特定细胞或间质显色部位非特异性染色特异性染色染色免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。一、阳性标记强度特征细胞免疫组化标记的阳性强度根据显色程度分为弱阳性、中度阳性和强阳性；也可依据阳性细胞在细胞中所占比例大致分为：弱阳性，阳性细胞≤25%；中阳性，阳性细胞25%~50%；强阳性，阳性细胞>50%。二、免疫组化结果的判断原则免疫组化具有特异性强、敏感性高及定位正确等优点，但随着免疫组化应用的普及和深入，越来越多的问题也随之出现。因此，掌握对免疫组化结果的判断原则是很重要的。1.结果的判断；同理，没有阴性对照，也就不能做出真正阳性结果的判断。因而，没有对照的免疫组化染色，即使做出了判断也是不可信的。2.抗原表达必须在特定部位阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性，如LCA在细胞膜上、Keratin在细胞浆内、S-100蛋白在胞浆和胞核内，EMA在细胞膜上。不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。3.阴性结果不能视为抗原不表达即阴性结果不能认为具有否定意义；阳性表达有强弱、多少之分，哪怕是只是有少数细胞阳性（但要在抗原所在部位）也要视为阳性表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。4.免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应再结合临床资料、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。三、引起假阴性和假阳性结果的原因1.假阴性结果的原因主要是：（1）抗体已失活或浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度；（2）由于组织自溶，抗原扩散而导致抗原消失，特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性，因此应多用新鲜固定之标本；（3）操作步骤不当，如反应时间不够或过久、洗脱不够或温度过高；（4）组织或细胞中抗原的含量很低，所用的方法难以检测到，如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。2.假阳性结果的主要原因是：（1）所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现；（2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合；（3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色；三、免疫组化操作经验和体会操作中应注意以下问题：1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。3.PBS洗涤要充分。4.要设阴性和阳性对照。5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。6.消除内源性生物素活性：预先以0.01%抗生物素溶液作用切片20min。7.ABC复合物应在临用前30min配置。8.ABC试剂保存温度以4℃为佳，保存达数年仍可获满意效果。9.抗体保存：-20℃分装冻存，或于4℃常规使用，切忌反复冻融。（一）均匀的背景染色1.酶-底物反应时间过长。2.在孵育中切片干燥。3.一抗或二抗稀释度不够。4.切片洗涤不充分。5.封闭所用的正常血清不对。四、免疫组化常遇问题（二）部分区域背景着色1.切片部分区域干燥。2.显色反应物在封片介质中是可溶的，造成弥散。（三）部分区域不着色1.脱蜡不完全。2.切片部分区域干燥。（四）各种孵育结果所有抗体均不着色1.H2O2终浓度不够或存放过久失效。2.稀释液中有错误的正常血清（如猪抗兔酶标抗体稀释液中有正常兔血清）。3.显色反应物溶于脱水的酒精、二甲苯或封片液中。（五）某些抗体不着色1.需要消化而没有消化。2.封闭内源酶时使抗体活性下降。3.切片在裱片或干燥时过热。4.抗体过度稀释，一抗浓度小于二抗。5.抗体过期或频繁冻融.（六）内源性酶活性增加H2O2-甲醇封闭不恰当。（七）脱片1.切片无粘附试剂。2.切片不干净。3.冰冻切片：组织在贴片前已经充分固定。（八）核轮廓模糊1.切片已干燥（特别是冰冻切片）。2.苏木素染液欠佳。（九）非特意性色淀1.底物-显色液使用前未经过滤。2.抗体使用前未离心。（十）阳性反应太弱1.抗体或其它试剂活性下降。2.显色反应时间过短。3.某些抗体的稀释度或孵育时间不够。4.当加抗体时切片上缓冲液过多。（十一）切片镜下模糊或黑点沉着1.脱水不彻底：进入二甲苯前加一步等量石碳酸/二甲苯混合液。2.温箱干燥替代脱水过程。第四节免疫组织化学技术的应用荧光免疫组织化学技术主要用于病原体感染的早期诊断，自身抗体检测，分析淋巴细胞表面标记物质及抗原、抗体的免疫组化定位等；在病原生物学方面，主要用于菌种的坚定和抗原结构的分析；在细胞免疫学检测中，用以检测拎包细胞表面的各种CD抗原、免疫球蛋白受体、HLA抗原和各种膜受体等。酶免疫组织化学技术主要用于组织切片或其它抗原的定位检测。组织切片中的各类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗原、姜细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可检测。免疫标记电镜技术由于需要电子显微镜，目前仍较多用于科研分析。免疫组化在临床病理诊断中的应用标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度;协助肿瘤良恶性的诊断;鉴别低分化癌和肉瘤;鉴别转移癌的性质;协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶;鉴别小细胞恶性肿瘤;癌组织耐药基因的检测;为癌症患者治疗方案的拟定提供依据;确定肿瘤组织的增殖活性;评估癌症患者的预后;检测病原体。1.简述ABC、PAP、SP法免疫组化操作过程。2.免疫组化的概念3.免疫组化的特点及常用标记物种类。