连接酶说明书

连接酶说明书 连接酶说明书 篇一: T4 DNA 连接酶 #EL0011 Thermo scientificT4 DNA Ligase ——Thermo scientific #EL0011 产品信息 特点 快速 – 室温下10分钟内完成粘末端的连接反应。? 该酶在 Fermentas 公司限制酶、PCR 和 RT 缓冲液(添加 ATP)中活性。? 配套提供聚乙二醇溶液以有效进行平末端连接。应用克隆酶切产生的 DNA 片段。? ? ? ? ? ? ?克隆 PCR 产物。连接双链寡聚核苷酸街头或连接物。定点诱变。扩增片段长度多态性 (AFLP)。连接酶介导的 RNA 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 (3)。双链 DNA，RNA 或 DNA/RNA 复合体中缺口的修复。线性 DNA 自身环化。说明 T4?DNA Ligase 催化双链 DNA 或 RNA 中毗邻的5‘ -磷酸基团和3‘-羟基末端之间形成磷 酸二酯键。酶还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 复合体中的单链切口，连接 DNA 的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性 (1, 2)。T4 DNA Ligase 需要辅因子 ATP。浓度 1 Weiss u/?l = 200 CEU*/?l 5 Weiss u/?l = 1000 CEU*/?l 30 Weiss u/?l = 6000 CEU*/?l * 一个粘性末端连接单位的是指在16? 、30分钟内50%连接 HindIII 酶切的 lamda C DNA 产物所需要的酶的量。来源含有 T4噬菌体克隆基因30的大肠杆菌。分子量55.3 kDa，单体。活性单位定义 1个活性单位是指在 ATP-PPi 交换反应中，37? C、20分钟内将1nmol [32PPi]转换为 Norit 可吸收形式所需的酶量(Weiss 单位** (4)。酶活性分析混合物: mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 0.066 mM ATP, 10 mM 66 32 DTT, 3.3? ?M [ PPi]. ** 1个 Weiss 单位相当于约200个粘性末端连接单位。1个粘性末端连接单位: 20?μl 反 应体系(50 mM Tris-HCl? (pH? 7.5), 10 mM 燤 gCl2, 10 mM 燚 TT, 1 mM ATP, 25 ?g/ml 燘 SA, 0.12 ?M (300? ?g/ml)的5‘-DNA 末 端)中， 在16? C、30分钟内50%连 接 HindIII 酶切的 Lambda DNA 产物所需要的酶量。保存缓冲液 保存缓冲液组分: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA 和50% (v/v)甘 油。10X T4 DNA Ligase 缓冲液(#B69) 400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8, 25? C)。质量控制 相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。功能检测: 粘性 末端或平末端 DNA 的连接能力。抑制与失活 ? 抑制剂: 当反应体系中 NaCl 或 KCl 的浓度超过200?mM 时， 可强烈抑制 T4 DNA Ligase 活性。? 失活: 65? 加热10分钟或者70? 加热5分钟。C C 备注 聚乙二醇(PEG) 极大地增加平末端连接效率 (5) 。反应体系中的 PEG 4000的建 议浓度为5% (w/v)。? T4 DNA Ligase 与 DNA 结合会改变条带的琼脂糖凝胶电泳迁移率。为避免此现象， 电泳前需处理样本或分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。样本处理方法如下: 样本或分子量标准与 Fermentas 公司6X DNA Loading Dye SDS 溶液(#R1151)混合;70? 加热5分钟或65? 加 C C 热10分钟后冰浴保存。? 转化时，连接产物的体积不能超过感受态细胞体积的10%。? 电转化之前，先用氯仿抽提方法除去连接混合物中的 T4 DNA Ligase。然后经乙醇 沉淀纯化抽提产物。?操作 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 DNA 插入片段与载体 DNA 连接 1.反应体系配方如下: 组分 线性载体 DNA 插入片段 DNA 10X T4 DNA Ligase buffer 50% PEG 4000 溶液* T4 DNA Ligase 水，无核酸酶 (#R0581) 粘性末端连接 20-100 ng 与载体的摩尔比为1:1到5:1 2? l 0.2 ? (1 u) l 至 20 ? l 2? l 1 ? (5 u) l 平末端连接 总体积20 ? l20 ? l* 50% PEG 4000溶液随 Fermentas T4 DNA Ligase 配套提供(#EL0335，#EL0334)。2.粘性末端: 22? 孵育10分钟;平末端: 22? 孵育1小时。C C 3.65? 热失活10分钟。C 4.转化: 每50 μl 化学感受态细胞使用5 μl 连接产物;每50 μl 电转感受态细胞使用1-2 μl 连接产物。备注: 如需增加转化子数量: ? ? 如果连接产物的产量不够，建议4? 孵育连接过夜。C 采用氯仿抽提替换热失活方法，平末端连接产物建议采用电转化方法。线性 DNA 自身环化 1.反应体系配方如下: 线性载体 DNA 10X T4 DNA Ligase buffer T4 DNA Ligase 水，无核酸酶 (#R0581) 总体积 2.充分混匀后短暂离心，22? 孵育1小时。C 3.65? 热失活10分钟。C 4.取大约5 μl 连接产物转化50 μl 化学感受态细胞。10-50 ng 5? l 1 ? (5 u) l 至 50 ? l 50 ? l备注采用氯仿抽提替换热失活方法，平末端连接产物建议采用电转化方法。接头连接 双链寡核苷酸接头常用于产生插入片段中没有的兼容性突出末端。接头含有限制酶识别位点，与目标片段 连接后酶切可产生与克隆载体匹配的粘性末端。此外接头也可直接带有匹配的粘性末端，与克隆载体直接 连接，无需额外操作。 1.根据应用不同，准备下列的反应体系: 线性 DNA 磷酸化接头 10X T4 DNA Ligase buffer 限制酶用10X buffer ATP, 组分 10 mM* 连接，用于后续酶切 5 ? (100-500 ng) l 5 ? (1-2 ? l g) 2? l 1 ? (终浓度0.5 mM) l 2? l 仅仅连接 50% PEG 4000 溶液** T4 DNA Ligase (#EL0334) 或 (#EL0335) 水，无核酸酶 (#R0581) 总体积2? l 0.4 ? 或 2 ? (2 u) l l 至 20 ? l 至 20 ? l 至 20 ? l* 混合10 μl 100 mM ATP 溶液(#R0441)和90 μl 水(无核酸酶，#R0581)制备10 mM ATP 溶液。** 50% PEG 4000溶液随 Fermentas T4 DNA Ligase 配套提供(#EL0335，#EL0334)。2.充分混匀后短暂离心，22? 孵育1小时。C 3.65? 热失活10分钟。C备注连接产物酶切前无需纯化，可将限制酶直接加入连接反应混合物中。T4 DNA Ligase 活性分 析对照反应 连接酶失活或样本 DNA 中的杂质会导致连接失败。