昆虫卵的超低温冷冻保存

昆虫卵的超低温冷冻保存 3昆虫卵的超低温冷冻保存 李广宏陈其津苏志坚庞义 ( )中山大学昆虫学研究所, 生物防治国家重点实验室 广州 510275 1 自 等首次成功冷冻保存了人精子 较好 解 决 了 此 问 题。“二 步 法 ”是 先 将 卵 用Po lge ( 细胞以来, 有关细胞冻存的研究取得很大进展,216% 次氯酸钠 50% , 为一种家庭漂白 C lo ro x ) 剂处理 2 分, 蒸馏水清洗后, 用异丙醇连续冲 与此同时, 昆虫细胞和组织的冷冻保藏也在脊 洗 20 秒, 再用 —己烷连续冲洗 30 秒, 吸干,椎动物细胞冻存技术的基础上, 逐步建立了一 n 2 喷洒任氏液, 转到改进的细胞培养液中培养 15套自己的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。但这远不能使数量繁多、形式 分。用此法处理的卵具有 80%, 95% 的渗透率 多样的昆虫种质得到有效保存。 随着一些哺乳153 , 8 9 10, 1112, 13和 75%, 90% 的孵化率。等的优化程M azu r 动物如小鼠、兔子、牛 和人 卵的 序与“二步法”大同小异, 该方法将卵用两张滤 , 80 年代中期, 人们开展了对昆虫卵冻存成功 14 网夹成“三明治”的形式, 用 2. 6% 次氯酸钠处 ( ) 的超低温 - 196?冷冻保存研究, 经 10 多 理并经异丙醇冲洗后, 在空气 中 干 燥 2 分, 用 年 的 努 力, 目 前 已 有 果 蝇 D rosop h ila 15, 16 —庚烷和 0. 3% 或 0. 4% 丁醇混合液处 理 90n 和中华蜜蜂 m e la n og a s te r A p is ce ra n a ce r217 的卵经液氮保存后能正常孵化, 其中果 a n a 或 110 秒, 再在纯 —庚烷中处理 15 秒。 采取 n 蝇还能发育成具繁殖力的成蝇。 这些成绩为今 该法可获 得 ? 90% 的 渗 透 率 和 70%, 80% 的 25 后进一步发展昆虫胚胎冻存技术, 丰富昆虫种 孵化率。等认为在溶蜡的有机溶剂中M azu r 质保持手段奠定了良好基础。 本文拟就昆虫卵 加入一定比例的醇类物质, 有利于提高卵的渗 的超低温冷冻保存研究作一概述。 透率, 并保持较高的孵化率。采取二步法和优化 法处理的果蝇卵不仅渗透率高, 而且渗透速度 1 卵的渗透化处理 快。 20 等 采用优化法对按蚊 V a len c ia A n op h e2 昆虫卵是一个大型的细胞, 最外面包围着 卵进行了渗透化处理。 结果显示,les g am bia e 卵壳, 卵壳下是一薄层卵黄膜。卵壳是由硫键及 ( ) 2. 6% 次氯酸钠 50% 处理, 再放到 用 C lo ro x 氢键交叉联结形成的蛋白结构, 在卵壳或卵壳 异丙醇中去 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面水, 处理卵无一粒孵化。 改用 与卵黄膜之间有一疏水性的蜡质层, 它们起着 10% 的 化 学 纯 次 氯 酸 钠 处 理 20 分, 孵 化 率 为保护卵、防止卵内水分过量蒸发和阻止水溶性 18 90% 。 由于把次氯酸钠处理后的卵放到异丙醇 物 质自由进出的作用。 由于昆虫卵的外壳 中去表面水对按蚊卵的孵化率影响较大, 因此, () 内外壳和卵黄膜的总称具良好的密封性, 而 改将经次氯酸钠处理后的卵直接放在空气中吹 常规的生物体在低温保存时, 无论是平衡或非 干。用改进后的方法处理按蚊卵, 孵化率大约为 平衡型, 均要求抗冻剂渗入到生物体细胞内, 交 30% 。中华蜜蜂卵与其他许多昆虫的卵一样, 也换并去除部分水分, 以避免冷冻过程中因冰晶 具有卵壳和卵黄膜, 其作用也是防止水分的蒸的形成而带来损害, 因此, 在昆 虫 卵 低 温 冷 冻 19, 20 前, 首先必须对卵进行渗透化处理。 19 ( ) 3 国家“九五”重点科技攻关专题 96201202204和广东省自然 在“二步法”还未报道以前, 有关果蝇卵 ( ) 21 , 24 科学基金 960075资助项目。 