茄科蔬菜立枯丝核菌的融合群鉴定

茄科蔬菜立枯丝核菌的融合群鉴定 植物病理学报 ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA38(4):429-432(2008) 茄科蔬菜立枯丝核茵的融合群鉴定 伍恩宇,夏海波,于金凤 (山东农业大学植物保护学院植物病理学系,泰安271018) AnastomosisgroupidentificationofRhizoctoniasolaniisolatedfromSolanaceae vegetablecropsWUEn—yu,XIAHai—bo,YUJin—feng(DepartmentofPlantPathology,CollegeofPlant Protection,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,China) Abstract:Sixty—fivesampleswerecollectedfromrhizospheresoil,hotpepperandtomatoplantsshowi ng damping—off,rootrotandstemrotinTaian,ShouguangofShandongprovinceandZhouzhi,Taibaiof Shaanxiprovince.Thirty—nineRhizoctoniasolaniisolateswereobtainedfromthesesamples.Theresul tsof anastomosisgroup(AG)identificationandsequenceanalysisof5.8SrDNA—ITSoftheisolatesshowedthat thirty—sixisolates(92.3%)belongedtoAG4,whileonlythree(7.7%)belongedtoAG一 5.Theisolatesof AG-4couldfurtherbedividedintotwosubgroupsofAG-4.HG—IandAG-4HG.111.The5.8SrDNA.ITS sequencesoftheselectedisolatesofthetwosubgroupshadthe99%——100%identitywithstandardisolatesof AG4一HG—IandAG4一HG一111(fromGenBank).Amongtheanalyzedisolates,AG4一 HG—Isubgroupwas thedominantwiththefrequencyof79.5%.SubgroupAG4一 HG—II1withthefrequencyof12.8%wasthe second.ThisisthefirstreportthatsubgroupAG4一HG一 111ofR.solaniisolatedfromSolanaceaevegetable cropsinChina. Keywords:tomato;hotpepper;Rhizoctoniasolani;AG4一HG—III;rDNA—ITS 文章编号:0412-0914(2008)04-0429-04 番茄和辣椒是茄科蔬菜的典型代表,在全国范 围内广泛种植.茄科蔬菜苗期立枯病的病原为立 枯丝核菌,得到了大家的公认,而对茄科蔬菜茎腐 病和根腐病病原却存在不同观点.有报道认为,引 起茄科蔬菜根腐病的病原是茄腐镰刀菌Fusarium solani,终极腐霉Pythiumultimum及立枯丝核 菌Rhizoctoniasolanij.针对茄科蔬菜根部丝核 菌病原问题国内尚无系统研究.本研究旨在通 过菌丝融合鉴定和5.8SrDNA.ITS区序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 方 法,对引起茄科蔬菜苗期立枯病及成株期茎腐病 和根腐病的丝核菌类群进行鉴定,为该类病害的 有效控制奠定病原学基础. 1材料与方法 1.1供试菌株的来源 2005,2006年,自山东泰安,寿光,肥城,济 南及陕西周至,太白等地采集辣椒和番茄立枯 病,茎腐病,根腐病病株及病株周围土壤标本65 份.罹病植株样品采用常规组织分离法进行分 离,纯化.土壤样品则采用埋管法和棉苗诱导法 进行分离,纯化.得到的分离物经过镜检观察, 符合Parmeter|4提出的立枯丝核菌分类特征. 收稿日期:2007—12-25;修回日期:2008-04-28 基金项目:山东省优秀中青年科学家奖励基~:(2004BS06016);山东农业大学科学基金资助项 目 通讯作者:于金凤,副教授,主要研究方向为真菌及真菌分子系统 学;E-mail:jfyu@sdau.edu.1311. 