推荐采用对照 DNA(如: Lambda DNA/HindIII DNA Marker (#SM0101))的连接实验分析 T4 DNA ligase 的 活性。 1.对照连接混合物准备: Lambda DNA/HindIII DNA Marker 1 ? (0.5 ? l g) 2? l 1u 至 20 ? l 至 20 ? l(#SM0101) 10X T4 DNA Ligase Buffer T4 DNA Ligase 水，无核酸酶 (#R0581) 总体积 2.充分混匀后短暂离心，22? 孵育10分钟。C 3.制备上样混合物: 连接产物 10 ? ll 6X DNA Loading Dye SDS Solution 2 ?图 1.对照实验评价 T4 DNA Ligase 活性。1 – Lambda DNA/HindIII fragments, 未连接 2 – 连接后的 Lambda DNA/HindIII 结果解释 ? ? 出现更高分子量条带且低分子量条带变弱，表明连接酶有活性。连接后条带不发生变化，说明连接酶失活。参考文 献: ? ? ? ? ?Rossi, R., et al., Functional characterization of the T4 DNA Ligase: a new insight into themechanism of action, Nucleic Acids Res., 25, 2106-2113, 1997. Cherepanov, A.V., et al., Binding of nucleotides by T4 DNA Ligase and T4 RNA Ligase: opticalabsorbance and fluorescence studies, Biophys. J., 81, 3545-3559, 2017. Nilsson, M., et al., RNA-templated DNA ligation for transcript analysis, Nucleic Acids Res., 29,578-581, 2017. Weiss, B., et al., Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, J. Biol. Chem., 243,4543-4555, 1968. Pheiffer, B.H., Zimmerman, S.B., Polymer-stimulated ligation: enchanced bluntorcohesive-end ligation of DNA or deoxyribo-oligonucleotides by T4 DNA ligase in polymer solutions, Nucleic Acids Res., 11, 7853-7871, 1983. 篇二: NEB T4DNA连接酶T4 DNA 连接酶 货 号 #M0202L #M0202M #M0202S #M0202T #M0202V ? 提高反应效率 ? 粘性末端和平齐末端均可连接 ? 限制性酶切片段的克隆 (3) ? 将 linker 或 adapter 连接到 DNA 片段的平齐末端 ? 室温或 16 ? 均有活性 概述 该酶催化契合的双链 DNA 或 RNA 的 5?-磷酸末端和 3?-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不 仅能够催化平滑末端或粘性末端 DNA 之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/ RNA 杂交双链中的单链切口 (1) 。来源 纯化自 E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8 (2) 。反应条件 1 X T4 DNA 连接酶缓冲液 [ 50 mM Tris-HCl(pH 7.5 @ 25 ?)，10 mM MgCl2， 10 mM DTT，1 mM ATP]。推荐 DNA 5 末端浓度为 0.1, 1.0 ?M。质保声明 无核酸内切酶和外切酶污染。每批 T4 DNA 连接酶均通过模拟克隆实验进行检测，该实验 可以检测出连接后 DNA 末端的任何损伤。结果表明超过 99.9% 的 DNA 末端保持完好。单位定义(粘性末端活性单位) 单位定义(粘性末端活性单位) 1 单位指在 20 ?l 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16 ? 反应条件下，30 分钟能使 50% 的经 HindIII 消化的 λDNA 片段 [5 端浓度为 0.12 ?M (300 ?g/ml)]连接所需的 酶量。浓度 400,000 units/ml 和 2,000,000 units/ml。贮存条件 规 格 100,000 units (高浓度 5x)100,000 units 20,000 units (高浓5x)20,000 units 10,000 units 价 格 3,029.00 元 3,029.00 元 699.00 元 699.00 元 度 349.00 元 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 ?g/ml BSA 和 50% 甘油,-20? 贮存。C 热失活 65? 10 分钟。C 室温连接反应 为方便起见，连接反应可以在室温 (20-25 ?) 条件下进行。粘性末端连接: 在 20 ?l 反应体系中加入 1 ?l T4 DNA 连接酶，反应 10 分钟。平齐末端连接: 在 20 ?l 反应 体系中加入 1 ?l T4 DNA 连接酶反应 2 小时，或者加入 1 ?l 高浓度 T4 DNA 连接酶 反应 10 分钟。另外，NEB 快速连接试剂盒 [NEB #M2200S(30 次反应)，或 NEB #M2200L(150 次反应)] 可在室温下 5 分钟内完成平齐和粘性末端的连接。使用注意 与大肠杆菌 DNA 连接酶需要 NAD+ 作辅因子不同，T4 DNA 连接酶的辅因子是 ATP。稀释后的 T4 DNA 连接酶应保存于 -20 ?，50% 甘油贮存缓冲液(稀释缓冲液 A，NE B #B8001)。如稀释后马上使用，则可用 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液稀释。只要在反应体系中补加 1 mM ATP，连接反应就可以在 NEB 提供的四种限制性内切酶缓 冲液 (NEBuffer-s)或在 T4 DNA 多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。参考文献 (1) Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982). In P.D. Boyer(Ed.), The Enzyme s, Vol. 5,(p. 3). San Diego: Academic Press. (2) Remaut, E., Tsao, H. and Fiers, W., (1983) Gene, 22,103–113. (3) Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd e d.), (pp. 1.53– 1.73). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 篇三: T4 DNA 连接酶T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶， 可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的 5‘-P 末端和 3‘-OH 末端之间 以磷酸二酯键结合， 该催化反应需 ATP 作为辅助因子。