渗透化处理的方法便有多种, 但这些方法 收稿日期: 1999201204 均不适合果蝇卵低温冷冻时使用, 而“二步法” 26 发和阻止水溶性物质的自由进出, 但王丽华 015?ƒ分使果蝇 卵 从 0?降 为 - 60?, 其 冰 晶 17 未报道是如何进行渗透化处理的。仍然产生, 因此, 采用常规冷冻方法在液氮中保 等 存果蝇卵难以成功。 2 卵对低温的敏感性 35 按蚊卵的结冰温度为- 28?, - 33?, 昆虫卵对低温的敏感性是指卵忍耐结冰点 因此, 对于是采取常规冷冻还是玻璃化冷冻的 以上低温的能力。俄勒冈 系 果蝇产下 3 小 R P 2 方法, 需根据卵对寒冷的敏感性以及这种敏感 时以内的卵在 0?下放臵 2, 3 小时, 孵化率小 性在 0?以下温度的增加程度来确定, 这方面 于 20% , 但随着卵的进一步发育, 卵对寒冷的 的工作尚在研究中。 抵抗力逐渐增强, 如将产下 12, 13 小时的卵放 4 抗冻处理 0?保存 24 小时, 孵化率大于 90% 。 尽管果蝇 卵在- 20?以上的低温下仅有小于 2% 卵形成 抗冻剂的类型、浓度、处理时间及处理温度 冰晶, 但果蝇卵对- 10?以下的温度十分敏感, 将对昆虫卵的抗冻效果及毒害产生不同程度的 2 用发育 12, 13 小时的卵在- 10?保存 90 分, () 影响。 二甲基亚砜 具有很强的渗透DM SO 36 孵化率大于 95% ; 在- 15?下保存 30 分, 孵化 能 力, 但 对 卵 的 毒 害 也 大, 此 外, 用 DM SO率迅速降为 56% , 而- 20?下保存 30 分, 卵孵 作 中 华 蜜 蜂 卵 的 抗 冻 剂, 冷 冻 后 的 卵 还 会 因27, 28 化率仅为 11% 。 按蚊卵在 8?下就出现寒 具有强烈的大蒜臭味, 而在移虫育王时 DM SO 冷伤害, 而且随温度逐步降低, 伤害比率增加, 17 产生不被工蜂接受的现象。 乙二醇、丙二醇 29 但伤害随卵的发育而减轻。尽管果蝇和按蚊 虽然也对昆虫卵有一定的毒害, 但其毒性远比卵均随卵的发育而对寒冷的抵抗力增强, 但当 37, 36 小, 且渗透力强。 甘油具有毒性小 DM SO 卵发育超过某阶段后, 烷烃和醇类物质对卵的 2 的优点, 但甘油对昆虫卵的渗透效果很差。 渗透化处理效果逐渐变差, 因此不同种类的卵 乙 二 醇 是 昆 虫 卵 低 温 冷 存 的 良 好 抗 冻均需根据该卵在不同发育阶段对寒冷的抵抗力 36, 37 剂。 在 22?下, 用 1. 0, 1. 5ƒ乙二醇 m o lL 以及烷烃和醇类物质对其渗透化处理效果两方 对果蝇卵进行平衡, 即使处理时间达 180 分, 孵 面进行确定。果蝇和按蚊分别选择发育 12, 13 化率也不下降, 2. 0 和 2. 5乙二醇则在处 ƒm o lL 和 15, 17 小时的卵, 就是出于对这两方面的考 理时间分别 大 于 120 和 20 分 时, 孵 化 率 才 下 虑。 降, 但 0?下, 果蝇卵在 2. 0 和 2.乙二 5m o l ƒL 3 卵内冰晶的形成 醇中各需处理 300 和 45 分以上, 孵化率才显著 下降, 不过在此温度下, 乙二醇的渗透速度将大细胞内冰晶的形成受冷冻速度和悬浮介质 30 , 32 ; 当乙二醇的浓度>后, 果蝇卵大降低 3m o lƒL 组成的影响。昆虫卵除受以上两种因素影 经短时间处理, 存活率明显下降。根据以上结果 响外, 卵的状态也影响着冰晶的发生, 如未处理 5 以及受 和 的方法启示, R a ll F ah y S tepo n k u s 的卵、除去卵壳的卵和已渗透化的卵, 它们形成 33, 34 和 两个研究小组均采取分两步来对果M azu r 冰晶的特点不一样。 未处理的果蝇卵产生 15, 38 蝇卵进 行 抗 冻 处 理 , 经 处 理, 果 蝇 卵 可 保 冰晶的温度范围十分狭窄, 而且不受冷冻速度 持 59% 的孵化率。影响; 除去卵壳但未渗透化的卵, 它们形成冰晶 中华蜜蜂用体积分数为 0. 10 的 抗 DM SO () 的 温度范围变宽, 且形成冰晶的中温 T IL F 50 冻液处理, 经液氮冻存后的成活率为 70% ; 改 与冷冻速度密切相关; 渗透化后, 卵形成冰晶的 用体积分数为 0. 