微生物生长测定技术血球计数板计数法和比浊法
微生物生长测定技术——血球计数板计数法和比浊法
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一、血球计数板直接计数法
血球计数板是一块特别的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个
2平台，两嵴的
表
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面比两个平台的表面高0.1 mm，每个平台刻有不同规格的格网，中央1 mm面积上刻有400个小方格。
2 血球计数板有两种规格，一种是将1 cm面积分为25个大格，每大格再分为16个小格(25×16);另一种是16个大格，每个大格再分为25个小格(16×25)。两者都是总共有
2400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，400个小方格(1 mm
3面积)计数室上形成0.1 mm的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计，可计算出1 mL菌液所含的菌体数。
在血球计数板上，刻有一些符号和数字，如XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此
2计数板分25大格;0.1 mm为盖上盖玻片后计数室的高;(1/400)mm表示计数室面积是1
22mm，分400个小格，每小格面积是(1/400) mm。
血球计数板计数的操作步骤如下:
?取清洁的血球计数板，将洁净的专用盖片置两条嵴上。
?将液体培养基上的菌液进行稀释，以便于对菌液进行计数。
?摇匀稀释的菌液，用无菌滴管吸取少许菌液，从盖片的边缘滴一小滴(不宜过多)，使菌液自行渗入平台的计数室。加菌液时注意不得使计数室内有气泡，两个平台上都滴加菌液后，静置约5 min。在低倍镜下找到方格网后，转换高倍镜进行观察和计数。
?不同规格的计数板的计数方法略有差异。16×25规格的计数板，需要按对角线方位，计算左上、左下、右上和右下4个大格(共100小格)的菌数。若是25×16规格的计数板，除统计上述4个大格外，还须统计中央一大格(共80小格)的菌数。位于两个大格间线上
的菌体，只统计此格的上侧和右侧线上的菌体数。每个样品重复计数2-3次(每次数值不应相差过大，否则重新操作)，取其平均值。
?按以下公式计算出每毫升菌液中所含的细胞数:
a. 16×25规格的计数板:
100个小格内细胞数 细胞数/mL=×400×1000×菌液稀释倍数 100
b. 25×16规格的计数板:
80个小格内细胞数 细胞数/mL=×400×1000×菌液稀释倍数 80
二、比浊法测定微生物生长
在利用微生物生产单细胞蛋白、酶制剂以及益生素的过程中，为及时了解培养过程中微生物的生长情况，需定时测定培养液中微生物的数量，以便适时地控制培养条件，获得最佳的培养物。比浊法是常用的测定方法。
比浊法是在浊度计或比色计上进行测定培养液中微生物的数量，某一波长的光线，通过混浊的液体后，其光强度将被减弱。入射光与透过光的强度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。
Itlog,,Kcd I0
式中，I :透过光的强度;I:入射光的强度;K:吸光度;c:样品液的浊度;d:液t0
Itogl层厚度;I/I称为透光度(transmittance);称消光系数(optical density，简称OD)。 t0I0
如果样品液层厚度一定，则OD值与样品的浊度相关，根据此原理，可通过测定样品中的OD值来代表培养液中的浊度即微生物量。也可同时做平板计数法，对比一定混浊度所含活菌数制成曲线。本法测定的是微生物的总量。适用于菌体分散良好的非丝状单细胞微生物的测定。在进行大量培养时，此法比平板计数法能较快得出结果，省时省力。
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