同时 T4 DNA 连接酶可以修补双链 DNA、 双链 RNA 或 DNA/RNA 杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。用途: T4 linker 或 adaptor 等的连接。也可以用于缺刻修复及 Ligase 用途: DNA Ligase 常用于 DNA 片段和载体、 介导的 RNA 检测。来源: 来源: 本 T4 DNA Ligase 由大肠杆菌表达，表达基因的来源为 T4 嗜菌体。活性定义: 活性定义: One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16? in 20 ?l of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 ?g/ml BSA and a 5 -DNA termini concentration of 0.12 ?M(300 ?g/ml)。200U 等于 1 个 Weiss unit，以 Weiss unit 计，本产品共 1000 单位。纯度: 纯度: 不含 DNA 内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含 RNA 酶，满足常规连接反应要求。酶储存溶液: 酶储存溶液: 20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50%(v/v)glycerol。10X Ligation Buffer: 400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP。: 失活或抑制: 65?孵育 10 分钟可以导致 T4 DNA Ligase 失活; NaCl 或 KCl 浓度大于 200mM 时强烈抑制 失活或抑制: T4 DNA Ligase。包装清单: 包装清单: 产品编号 D7008-1 D7008-2 , 保存条件: 保存条件: -20?保存。注意事项: 注意事项: 对于普通的转化大肠杆菌的操作，不必对连接产物进行纯化，连接产物可以直接用于转化。但用电转方 法转化大肠杆菌时，通常宜先用 DNA 纯化试剂盒或酚氯仿抽提方法等纯化 DNA，然后再进行电转。需进行平端连接或快速连接时，推荐使用碧云天的快速 DNA 连接试剂盒(D7002/D7003)。T4 DNA Ligase 可以进行平端连接，但效率较低。普通的连接反应不必进行凝胶电泳观察。如果需要对于连接产物进行凝胶电泳观察，推荐先在 65?孵育 10 分钟使 T4 DNA Ligase 失活，以避免 T4 DNA Ligase 和 DNA 结合导致的条带位置迁移(band shift)。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。产品名称 T4 DNA Ligase(1000U/μl) 10X Ligation Buffer 说明书 包装 200,000U 1.5ml 1份 使用说明 爱威a9效果器使用图word使用说明在哪儿钻床数控系统用户手册玻璃钢风机使用说明书控制器用户说明书 使用说明: 使用说明: 1. PCR 产物或酶切片段和普通载体的连接: a. 取 1-2?g 载体酶切过夜，或至少酶切 3-5 小时以上。尽量确保酶切充分，否则后续会导致产生很多 自连的克隆。b. 载体酶切完毕后，可以使用试剂盒进行纯化，例如碧云天的 PCR 纯化试剂盒/DNA 纯化试剂盒 (D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。对于酶切产生较大片段(大于 5060bp)的情况推荐采用切胶回收的方式。c. 对于 PCR 产物: PCR 产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的 DNA 片段。凝胶中 DNA 片段的回收可 以使 用试剂盒进行操作，例如碧云天的 DNA 凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收 DNA 片段。d. 对于回收的 PCR 产物或其它需酶切的质粒或 DNA 片段，用适当内切酶酶切，随后纯化酶切产物。注: 这一步的酶切不必酶切特别充分，通常酶切效率能达到 80-90%以上即可。即本步骤的酶切 通常酶切 1-2 小时即可。酶切产物可以使用试剂盒进行纯化，例如碧云天的 PCR 纯化试剂盒/DNA 纯 化试剂盒(D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。e. 取约 25-100ng 经过酶切和纯化的载体，加入 3 倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体 系。注 1: 很多时候由于载体量和待插入片段的量都比较少，在回收后很难定量。此时可根 : 据回收前 电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以 DNA 分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定 量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计 算出最终得到的载体量和待插入片段量的比例关系。注 2: 通常每个反应使用 0.2-0.5?l 连接酶已经足够，如果希望进一步提高连接效率，可以把连接 : 酶的用量提高至 1?l。载体 待插入片段 10X Ligation Buffer 双蒸水或 MilliQ 水 T4 DNA ligase 总体积 约 50-100ng 约载体摩尔数的 3 倍 2μl 至 20μl 0.2-0.5μl 约 20μlf. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微 Vortex 混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。g. 20-25?孵育连接 1-2 小时，或 16?孵育连接过夜。注 1: 对于双平端连接必须连接过夜。对于双平端连接，直接使用 T4 DNA Ligase 连接效率较低， : 推荐使用碧云天的快速 DNA 连接试剂盒(D7002/D7003)。注 2: 为快速获得预期克隆可以参考如下方法: 对于 20?l 的粘端连接反应，在连接 1-2 小时后可以 : 取 10?l 直接转化大肠杆菌，其余 10?l 可以 16?孵育连接过夜。如果第二天顺利获得克隆，即可进 入下一步实验;如果第二天转化的大肠杆菌未获得预期的克隆，则可以取连‎‎接过夜的剩余连接产 物再次转化大肠杆菌。h. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。2. PCR 产物和 T 载体的连接: a. PCR 产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的 DNA 片段。凝胶中 DNA 片段的回收可以使用试剂盒进行 操 作，例如碧云天的 DNA 凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收 DNA 片段。b. 按照 T 载体的说明书取适量 T 载体，加入 3 倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。注 1: 很多时候由于载体量和 PCR 产物的量都比较少，在回收后很难定量。此时可根据回收前电泳 : 条带的亮度进行大致的估计。