植物病理学报38卷 1.2供试菌株融合群鉴定2.25.8SrDNA.ITS区序列分析 1.2.1供试菌株菌丝融合鉴定菌丝融合群测定 所用的标准菌株有属于日本系统的AG一1一IA,AG一 1一IB,AG_2—1,AG一3,AG-4一HG—I,AG_4一HG一?, AG-5和AG-6,由中国农业大学唐文华教授和云南 农业大学杨根华教授提供.采用常规玻片对峙培 养法进行供试菌株菌丝融合鉴定. 1.2.25.8SrDNA—ITS区序列分析采用CTAB 法提取供试菌株的DNA.5.8SrDNA—ITS区序列 PCR扩增选用50L反应体系,组成成分如下: 32.5L双蒸水,5.0L10×PCR缓冲液,4.0L MgC12(25rnmol/L),4.0LdNTP(dATP,dCTP, dGTP和dTTP各2.5mmol/L);引物为ITS1和 ITS4(浓度为25i~mol/L)各1L;模板DNA2.0 L;Taq酶(5u)0.5L.PCR扩增反应条件是: 94?变性1min,60oC退火1rain,72oC延伸1rain, 30个循环;72oC延伸7min.扩增产物用1%琼 脂糖凝胶电泳检测,TBE为电泳缓冲液,上样 5L.扩增的目的片段利用Sangon公司提供的 凝胶回收试剂盒进行回收,将回收产物连接,转 化到pMD18一T载体上,经平板筛选和菌液PCR 检测,将含有目的片段的菌液送北京华大公司双 向测序. 测得的序列在NCBI中进行BLAST分析,进 一 步确定各测试菌株的融合群及融合亚群.利用 DNAMAN6.0软件进行多重序列比较,用MEGA 3.1构建系统发育树(Bootstrap值=1ooo). 2结果与分析 2.1供试菌株茵丝融合鉴定 分离得到的39个立枯丝核菌菌株菌丝融合鉴 定结果表明,36个菌株属于AG-4融合群,出现频 率为92.3%,其中属于AG-4一HG—I融合亚群的菌 株为31株,占分离菌株的79.5%,是引起茄科蔬 菜丝核菌病害的优势群;属于AG-4一HG—llI融合亚 群的菌株为5株,占分离菌株总数的12.8%,此类 群的菌株是国内首次在茄科蔬菜上分离得到.另 有3个菌株属于AG一5融合群,出现频率为7.7%, 3个菌株均来源于陕西省的辣椒田中.供试菌株 的来源及菌丝融合鉴定结果见表1. 为了进一步验证供试菌株的融合群及融合亚 群归属,在上述菌丝融合鉴定的基础上分别从AG一 4一HG—I,AG-4一HG—Ill融合亚群及AG一5融合群中 随机选择6个菌株(表1),进行其5.8SrDNA—ITS 区序列分析. 利用引物ITS1和ITS4对所选菌株的DNA进 行PCR扩增,得到一个约680bp的片段,该序列 包含5,8S区及ITS1,ITS2区.将测得的6个菌株 的ITS区序列在NCBI中进行BLAST分析,得到 与这些菌株亲缘关系最近的菌株序列,进一步明确 了这些菌株的分类地位,并构建系统发育树(图 1).其中,AG4一HG—I(AY154307),AG4一HG—I (DQ102448),AG-4一HG一1I(AY154308),AG-4一 HG—Ill(AY154309)及AG一5(DQ355140)的序列来 自GenBank,分别代表AG-4一HG—I,AG-4一HG一1I, AG-4一HG一?及AG一5标准菌株的5.8SrDNA—ITS 区序列. 从图1可以看出,依据选择的6个供试菌株的 5.8SrDNA—ITS区序列一致性,供试菌株分属于 AG-4一HG—I,AG-4一HG—llI融合亚群和AG一5融合 群,与菌丝融合鉴定结果一致.R06—17,R06-25和 R06-27属于AG-4一HG—I融合亚群,与标准菌株 (DQ102448,AY154307)一致性达到了99%, 100%;R05—10和R05—15属于AG4一HG一?融合亚 群,与标准菌株(AY154309)的一致性达到100%; R06—14属于AG-5融合群,与标准菌株(I~Q35514o) 的一致性也达到了100%. 由5.8SrDNA—ITS区序列比较分析发现,隶属 AG-4融合群不同亚群的菌株其5.8SrDNA—ITS区 序列存在差异,相比较而言,AG-4一HG—I和AG-4一 HG一?2个亚群其5.8SrDNA—ITS区序列一致性 较高,达96%,二者的进化关系较近;而AG-4一HG一 ?融合亚群和AG-4一HG—I,AG-4一HG一?融合亚群 其相应序列的一致性相对较低,仅为93%,说明AG一 4-HG.1lI融合亚群与上述2个亚群的进化关系相对 较远.来自不同融合群的AG-4和AG一5之间,其 5.8SrDNA—ITS区序列一致性仅为91%.