分子信标技术PPT课件

分子信标技术 分子信标简介 分子信标的结构 分子信标的工作原理 分子信标的应用 前景与展望分子信标简介Tyagi和Krammer于1996年首次建立，目的是在液相中定量测定靶标序列。 基于荧光共振能量转移（FRET） 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的一种新型荧光标记核酸探针； 特殊的发夹结构使得其具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强的特点； 广泛应用于分子生物学、生物技术、生化分析，生物医学研究和临床诊断。分子信标的结构经典分子信标结构包括： 1、环状区（长度15～30个碱基的序列，能与目标分子特异结合）； 2、信标茎杆区（长度为5～8个碱基的互补序列，使得形成发夹结构）； 3、5’端荧光基团（徳克萨斯红、荧光素等染料）； 4、3’端猝灭基团（DABCYL）。首例分子信标结构示意图环状区茎杆区荧光基团猝灭基团分子信标工作原理无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生FRET，荧光猝灭，荧光背景极低。加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基团距离增大，阻止了FRET的发生，荧光恢复。影响分子信标的因素荧光—猝灭基团间的距离的影响： 环境pH值的影响：pH过高时，茎干区碱基对之间的稳定结合被破坏，分子信标变性，荧光基团与猝灭基团分开产生荧光。E：FRET效率R：荧光给体与受体之间的距离影响分子信标的因素 温度对分子信标的影响1、序列长度（环状序列比茎杆序列长两倍以上，茎杆序列不能过长或过短）2、茎杆序列中G和C的含量不能太高3、5’-端的第一个碱基最好不要选择G4、由于被测对象DNA或RNA是大分子，存在扭曲现象，因此要选择被测对象的外围碱基序列，即容易接近的那段序列来设计信标。分子信标设计原理荧光猝灭依赖的是能量共振转移，而转移的效率与荧光基团发射光谱同猝灭基团激发光谱的完全重叠有关。为了荧光能有效猝灭，荧光基团的发射光谱应完全覆盖猝灭基团激发光谱。符合此要求且较常用的荧光剂-淬灭剂有：1、EDANS（5′-(2′-氨乙基氨基奈-1-磺酸)和DABCYL（4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)；2、苯甲酸6-荧光素和DABCYL ；3、荧光素和罗丹明、荧光素和芘丁酸 、香豆素和乙锭 荧光素和伊红 、一些铽螯合物和四甲罗丹明等。分子信标技术常用的荧光剂-淬灭剂波长转移分子信标优点：如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射波长的荧光发射基团，就可在同一激发光下，通过检测这些特征波长的荧光强度， 实现在同一体系中的多基因分析。波长转移分子信标表面固定分子信标量子点分子信标分子信标的应用 核酸的检测分析 实时定量PCR测定靶标浓度 活体内核酸的动态检测 同时检测多个靶核苷酸 检测双链DNA分子信标的应用研究DNA—蛋白质的相互作用用于核酸酶的研究用于研究DNA——蛋白质的相互作用用作生物芯片和生物传感器应用1、实时定量PCR测定靶标浓度将分子信标简单地密封在PCR管中，在每个循环的退火阶段分子信标与扩增产物结合产生荧光，未结合的分子信标不发荧光，这样荧光信号随着反应循环的增加而增强，从而反映出PCR过程中扩增产物浓度的增加。由于加有分子信标的PCR管在整个反应中是密封的，因此可避免传统PCR后扩增产物凝胶电泳过程带来的污染，简化检测手段，检测灵敏度高。应用2、活体内核酸的动态检测Perlette利用微注射法在袋鼠肾细胞质中引入分子信标，对单个活细胞中的RNA进行了检测，并利用ICCD成像系统得到了一系列反应分子信标与RNA结合的荧光图像。结果表明，利用分子信标可以有效地实时检测活细胞中的RNA及研究RNA/DNA的杂交过程。分子信标的应用-双链DNA检测PNA与双链DNA互补链结合时可以取代非互补链,使之解链以单链的形式存在,形成P-环结构。特定序列的DNA或PNA分子信标可以与双链DNA的变性部分结合,分别形成PD-或PP-环型化合物,分子信标结构被破坏,出现荧光响应。最近的实验结果表明,利用茎-环结构的DNA分子信标或无茎的PNA分子信标可以实时检测PNA与双链DNA的结合位点Humanosteosarcomacellnucleus(U2OScellline)vitallyinjectedwithaCy3-labelledprobespecificforchromosomaltelomericrepeatsequenes.Notethatsomespotsarerelativelylargesuggestingassociationorclusteringofmultipletelomeres.分子信标的应用Whitcombe设计的一种将ＰＣＲ引物与分子信标相结合的蝎状引物荧光探针。在该探针中,ＰＣＲ引物与分子信标之间有一间隔臂,使ＰＣＲ反应不能往分子信标方向延伸。在ＰＣＲ过程中,非特异扩增产物不会产生荧光信号,而当特异性扩增产物生成时,分子信标将立即与其进行分子内杂交,同时发出荧光信号。分子信标的应用应用3、同时检测多个靶核苷酸通过选择不同的荧光分子-猝灭分子对，可以设计出不同荧光的多个分子信标(又称多色分子标)，每个分子信标与其各自的靶标序列杂交后，荧光检测系统可以检测到不同颜色的荧光，这样多色分子信标可对多个靶核苷酸同时定量测定。另外，波长转移分子信标同样可以用于核酸的多组分同时定量测定。应用4、用于核酸酶的研究应用4、用于核酸酶的研究应用5、用于研究DNA-蛋白质的相互作用DNA和蛋白质的相互作用的研究是目前分子生物学和生物技术研究中非常重要并迅速发展的领域。将分子信标用于DNA-蛋白质相互作用的研究，发挥了其简单、灵敏等特点，又实现了对体系的实时监测，甚至可以用于活体细胞的动态研究。Fang等以SSB、组蛋白、牛血清蛋白为对象研究了3者对分子信标的不同影响。结果表明，分子信标能够很好地区分这3种类型的DNA结合蛋白;分子信标与SSB具有很高的亲和力，其结合引起的荧光上升与完全互补的靶相近。并且他们进一步研究了SSB与分子信标的结合动力学，得出其结合常数与已经报道的结合常数相符。Workingmechanismofthefluorophore–quencher-labeledMAB.TheMABexistsatequilibriumbetweenanonstructuredrandomcoilandacompactintramolecularquadruplex.Additionofthrombin(grayellipse)shiftstheequilibriuminfavorofthequadruplexstructure,whichdrawsthefluorophore(F)andquencher(Q)closer,leadingtofluorescencequenching.Theworkingmechanismofthedonor–acceptor-labeledMABissimilartothequench-typeMAB.Thearrowsofthebackboneoftheoligonucleotidesindicatethe5–3polarityofDNA.分子信标的应用分子信标的应用前景与展望 分子信标技术已渗透到结构和分子生物学、基因和生物技术等领域的各个方面。分子信标技术有着广阔的应用空间 随着研究的深入，分子信标作为一种高特异性、高敏感性的分子探针必将在基因结构、疾病诊断、疾病机制、药物筛选等方面得到更广泛的应用。谢谢