通常以 DNA 分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定量您 的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算出 最终得到的载体量和 PCR 产物的量的比例关系。注 2: 通常每个反应使用 0.2-0.5?l 连接酶已经足够，如果希望进一步提高连接效率，可以把连接 : 酶的用量提高至 1?l。T 载体 待插入片段 快速连接缓冲液(2X) 双蒸水或 MilliQ 水 Rapid T4 DNA ligase 总体积 适量 约载体摩尔数的 3 倍 2μl 至 20μl 0.2-0.5μl 约 20μlc. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微 Vortex 混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。d. 20-25?孵育连接 1-2 小时，或 16?孵育连接过夜。注: 为快速获得预期克隆可以参考如下方法: 对于 20?l 的粘端连接反应，在连接 1-2 小时后可以 取 10?l 直接转化大肠杆菌，其余 10?l 可以 16?孵育连接过夜。如果第二天顺利获得克隆，即可进 入下一步实验;如果第二天转化的大肠杆菌未获得预期的克隆，则可以取连接过夜的剩余连接物再次转化大肠杆菌。e. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。3. 产 Linker 或 RNAi 片段和载体的连接: a. 载体的酶切和纯化同步骤 1a 和 1b。b. Linker 或 RNAi 片段的退火可以选择适当的 DNA 退火缓冲液，例如碧云天的 Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(D0251)， 进行退火反应。c. 长度大于 8bp 的 Linker 或退火的 RNAi 片段，可以按照 5:1 至 10:1 的比例和载体进行连接反应。例如 载体为 0.03pmol，则插入片段可以为 0.15 至 0.3pmol。长度小于 8bp 的 linker，比例需调整为 10:1 以上。d. 除插入片段的用量外，随后按照步骤 1e，1f，1g，和 1h 进行。4. DNA 自身环化的连接: 参考步骤 1e，待插入片段换成适量的水即可。其余步骤按照步骤 1f，1g，和 1h 进行。5. 其它类型的 DNA 片段连接参考上述方法进行。常见问题: 常见问题: 1. 连接反应后转化效率很低或阳性克隆非常少。a. 可能感受态细菌转化效率太低，用质粒作为阳性对照同时检测感受态的转化效率。b. 可以尝试提高载体或插入片段的纯度。对于平端连接需注意适当延长连接时间。c. 可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照。d. 用存放 DNA 的溶液进行转化，作为阴性对照，检测感受态细菌是否存在问题。 篇四: CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书CRISPR 核酸酶载体试剂盒说明书 目录 内容和保存 介绍 产品信息 方法 实验轮廓 设计单链 DNA 寡核苷酸 产生双链寡核苷酸 连接反应 转化感受态 E.coli 细胞 分析转化子 转染哺乳细胞系 附录 A CRISPR 核酸酶载体试剂盒的图谱和特点 附属产品 技术支持 参考 附录 B CRISPR 核酸酶表达细胞的富集内容和含量 1.1 双链(ds)对照寡核苷酸序列ds 克隆对照的寡核苷酸的序列如下所列。ds 克隆对照的寡核苷酸来自退火的， 并在试剂盒 中提供的 50μ M 的双链寡核苷酸。ds 克隆对照的寡核苷酸在应用于连接反应之前需要进行 再退火和稀释。5‘ CATTTCTCAGTGCTATAGAGTTTT 3‘ 3‘GTGGCGTAAAGAGTCACGATATCT 5‘ 1.2 感受态细胞转化效率?1×10 cfu/微克质粒DNA9 1.3 TOP10 细胞的基因型F-MCRAΔ (MRR-hsdRMS-mcrBC)φ 80lacZΔ M15Δ lacX74recA1 araD139Δ (ARA-LEU)7697Galu galKpsL(STRR)endA1 nupG2 介绍2.1 产品信息 2. 1.1 介绍GENEART?CRISPR核酸载体试剂盒便于产生表达CRISPR RNA和tracrRNA的非编码RNA以及在哺乳动 物细胞中Cas9核酸酶介导的靶基因的裂解或基因编辑的结构体。该Cas9核酸酶是基于从细菌化脓 性链球菌II型CRISPR/ Cas系统，并经过精心设计的基因组编辑在哺乳动物系统(Jinek等人， 2017;。Mali1等人，2017;。cong等人，2017) 。带有OFP的GENEART?CRISPR核酸载体允许Cas9 和CRISPR RNA的基于流式细胞仪表达的细胞群的分选，而带有CD4的GENEART?CRISPR核酸载体使 Cas9与CRISPR RNA为基础的表达细胞的富集。线性GENEART?CRISPR核酸载体提供快速和有效的方 式来克隆编码所需CRISPR RNA靶到表达盒， 允许Cas9核酸序列中的特定的方式靶向的双链寡核苷 酸。虽然该工具包被设计来表达Cas9和引导RNA的代表以最简单，最直接的方式，使用该试剂盒 的基因组编辑和靶位点的特定靶序列裂解分析假设用户熟悉的CRISPR系统， 载体的原则为基础的 生产CRISPR RNA，并转染哺乳动物系统。我们强烈建议用户拥有CRISPR系统的工作知识。2. 1.2该CRISPR系统 在CRISPR系统是一种使用RNA指导的DNA核酸酶沉默病毒核酸(Jinek等人，2017)原核适应性免 疫系统。在细菌中CRISPR位点组成的串 为间隔件。的重复间隔联重复序列由外源DNA片段的分离(?30bp的长度)，称 件阵列被转录为一个长的前体和重复序列内被处理，以产生用于指定由 CRISPR核酸酶裂解的靶序列(也被称为protospacers)小crRNAs。CRISPR间隔物，然后用于识 别和沉默的RNA或DNA水平的外源遗传元件。必不可少的裂解是一个序列基序紧接在目标区的3 端， 被称为protospacer相邻的基序 (PAM) 的下游。在PAM中存在的靶DNA， 但不能靶向它的crRNA。 2. 1.3 基因组编辑基因组编辑包括使用在与内源性修复机制一起使用的设计好的核酸，以从基因组DNA中的特定位 置中插入，删除或取代DNA序列。设计好的核酸酶在基因组中的特定位置诱导双链断裂(DSB)， 在这之后的内源性修复机制通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性定向修复修复断裂。II型 CRISPR系统已被证明可作为在各种生物体， 包括哺乳动物细胞的基因的编辑工具。(Mali1等人， 2017;cong等人，2017)。它由三部分组成: CRISPR相关Cas9核酸(双链DNA的核酸内切酶)， 靶互补CRISPR RNA(crRNA)，和一个辅助反式激活crRNA(tracrRNA)。该crRNA和tracrRNA作 为一个短导的RNA为目标的Cas9核酸酶对特定基因组位点(图1)。图1CRISPR/Cas9介导的靶DNA裂解示意图该crRNA和GENEART?CRISPR核酸载体的tracrRNA可以表示在一起为指导RNA， 模仿在细菌系统自然 crRNA-tracrRNA杂交。引导RNA的表达是由U6 polIII启动型的启动子(图2)驱动。在GENEART?CRISPR核酸载体图2指南的RNA表达盒。该系统具有通用性，且易于使用，改变目标专一只需要变更CRISPR RNA的设计即可。 3 方法3.1步骤 1 2 3 4 5 6 7实验轮廓操作 设计的单链DNA寡核苷酸。