说明立枯 丝核菌不同融合群其5.8SrDNA—ITS区序列是判 断各融合群或融合亚群进化关系远近的有效T具. RO5一l5 RO5一l6 R05一l8 R05—23 R05_24 R05—25 R05—26 R05—29 RO5—33 R06一l RO6_2 RO6—3 R06_4 R06—5 RO6_6 R06—7 RO6名 R06一l0 R06一ll R06一l2 R06一l3 RO6一l4 R06一l5 R0616 RO6一l7 RO6一l8 R06一l9 RO6—2O RO6—2l R06_22 RO6—23 R06—24 R06_25 RO6_26 RO6_27 RO6_’28 RO6—29 R06_30 Taian,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Binzhou,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Feicheng,Shandong Feicheng,Shandong Taian,Shandong Taian,Shandong Feicheng,Shandong Feicheng,Shandong Zhouzhi,Shaanxi Taibai.Shaanxi Taibai,Shaanxi Zhouzhi.Shaanxi Taibai.Shaanxi Shouguang,Shandong Shouguang,Shandong Shouguang,Shandong Shouguang,Shandong Shouguang,Shandong Shouguang,Shandong Shouguang,Shandong Feicheng,Shandong Feicheng,Shandong Feicheng,Shandong Shouguang,Shandong Shouguang,Shandong Jinan,Shandong Jinan,Shandong AG_4一HG一? AG_4一HG—I AG_4一HG—I AG_4一HG一? AG_4.HG—I AG4.HG—I AG_4一HG—I AG_4HG—I AG_4.HG—I AG_4.HG—I AG_4.HG—I AG_4HG—I AG_4一HG—I AG4.HG—I AG_4.HG—I AG_4.HG—I AG4.HG—I AG_4.HG—I AG_4.HGI AG一5 AG一5 AG一5 AG_4.HG—I AG_4HG一? AG4一HG—I AG_4HG—I AG_4一HG—I AG4一HG—I AG_4一HG—I AG_4一HG—I AG_4一HG一? AG_4一HG—I AG4一HG—I AG_4一HG—I AG_4一HG—I AG4一HG—I AG_4一HG—I AG_4一HG—I Tomato Hotpepper Hotpepper Tomato Tomato Tomato Hotpepper H0tpepper Tomato Hotpepper Hotpepper Hotpepper Tomato Tomato Tomato Tomato Hotpepper H0tpepper Hotpepper Hotpepper Hotpepper Hotpepper Tomato H0tpepper H0tpepper Hotpepper Tomato Tomato Tomato Tomato Hotpepper Hotpepper Tomato Tomato Tomato Tomato Hotpepper H0tpepper : Theisolatesusedin5.8SrDNA—ITSanalysis 2345689m?墙加船?鲳船 432植物病理学报38卷 448) (AY154308) 40, Fig.1Phylogenetictreeconstructedwithanalysisof5.8SrDNA—ITSnucleotidesequences fr0melevenstrainsofRhizoctonsolani 3讨论 本研究从番茄和辣椒的苗期立枯病,成株期的 茎腐病和根腐病病株及病株周围土壤中分离到39 个立枯丝核菌菌株,经鉴定36个菌株属于AG4一 HG—I和AG4.HG一?融合亚群,3个菌株属于 AG-5融合群.这一研究结果说明,立枯丝核菌的 AG4融合群是辣椒,番茄丝核菌病害的主要致病 群.Kuramae等研究表明,在巴西引起番茄茎腐 病的病原属于立枯丝核菌AG4一HG—I融合亚群, 与本研究结论有相似之处.本研究证明引起辣椒, 番茄苗期及成株期丝核菌病害的优势致病群是 AG4一HG—I,其次还有AG4.HG.11I融合亚群.关 于AG4一HG—ni融合亚群的发现,是Yang等在 中国首次报道该融合亚群在云南能引起绿苋菜,中 国苋菜的茎腐病和立枯病.此外,国外有报道此融 合亚群能引起草莓茎基腐病,菠菜及西兰花的茎腐 病.本研究首次从中国的茄科蔬菜辣椒和番茄上 分离到该融合亚群的菌株,说明该融合亚群的菌株 也具有较广泛的寄主范围.该融合亚群在全国范 围的分布还有待于进一步研究. 参考文献 LiuLY,LiuXL,LiuZH,eta1.Thebiological characteristicsofFusariumsolani(inChinese)『J]. 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