25 的甘油+ 体积分数为 0. 25温度更高, 范围更大, 其 也与冷冻速度T IL F 50 的乙二醇+ 1.蔗糖处理, 冷存后, 卵成有关, 但渗透化的卵用抗冻剂处理后, 形成冰晶 0m o lL ƒ 17 的 温 度 范 围 缩 小, 即 使 如 此, 以 最 低 速 度活率达 75% , 孵化率为 25. 0%, 37. 5% 。 tu re. N ew Yo rk: C h apm an and H a ll, 1991. 379, 423. 5 低温冷冻 3 . , . . , . . . . ,F r ied le r SG ind ice LCL am b EJF er tilS ter il 1988, 49: 743, 764.2 和 报道, 等曾 R ich a rd D av id S tepo n k u s 4 1984, (M azu r P. A m . J . P hy siol. , 247 . , C e ll p h y sio l 尝试用常规冷冻法保存果蝇卵, 但未取得成功。)16: 1252142.C C 31和 认 为: 用 常 规 冷 冻 法 冻 存P it t S tepo n k u s 5 . . , . . , 1985, 313: 573, 575.R a ll W FF ah y GM N a tu re Sh aw P. W. , B e rna rd A. , F u lle r B. T. et a l. C ry o2lett. , 6 果蝇卵之所以不能成功, 其主要原因是难于解 1990, 11: 427, 432.决寒冷对卵的伤害和防止卵内冰晶形成这一对 . . , . . , . . . 7 Sh aw PWF u lle r BJB e rnad Aet a lM olR ep rod 相互矛盾的问题。 . , 1991, 29: 373, 378.D ev elop51985 年, 和 发展了超低温玻璃R a ll F ah y 8 . . , . . . . .Su r ry ESQ u inn PJJ I n V itro F er tilE nbry o 化冻存的方法, 这一方法克服了常规冷冻法无 T ransf . , 1990, 7: 262, 266. 9 , . , 22. ., . , . . D ied r ich KA lH a san iSV anD e r VHet a lJ 法克服的一些困难。 果蝇和中华蜜蜂卵利用玻 15 , 17 . . , 1986, 3: 65, 66. I n V itro F er tilEm bry o T ransf 璃化冻存法均取得成功。其中将果蝇卵放 . , 1991, 35: 109, 119.10 N iem ann HT h er iog enology 在 电 镜 的 铜 网 上, 并 迅 速 放 入 刚 制 备 好 的 ( ) 11 阳年生, 卢克焕. 广西农业大学学报, 1994, 13 1: 73,- 205?液氮中, 卵孵化率约 9. 4% ?715% , 其 77. 中 有 几 组 的 孵 化 率 大 于 20% , 一 组 甚 至 高 达 12 . , . . . . Q u inn PKe r in JFPJ I n V itro F er til Em bry o 16 . , 1986, 3: 40, 45.T ranst27% 。 有研究证明, 用液氮冻存果蝇卵有时 15 . . . , 1986, 46: 1, 12.13 T ro un so n AF er tilS ter il也可取得良好效果。中华蜜蜂卵则是将已抗 . . , . . , . . 214 H eaco x AEL eopo ld RAB ramm e r JDC ry o 冻的卵放在高出液氮表面几厘米处预冷 2 分, lett. , 1985, 6: 305, 312.后滴 5, 6 粒抗冻液, 待卵冷却变成乳白色, 抗 . , . . , . . . 15 M azu r PCo le KW Sch reude r s PDet a lC ry obi2 17 冻液成玻璃样颗粒时, 投入液氮中保存。 . , 1993, 30: 45, 73.ol . . , . . , . . . 16 S tepo nk u s PLM ye r s SPL ynch DVet a lN a2 6 复温和脱除冷冻保护剂 , 1990, 345: 170, 172.tu re 王丽华, 罗建能, 王涛等. 福建农业大学学报, 1997, 26:17 解冻的过程是低温冷冻过程中十分重要的 470, 472.15一个环节。等 认为在果蝇卵的冷冻过M azu r . . , . . 18 Ke rk u t GAG ilbe r t LICom p reh en sive In sec t 程中, 复温速度比冷冻速度更重要。 经测定, 果 . : P h y sio lo gy B io ch em ist ry and P h a rm aco lo gyO xfo rd , 1985, 1: 154, 226.蝇卵只有在复温速度大于 10 万?ƒ分时才能成 P e rgam o n p re ss . . , . . , . . . . ,19 L ynch DVL in TTM ye r s SPet a lC ry obiol 活, 但并非解冻液的温度越高, 解 冻 效 果 就 越 1989, 26: 445, 452.好。果蝇卵在 24?培养液中解冻, 效果最好, 在 . . . , . . , . . ,20 V a lenc ia M DPM ille r LHM azu r PC ry obiol 28 或 30?下解冻也不影响其存活率, 但提高到 1996, 33: 142, 148. 35, 45 或 58?时, 解冻卵无一存活。中华蜜蜂卵 . , . . . . , 1980, 212: 18321 A rk ing RP a ren te A J E x pZ ool17 可在 37?下复温。 , 184. 22 L im bo u rg B. , Za lo k a r M . D ev. B iol. , 1973, 35: 382, 脱除冷冻保护剂的方法, 果蝇卵与中华蜜 387. 蜂卵不同。果蝇是在含 0. 75蔗糖的220ƒm o lL D 23 M itch iso n T. , Seda t J. D ev. B iol. , 1983, 99: 261, 15 培养液中来进行, 处理时间为 2 分。 中华蜜264. 蜂卵以 6.的生理盐水脱除冷冻保护剂, 5g ƒL 24 W idm e r B. , Geh r ing W. J. D is. , 1973, 51: 149. 17 效果最好。 . , . . , . . . ,25 M azu r PCo le KW M ahow a ld APC ry obiol 1992, 29: 210, 239.参 考 文 献 ( ) 26 达 旦 父 子 公 司 美. 蜂 箱 与 蜜 蜂. 北 京: 农 业 出 版 社,1 . , ., 1949,. ,. . Po lge CSm ith A U P a rk e s ASN a tu re 1981. 54, 55.164: 666. () 下转第 298 页. . . , . . 2 R ich a rd ELTD av id LDIn sec t a t L ow T em p e ra2 放入 3, 4?温度下处理 1 个月, 到 9 月下旬放也不易积水, 因此化蛹、成虫出土都较顺利。 溪 在西昌常温下, 12 月底死亡。 而从 8 月下旬就 沟两旁土缝、小穴多, 是成虫潜 伏 越 冬 的 好 场 潜伏于干燥的土壤中的成虫在西昌至 1999 年 所, 不易遭人为和牲畜的侵袭。两年的调查都是 近溪沟的荞麦虫口多, 远离溪沟的荞麦虫口少。 1 月中旬才死亡。 但长期低温, 成虫也会死亡。 这里夏天不热, 冬天不很冷, 12, 1, 2 月均温分 1997 年 7 月下旬从昭觉采回的成虫, 将 20 头 放于 0, 1?的温度下 3 个月, 到 11 月底取出 别为 219, 114, 311?, 加之昼夜温差大, 此虫不 会因长期低温而全部冻死。但冬季气温的差别, 后, 仅 1 头存活。 