退火单链寡核苷酸，以产生一个双链寡核苷酸 稀释双链寡核苷酸对到工作浓度 克隆双链寡核苷酸到CRISPR核酸载体上 转化One Shot?化学感受态TOP10E.coli细胞，并选择表达克隆 通过测序分析转化子中存在的插入 制备纯化的质粒DNA，转染所选择的细胞系下表和图列出了创建你的GENEART?CRISPR核酸酶载体和表达它的细胞所需的步骤。 图3 靶定特异的ds寡核苷酸的克隆和分析退火编码靶定特异的 crRNA 用 T4 DAN 连接酶克隆退火的 oligo 到线 性化的 Cas9 核酸酶报告载体上 转化到 E.coli 感受态 细胞中，筛选想要 的 CRISPR 克隆 为基因编辑而进行转染、富集和筛选 3.2 设计单链 DNA 寡核苷酸 3.2.1 介绍要使用GENEART?CRISPR核酸载体试剂盒，你首先需要设计带有两个单链DNA寡核苷酸突出段来与 线性化的载体互补; 一个编码靶CRISPR RNA(正链寡核苷酸)，而另一个与其互补(反向链寡核 苷酸)。然后，将退火的顶部和底部链寡核苷酸，以产生一个双链寡核苷酸(DS寡核苷酸)以适 于克隆到试剂盒中提供的线性载体中。单链(ss)寡核苷酸的设计是两个克隆过程的成功是至关重要的。一般准则是提供在本节，以帮 助您选择了靶序列，并设计了ss的寡核苷酸。请注意，对于一个给定的靶基因，你可能需要产生 和筛选多个crRNA序列，在其中找出一个在有效地裂解你的目标基因位点是活跃的。3.2.2 选择靶序列当执行CRISPR/Cas9诱导的DNA上的特定基因或基因位点双链断裂， 您选择靶序列可以显著影响裂 解观察到的程度。当选择你的靶定序列时，我们推荐下面的指导方针。这些只是一般性建议;可 能发生例外。长度: 选择的靶序列，从19到20个核苷酸长度的邻近一个NGG原垫片相邻的基序(PAM)的序列上 的靶序列的3 末端。注意: 需要从U6 polIII启动子转录起始的5 G是已经包含在突出端，并且不 需要被包括在靶序列中。同源性: 确保靶序列不包含显著的同源性的其他基因，因为这可以增加脱靶效应。最近发表的工 作表明， 指导gRNA-Cas9复合物有可能容忍高达1-3的不匹配。更多见解的选择靶序列参‎‎见刊登的 文章。(Fu等，2017;。Mali2等人，2017)。定位: 您可以选择靶序列编码靶基因的有义序列或反义序列。因此，您可以在提供其符 端PAM的需求两个可能的方向产生CRISPR RNA。3.2.3 需要定向克隆的序合在3 列选择19-20个碱基对的靶序列后，继续设计crRNA特异性寡核苷酸引物。重要～在寡核苷酸引物中不包括PAM序列。要启用DS的定向克隆寡核苷酸进入GENEART?CRISPR核酸载体，你必须添加以下5个核苷酸到相应 的ss寡核苷酸的3 端: ?上链低聚核苷酸 加入GTTTT到所述寡核苷酸的3 末端。该GTTTT是互补的突出端序列， CAAAA， 在线性CRISPR核酸载体(参见图3)，并构成tracrRNA的前5个碱基。 底链寡核苷酸: 底部链寡核苷酸应该是靶序列的反向互补。加CGGTG到所述寡核苷酸的3 末端。这个序列是互补的突出端序列，CACCG，在线性GENEART?CRISPR核酸载体(参见图3)，并构成U6 启动子的最后4个碱基和所需polIII启动转录起始位点的第一个碱基。 退火两条单链寡核苷酸产生带有为克隆入GENEART?CRISPR核酸载体合适末端的双链寡核苷酸。3.2.4制备双链寡核苷酸3.2.4(1 介绍退火每单链寡核苷酸的相等量，以产生一个双链(ds)的寡核苷酸。退火后，稀释ds等分寡核 苷酸从50μ M到5nm的工作浓度。3.2.4(2 所需材料?正向链寡核苷酸(200uM的水或TE缓冲液) ?反向链寡核苷酸(200微米的水或TE缓冲液) ?50uM的库存的ds对照寡核苷酸(融冰) ?10X寡核苷酸退火缓冲液 ?DNA酶/ RNA酶的水(用试剂盒中提供) ? 1.5毫升无菌离心管 ?95?热块3.2.4(3 退火过程 1、在室温下在干净的微量离心管中加入以下试剂。正链寡核苷酸(200微米) 5微升 反向链寡核苷酸(200微米) 5微升 10X寡核苷酸退火缓冲液 2μ L DNA酶/ RNA酶的水 8μ L 总量 20μ L 2，重新退火的DS克隆控制寡。短暂离心(?5秒)，转移5μ L到一个干净的离心管中，然后继续 下一个步骤。注意: 此过程也适用于当重新退火等50uM 的ds寡核苷酸。3，在加热块孵育管中于95?进行4分钟。4，从散热块中取出管，并让反应混合物冷却至25?进行5-10分钟。5，离心管短暂(约5秒)。轻轻混匀。6，继续进行稀释双链寡核苷酸 对于长期储存，保持50μ MDS寡核苷酸贮备液在-20?C。3.2.4(4 准备稀释的双链寡核苷酸单链寡核苷酸和克隆控制寡核苷酸退火后， 进行两个稀释: 50μ M的ds100倍连续稀释寡核苷酸库 存，制备500nM的DS寡核苷酸原液(100倍稀释)，和一个为5nM的ds寡核苷酸工作溶液(10,000 倍稀释)。准备500 nM的原液 准备一个500uM 的ds寡核苷酸原液稀释50μ MDS寡核苷酸库存100 倍。1，混合下列试剂在一个干净的离心管中: 50μ M ds寡核苷酸库存 DNA酶/ RNA酶的水 总量100μ L 2，旋涡混匀。对于长期储存，保持500 nM的DS寡核苷酸贮备液在-20?C。1μ L 99μ L3.2.4(5 准备 5 nM 的工作液准备一个5 nM的ds通过稀释500 nM的DS寡核苷酸原液100倍寡核苷酸工作液。注意: 为5nM的ds 寡 核苷酸工作溶液不适于长期储存，并应在每次新鲜制备。1，混合下列试剂在一个干净的离心管中: 500 nM的DS寡核苷酸溶液 1μ L; 10X寡核苷酸退 火缓冲液 10μ L ;DNA酶/ RNA酶的水 89μ L; 总成交量 100μ L 2，旋涡混匀。处理双链寡核苷酸的溶液 ?在 s寡核苷酸溶液温度上升冰上解冻冷冻的ds寡核苷酸的溶液。?切勿加热或允许的d 高于室温。ds的加热寡核苷酸中部分变性的溶液 的效果，并且在克隆效率的降低。o如果500nM的储备液，或5 nM的工作液温度过高，准备新的稀释溶液。o如果50μ MDS寡核苷酸库存变热，再退火的寡核苷酸。3.2.4(6 处理双链寡核苷酸溶液?解冻冷冻DS寡核苷酸在冰上的溶液。?切勿加热或允许的DS寡核苷酸溶液温度上升高于室温。ds 的加热寡核苷酸中部分变性的解决 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的效果，并且在克隆效率的降低。o如果500nM的储备液， 或5 nM的工作液温度过高，准备新的稀释溶液。o如果50uM的ds 寡核苷酸库存变热，再退火寡核 苷酸。 4 连接反应4.1 介绍一旦你生成你的ds寡核苷酸，并准备相应的储备液，克隆ds寡核苷酸进入GENEART?CRISPR核酸 载体。4.2 所需材料?双链寡核苷酸(5uM的1X寡核苷酸退火缓冲液，在解冻后使用冰) ?双链控制寡核苷酸(5uM的 1X寡核苷酸退火缓冲液，在解冻后使用冰) ?线性GENEART?CRISPR核酸向量(使用前解冻冰) ? 5X连接缓冲液(用试剂盒中提供) ?DNA酶/ RNA酶的水(用试剂盒中提供) ?T4 DNA连接酶(与 试剂盒中提供)4.3对照我们建议， 包括试剂盒提供的阳性对照在你的结扎实验DS控制寡核苷酸。在DS控制的寡核苷酸被 提供作为在1X寡核苷酸退火缓冲液为50μ M的股票，并且需要被重新退火和稀释10,000倍的连接 反应使用之前。如果你想有一个阴性对照，建立一个单独的连接反应，但省略了DS寡核苷酸。4.4 连接步骤在室温下对于每个ds寡核苷酸被克隆的建立具有20μ L的连接反应。 1、按照显示的顺序加入下列试剂到一个干净的离心管中: 5X连接缓冲液 4μ L 线性GENEART?CRISPR核酸载体 2μ L DS寡核苷酸(5纳米) 2μ L DNA酶/ RNA酶的水 11μ L T4 DNA连接酶 1μ L 总量 20μ L 2、混合反应: 向上和向下吹打。注: PEG的存在和甘油(由连接缓冲液和T4 DNA连接酶提供)将造成反应混合物的粘性。一定要 通过上下吹打调匀反应。不要旋涡。3，孵育10分钟，在室温下(25-27?)。注意: ，置于冰上反应， 孵育时间可以延长到2小时，并可能导致较高的产率的菌落。4 并进行TransformOne shot?TOP10感受态大肠杆菌。注意: 您可以储存剩余的连接反应在-20?过夜 2.5 转化感受态大肠杆菌细胞 2.5.1结构。One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌是理想的高效率克隆和质粒传播。他们允许高拷贝数质粒 稳定复制。TOP10细胞的基因型是类似于DH10B?菌株。为每个连接反应， One Shot?TOP10大肠 杆菌需要一管。介绍一旦你已经完成了连接反应， 转化One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌与由此产生的CRISPR核酸2.5. 2 所需材料?连接反应(从第4步，第8页) ?(可选)pUC19控制(带试剂盒中提供) ?One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(用试剂盒中提供) ?S.O.C.培养基(暖至室温后再使用) ?含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板(2个: 为每个转化;温暖，在37?，30分钟) ?42?水浴 ?37?振荡和非振荡培养箱2.5. 3 One Shot?TOP10 转化程序1，解冻One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌，并继续进行下一步的细胞解冻后立即使用。2，添加连接反应3μ L(从第4步，第8页)One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌的小瓶中，并通 过涡旋或轻敲管轻轻轻轻混匀。不要上下吹打混匀。注意: 如果执行阳性对照的转化效率，转化1μ L的的pUC19质粒。3，将管立即放置在冰上，并孵育10-30分钟。注意: 长时间孵育似乎对转化效率的影响最小。在培养的长短是在用户的决定。4，热激细胞30秒，在42?C，无晃动。5，紧随管转移到冰。6，加入250μ L的的室温S.O.C.培养基。7，盖上管紧密，摇管水平(200转)，在37?下1小时。8，差价 青霉素的一个预热的LB琼脂平板上的转化反50微升来自于含有100微克/毫升氨苄 应。镀 上的第二预热的LB琼脂平板上反应的剩余部分。过夜孵育所述板在37?下 注意: 我们建议放置两种不同的体积，以保证至少有一个板具有良好的间距菌落。如果你正在改 变的pUC19对照，在含100μ g/ mL氨苄青霉素的预热的LB平板放置20-100μ L的转化。9，一个高效的连接反应可在总共产生了100个的菌落。挑选5-10菌落进行分析(见分析转化，第 10页)。 3(4 分析转化子 3(4(1确认阳性克隆通过测序在阳性转化子中确认ds寡核苷酸插入的身份。分析每个CRISPR核酸结构来验证: ?该DS 寡核苷酸插入存在，并且在正确的方向?该ds寡核苷酸插入有正确的序列 注: 限制分析是推荐的，由于ds寡核苷酸插入的小尺寸。3(4(2 分析转化子1， 在含有 100 微克/毫升氨苄青霉素的 LB 培养基， 37?下挑选 5-10 个氨苄青霉素抗性菌落并培 养它们过夜 2，使用您选择的方法提取质粒 DNA。我们建议使用的 PureLink?HQ 迷你质粒纯化试剂盒。3，进行使用 U6 正向引物(与试剂盒提供)的 CRISPR 核酸结构的测序。4，制作所需的 CRISPR 核酸表达质粒的甘油库存(见长期储存) 。5，继续进行转染(第 11 页) 。3(4(3 测序指导如果一个特定的 CRISPR 核酸结构是很难顺序，遵循这些建议，以改进的结果: ?使用高品质， 纯化的质粒 DNA 进行测序。我们建议使用的 PureLink?HQ 迷你质粒纯化试剂盒 (货 号 K2100-01) 制备 DNA。?添加 DMSO， 测序反应， 以 5,的最终浓度。?增加模板的测序反应 (至 正常浓度的两倍)的使用量。?在你的测序反应使用的 dITP: 三磷酸的 7:1 摩尔比。3(4(4 长期储存一旦正确的CRISPR核酸构建体被识别，甘油库存用于长期存储。1，在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板在原始菌落上加上f 的条纹，孵育过夜在37?C 2，分离单个菌落，接种于1-2毫升含100μ g/ ，在37?C，直到培养物达到稳定期。4，混合mL的氨苄青霉素LB培养基中。3 0.85毫升培养与0.15毫升无菌甘油和转移到离心管。5，存放甘油于-80?3.5 哺乳动物细胞系转染 3.5(1 转染的方法转染质粒导入哺乳动物细胞系的方法包括磷酸钙 (Chen和Okayama， 1987;。Wigler等人， 1977) ， 脂质介导的技术(Felgner等人，1989; Felgner和Ringold，1989)，以及电穿孔(储等。对于范围广泛的哺乳动物细胞系的高效率转染，我们建议使用阳离子脂质为基础的脂质体?2017 试剂(货号11668-027)(Ciccarone等，1999)。，1987; Shigekawa和道尔，1988)。细胞系转染的最佳方法查阅相关文献或者供应商。要特别注意培养基的要求，何时传递细胞，以 及在什么稀释分裂细胞。 3.5(2 质粒制备的转染真核细胞质粒DNA必须是纯净，不受苯酚和氯化钠的污染。我们建议您使用高品质的maxi 准备的DNA用于转染。商店质粒DNA库存在-20?C。3.5(3转染指引以下一般原则，建议在一个标准的6孔板进行转染: ?用脂质体转染?2017进行转染与大多数细胞系。?在转染当天种子细胞达到70,的汇合。注: 结果将随与细胞类型接种密度而变化。?有3微克CRISPR/Cas9表达载体的转染执行。注意: 结果将依赖于细胞类型和传代数量，和脂质: DNA的最适浓度取得最佳效果是需要的。富集的种 群使用任何OFP或CD4报告转GENEART?CRISPR核酸载体的详细信息，请参阅附录B(第18页)。3.5(4 对照我们建议您包括阳性对照和阴性对照(模拟转染)在实验来评估你的的结果。3.5(5 故障排除观察的现象 选择性平板获得的氨苄青霉素 抗性菌落数少 原因 单链寡核苷酸设计不正确 解决方法 对于克隆到GENEART?CRISPR 核酸载体，确保每个单链寡核 苷酸3 末端包含5个核苷酸 ?顶部链寡核苷酸: 包括3 端 GTTTT。?底部链寡核苷酸: 包括3 端 CGGTG DS寡核苷酸降解 ?存放5 nM的DS寡核苷酸股票 在1X寡核苷酸退火缓冲液。?避免重复冷冻/解冻循环。分 装在5 nM的DS寡核苷酸库存并 储存于-20?C。寡核苷酸退火反应效率低 ?确保按照指示(第6页)进行 退火反应。? 25?C至27? C，在25?培养箱中孵育退火 反应。如果环境温度 4(附录 AGENEART?CRISPR核酸载体的图谱和特点4( 1GENEART? CRISPR 核酸载体下图显示了GENEART?CRISPR核酸载体的功能。该载体被提供线性化的核苷酸在7335和7356 (CD4) 或6732和6752(OFP)与每条链上所指示的5个碱基对的3 突出端。载体的完整序列是可以从我们 的网站()下载或联系技术支持(请参见第16页)GENEART?CRISPR核酸载体的特点GENEART?CRISPR核酸酶载体(9822 bp的CD4和9219 bp的OFP)包含以下元素。