荞麦柱萤叶甲在昭觉县农场生存较多的原 也影响其成虫的成活数量。 1996 年冬季, 下雪 因与这里的环境有关。 该农场的土地分布于一 大, 次数多, 温度偏低, 1997 年春季虫量较少。 溪沟两侧, 土壤含沙量较重, 质地疏松。 此虫化 1997 年冬季下雪少, 温度偏高, 越冬成虫存活 蛹时正值雨季, 土壤含水量高, 有利土室形成,率高, 1998 年春季田间虫量就比 1997 年多。()上接第 320 页 . 27 . . , . . , . . 33 M ye r s SPL ynch DVKn ipp le DCet a lC ry 2 M ye r s S. P. , L ynch D. V. , P it t R. E. et a l. C ry obiol. , obiol. , 1988. 25: 544, 545.1987, 24: 549. . . . , . . , . . . . ,28 et a lC ry 2 34 M ye r s S. P. , Sch ne ide r V. , J aco b som K. B. M ye r s SPP it t REL ynch DVet a lC ry obiol . , 1988, 25: 544. obiol 1989a, 26: 472, 484. 29 . 35 M azu r P. , Co le K. W. , Sch reude r s P. D. et a lC ry obi2 Sch reude r r s P. D. , Sm it s E. D. , Co le K. et a l. W. . , 1994, 31: 574.C ry obiol. , 1996, 33: 487, 501.ol 30 . . , . . , . . .36 . , 1983, . , D ow ge r t M . F. , S tepo nk u s P. L. M ye r s SPL in TTP it t REet a l P lan t P hy siolC ry obiol 1989, 26: 550.72: 978, 988. b . . , . . , . . .31 37 M ye r s SPL in TTP it t REet a l P it t R. E. , S tepo nk u s P. . , L. C ry obiol. , 1989, 26: 44, C ry obiol 63. 1988, 25: 545.b 32 38 . , 1984, 35: S tepo nk u s P. S tepo nk u s P. L. , C a ldw e ll S. C ry obiol. , 1992, 29: 763 A nnu. R ev. P lan t p hy siolL. 543, 584. , 764. 简 讯 首届东亚地区水生昆虫学会议 首届“东亚地区水生昆虫学会议”于 2000 年 5 月 17, 20 日在韩国 旅游度假村举行,C h iak san 会议主题为“21 世纪和东亚水生昆虫研究”。 ( ) 与会代表共计 62 人, 分别来自中国、日本、韩国、蒙古、越南、泰国和俄罗斯 远东7 个亚洲国 家和地区。美国 大学博士也应邀参加本次会议。会议共交流学术研究 40 余篇, 研 C lem so n M o r se 究领域涉及东亚地区水生昆虫系统学、生态学、行为学、环境生物学和生物地理学等。会议期间在汉 城东南方约 100的 国家公园进行了野外考察和标本采集。 km C h iak san 我国代表共 7 人参加了本届会议。杨莲芳教授与王新华博士应邀分别作了题为“云南省毛翅目 昆虫研究”和“中国摇蚊科生物地理学研究”的会议主题 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 。 与会代表一致认为, 本次会议的学术交流促进了东亚水生昆虫学研究, 并为今后进一步区域性 合作研究奠定了基础。 本届会议决定东亚水生昆虫学会议将每两年举行一次, 下一届会议, 将于 2002 年在日本举行, 2004 年的第 3 届会议将由中国主办。 王新华 ()南开大学生命科学院 300071