所有的特点进行了 功能性测试和载体的完全测序 特点 tracrRNA 复制的F1原点 pA TK CD4 优点 辅助反式激活crRNA允许载入Cas9核酸到gRNA 复制起点 聚腺苷酸化信号 基于富集的微珠报告基因，当用荧光标记的抗 CD4抗体(睫状体等人，1995)染色，可用于监 测转染效率 OFP 2A肽连接基于分选的流式细胞仪报告基因，荧光蛋白质 也可用于监测转染效率 一种自我裂解肽接头物，可以将CD4或OFP报道 基因连接到Cas9核酸酶的C-末端。紧接翻译， 2A肽侧翼的彼此分隔。CMV启动子 人U6启动子 U6正向引物位点 3 突出端 聚合酶III终止子 氨苄青霉素抗性基因 pUC的复制起点允许Cas9核酸酶和CD4或OFP报告基因的表达 允许RNA聚合酶? - 依赖的指导RNA(gRNA)的 表达 允许插入片段的测序 允许感兴趣的双链寡核苷酸的连接酶介导的定 向克隆 可有效终止的RNA聚合酶III-依赖的转录 允许在大肠杆菌中选择质粒 在大肠杆菌中允许高拷贝和维持 5.附录B GENEART?CRISPR核酸酶表达细胞富集5.1 介绍GENEART?CRISPR核酸载体转染的细胞 (与OFP或CD4记者) 的种群可以使用荧光激活细胞分选 (FACS) 富集，或者在CD4报告基因载体的情况下，采用Dynabeads?CD4磁珠。5.2 流式细胞仪富集请遵循以下准则，以富集转染有GENEART?CRISPR核酸酶(OFP记者)载体的细胞: ?收获活的转染的细胞， 为正在使用的细胞系重悬在FACS缓冲液。例如， 0.2微米的无菌过滤的FACS 缓冲液(1X PBS中含有1mM EDTA，25mM的HEPES，1,FBS)，可以很好地用于粘附细胞系，如HEK 293。?OFP有548 nm的峰值激发和560 nm发射。o一个488 nm激光被推荐用于高效率的激发。o标准530/30, 574/26 和 603/48 发射器被推荐用于检测。最优收集缓冲器，将取决于所选择的下游应用，但含2,FBS和FACS缓冲液(见上文)的RPMI培养 基都是可行的方案。 图1 由GENEART?CRISPR核酸OFP载体转染的细胞时由488激光激发， 并通过不同的检测器测得的Δ MFI(平均荧光强度) 请遵循以下准则，以丰富GENEART?CRISPR核酸酶(CD4报告)转染载体的细胞: ?收获活转染的细 胞，为正在使用的细胞系重悬在FACS缓冲液。?染色细胞与CD4抗体结合到你所选择的荧光团(根据制造商的说明)。?一旦染色，GENEART?CRISPR核酸酶(CD4报告)载体转染的细胞可以通过流式细胞仪(见上文) 富集。5.3 使用 CD4 磁珠富集GENEART?CRISPR核酸酶(CD4报告))载体转染的细胞可以用磁珠?CD4磁珠(货号11331D)富集。我们在使用本产品时，建议使用以下协议: 1，收获转染的活细胞和离心机在400×g离心5分钟。2，倒出上清，重悬在2ml缓冲液I(0.2微米无菌过滤的PBS，0.1,BSA，2 mM EDTA)中。3，离心机在400×g离心5分钟。4，与2毫升缓冲液I的洗两次 5，重悬细胞在缓冲液一适当的体积 6，继续执行―Prepare Dynabeads? CD4磁珠‖。5.4准备磁珠? CD4 磁珠1，重悬的Dynabeads?CD4磁珠的瓶内，用混合器使3分钟倾斜和管的旋转(例如HulaMixer?样品 混合器)。2，传输珠25μ L至无菌的 1.7毫升离心管中，并放置在磁性分离器进行1分钟。3，随着管仍然在磁铁，倒出上清液。4，重悬珠在缓冲一100μ L 5，将管子放在磁力分离器为1分钟，用小瓶静止的磁铁，倒出上清液。6，重悬珠在缓冲I的25μ L 7，进到―孵育细胞与磁 CD4磁珠‖(第20页)5.5 孵育细胞与磁珠? CD4 磁珠1:1珠细胞的比率是推荐 珠? (25珠?107μ L珠) ， 虽然这个数目可能需要根据应用程序进行优化。 1，添加收获细胞悬浮珠，并把为1毫升缓冲带一终体积 2 .孵育在4?下于一个混频器30分钟，以便让倾斜和管的旋转。3，将管在磁性分离器进行1分钟。4，随着管仍然在磁铁，倒出上清液。5，重悬细胞和珠与500μ L缓冲液?的 6，孵育在混合器2分钟。7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 重复步骤3-6，共5次。最后一次洗涤后，再悬浮在缓冲液?(0.2微米无菌过滤的RPMI，2,FBS)中加入100μ L细胞 加入10微升DETACHaBEAD?的CD4(提供11331D套件)。孵育混合机在室温下放置45分钟。放置在管上的磁性分离器进行1分钟。取上清液(含有CD4 +细胞)转移到一个新的试管。重悬珠在500μ L缓冲液II中。放置在管上的磁性分离，将上清液加到含有回收的CD4 +细胞的试管中。重复步骤13-14，共3次，以获得回收的CD4 +细胞的最大产率。把含有回收的CD4 +细胞的管的4毫升的最终体积。离心机在400×g下6分钟。富集重悬细胞在溶液适合您的下游应用(如染色溶液，流式细胞仪缓冲液，培养基)。和珠。 篇五: 连接酶链反应及其应用 .doc毕业设计 论文) 题报告书 ( 开课 题 名 称 学 生 姓 名 学 号连接酶链反应及其应用系、年级专业 指 导 教 师2017 年 12月10日 连接酶链反应(PCR)及其应用姓名: 系别: 班级: 学号: 摘要: 连接酶链反应(Ligase Chain R eation，LCR)是在连接酶扩 增反应或连接酶检测反应的基础上， 引入热稳定的连接酶而建立的类 似PCR 技术的新方法。LCR 既可扩增， 又可鉴定D N A 异常， 与PCR 技 术一样可用于已知病因的遗传病大面积普查。关键词: 连接酶链反应(LCR) ;PCR 技术; 淋病奈瑟菌; 淋球菌和 沙眼衣原体; 酶联免疫吸附试验 1 LC R 的建立与发展 近年来关于核酸的体外扩增和检测技术取得了很大进展。从M ul lis 于1 9 8 5 年发明聚合酶链反应(p o ly m e r a s e eh a in r e a e tio n , P CR ) 后,PC R 技术目前已被广泛用于基础医学、临床 医学、法医学和考古学等领域。随之也出现了一些新的和改进完善的 技术方法。1988 年Landegren 等率先采用寡核苷核酸连接酶分析方 法来适应准确的杂交条件和电泳的需要。当两个寡核苷酸探针与变性 D N A 杂交时，使其中第一探针3′端与第二探针5′端相邻;只要这 两个寡核苷酸有正确的互补关系或配对，D N A 连接酶就可以共价地 将两个寡核苷酸连接起来，繁殖。若两个寡核苷酸接头处与靶核苷酸 之间即使有一个碱基错配，也不能被连接和扩增。利用这种方法检测 β 球蛋白基因的点突变。后来，W u 和W allace(1989 年)以及 Barninger 等(1990 年)利用大致相同的方法获得相同结果，如果 在第一个探针上连接生物素， 在第二个寡核苷酸探针上有一个非同位 素报告基因，那么就利用这个反应自动地检出所获得的产物。1991 年，Barany 从Ecoli的耐热水生株H B8 D N A 的质粒文库筛选出一 个稳定的、依赖N A D + 的大肠杆菌连接酶克隆，以这个克隆的热稳 定连接酶代替寡核苷酸连接酶分析中的T4D N A 连接酶。由于在多次 热循环后连接‎‎酶仍然具有活性，因此反应体系象PCR 一样，能自动地 重复进行与扩增，使反应产物按指数增长，故而命名为连接酶链反应 (LCR) 。LCR 技术的正式推出虽然只有1 年多的时间，它与已知PCR 齐名，被并列提为遗传病D N A 诊断两大技术之一。2 LC R 基本原理 LCR ，即在D N A 连接酶的作用下，通过连接与模板D N A互补的两 个相邻寡核苷酸链，快速进行D N A 片段扩增。D N A连接酶可将与 模板D N A 链互补的两条毗邻寡核苷酸片段连接起来，两条寡核苷酸 链接头处存在碱基错配则阻止连接反应的发生。所以通过连接酶反 应，可明确区分寡聚核苷酸是否与模板D N A 完全互补，检测基因点 突变。耐热D N A 连接酶在不同温度组成的循环中活性保持不变。这 样，在适当的缓冲体系中加入模板D N A 。一套寡聚核苷酸片段，耐 热D N A 连接酶， 将上述反应体系加热， 使模板D N A 在高温下 (94 ?) 一分钟变性，解链;然后将反应体系降至退火温度(65 ?) 分钟 ，4 使模板寡聚核苷酸互补成双链;D N A 连接酶催化两相邻的寡核苷酸 连接起来。如下图: 如此循环改变温度，连接反应重复进行，使目的D N A 得到扩增。如 果两寡核苷酸接头处存在错配碱基，则没有扩增产物的产生，扩增产 物.可通过聚丙烯酰胺电泳加以鉴定。3 LC R 方法简述 3.1 待检测D N A 的获得从适当的组织标本中分离，提取染色体D N A ，煮沸5 分钟，备用。3.2 寡核苷酸片段的合成根据目的D N A 序列，利用D N A 合成仪合 成与之互补的寡核苷酸片段。3.3 32P 标记寡核苷酸片段利用T4 寡核苷酸激酶，将r-32P-A TP上 的r-32P标记到寡聚核苷酸A 1和B1的5′-O H 上。 3.4 在四个独立的LCR 反应体系中，加入两种同位素标记的寡聚A 1 和B1，模板D N A 和耐热D N A 连接酶。然后在各自体系中分别加入 A 2 和B 2、A 3 和B 3、A 4 和B 4、A 1 和A 5 和B5，使各种体系在94 ? 热浴一分钟，而后转入65 ?，孵育4 分钟。如此94?，65 ?循环改 变温度20~30 次。3.5 电泳和放射自显影终止反应后，将反应物进行10%聚丙烯酰胺变 性胶电泳，干胶后行自显影术，分析结果。LC R 识别点突变的特异性高于P CR。尽管PC R 是一种D N A 片段扩 增的极好方法, 但是检测片段中的点突变较为困难。一些基于PC R 技术的点突变分析法, 包括等位基因特异性PC R 和特异性等位基因 PC R 扩增, 针对每种特异性突变的条件都需要最优化, 因而使得这 些技术不适于一般应用。L CR 连接反应温度接近寡核昔酸融解温度 (T m ) , 识别单核昔酸错配底物的互补特异性极高。LC R 既可识别, 又可以扩增单碱基改变, 加之特殊标记的LC R 产物适用于一些非放 射性自动检测, 因而简便易行。但是与PC R 法比较起来,LC R 法尚 处于早期发展阶段, 仍需要进一步完善。如果能将两者结合起来, 利 用各自的优点, 研究者可能会获得最佳结果。4 LC R 应用前景 PCR 技术特异、敏感、操作简便、易于自动操作等，使之广泛应用于 生命科学、基因工程、疾病诊断、法医学，甚至考古学等各个领域。而LCR 反应中，选择特异的寡核苷酸片段为原料，严格控制解链，同 样可特异地进行目的D N A 片段地快速扩增;同时，通过区分寡核苷 酸与模板是否完全互补，检测出单个碱基的置换突变。对于已知基因 突变类型的疾病诊断是一个有效而切实可行的方法， 尤其适合大样本 普查与筛选。LCR 可用于以下几个方面的研究。4.1 扩增已知序列的D N A 片断。4.2 识别D N A 序列内的特异位点。4.3 通过对突变的检测，确定感染病毒亚型。4.4 联合PCR 技术，研究单基因遗传病的多态性，纠正过去的错误认 识。4.5 利用固定基质作支持物，分离特定的核酸片段。4.6 将PCR 所合成的D N A 片断按一定顺序连接起来。相信随着分子医学认识的深入和发展，LCR 将与PCR 协同作用，促进 遗传性疾病和某些感染性疾病(如病毒或支原体感染)的诊断，也为 分子生物学研究提供新技术。5 LCR应用实例 5.1连接酶链反应(LCR)技术检测男性尿标本的淋病奈瑟菌 淋病是我国重点防治的性传播疾病之一， 也是口岸检验检疫部门重点 监测的疾病，细胞培养法一直作淋病诊断的―金标准‖ 。但淋球菌 对外界生长条件苛刻，其敏感性多受标本采集、运送条件、所培养细 胞的敏感性及标本中抑制因子等因素影响， 再加上不少患者接受过抗 生素治疗，培养更加困难 J。LCR技术不须依赖标本中的活菌数，从 理论上讲只要有一基因拷贝就可以扩增出大量的目的DNA。LCR反应扩 增的目的基因为48bp的淋球菌染色体Opa一1基因片段， 经过40个反应 周期可使目的基‎‎因扩增10 以上 J。本文通过对流动人群和出入境人 群进行LCR检测，并与PCR方法比较，参照―扩大的金标准‖来确定检 测结果，初步得出其敏感性为100,，特异性为99(9,，与其它研究 报道结果基本一致卜 ，提示LCR是一种既敏感又特异的基因诊断方 法。LCR在流动人群和同期的出入境人群中的检出率为0(88, ，与 PCR方法相比二者无显著性差异。考虑到检测成本，可在高危人群中 使用LCR检测，而在一般人群中使用PCR筛检，LCR复检。另外调查发 现，淋病奈瑟菌检测S,CO~5(00的阳性者大多具有临床表现，临床 症状的轻重是否与LCR检测的S,(X)值相关，还需扩大阳性样本检测 量做进一步探讨。检测男性淋球菌感染的传统取材方法是尿道取材， 但插入拭子常给患者带来痛苦， 尤其是对无症状的受检人群来说更难 以接受，同时可导致插入时间过短而致标本采集量不足 。而LCR技术 只需采集受检者的首段尿液标本即可， 免去了以往采集分泌物时对患 者造成的损伤性，易于为受检者所接受。5.2连接酶链反应技术在淋球菌和沙眼衣原体检测中的应用 LCR 技术为淋球菌、 沙眼衣原体等性传播疾病病原体的实验室检测提 供了1 种突破性的方法。Gaydas 等报道4 ,以LCR 方法检测尿沉渣中 的沙眼衣原体, 敏感性和特异性分别为: 男性100 %、99. 6 %;女性 100 %、98. 5 % ,可见,LCR 检测技术具有高度的敏感性和特异性。Lee 等5 以LCR、 PCR、 酶免疫和培养等方法检测淋球菌和沙眼衣原体, 以LCR的检测敏感性最好, 特异性最高。Stary 等报道6 ,LCR 技术检 测淋球菌和沙眼衣原体的敏感性范围为93. 5 %,98 % , 特异性范围 为99. 5 %,100 %。LCx 及其配套试剂盒是得到美国FDA 批准的核酸 扩增检测技术,该技术是1 项既高度敏感又高度特异的实验室诊断方 法,适用于各种发病率人群的检测,同时,还可用于其他各种感染性疾 病病原体如乙肝病毒、支原体、结核杆菌等的快速测定,在诊断肿瘤 性、基因性疾病等方面也有一定的应用价值。5.3连接酶链反应一酶联免疫吸附试验诊断沙眼衣原体感染的初步应 用 在前期工作中，我们用电泳法检测扩增产物 。该方法虽然简便、经 济，但敏感性低且存在EB污染。此外也可以将。P标记的三磷酸脱氧 核苷酸掺入反应体系，对扩增产物行经凝胶电泳后放射自显影。此法 费时费力， 加上放射性废弃物的处理等问题而在实际工作中应用受到 限制。美国Abbott实验室的自动分析诊断试剂盒LCx，对扩增产物用 微粒酶免疫检测法(microparticle enzyme immunoassay， MEIA)测定。操作省时省力，总反应时间为2,4 h，一次可检测24份标本(包括6 份对照) j。全套设备昂贵，制约了LCR在我国的开展及随后大规模的 CT分子流行病学研究。本试验将ELISA方法结合非放射性标记法检测 Gap(LCR产物，即将Gap(LCR所使用的两对探针的5 和3 端标记后再 参与Gap—LCR扩增反应， 从而得到3 和5 端同时带有生物素和地高辛 的扩增产物，扩增后产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获。被捕获 在微孔板上的扩增产物5 端的地高辛可以被加人的抗地高辛抗体结 合后，通过抗体上偶联的过氧化物酶(POD)和相应的底物ABTs结合显 色，并通过自动酶标仪读取结果。此法无须更改LCR扩增步骤，只需 换用标记引物，扩增后进行标准的ELISA检测法，具有易操作，稳定 性好的优点，使用微孔板，一次可分析96个样品，整个过程可在3 h 内完成，便于临床常规应用和流行病学研究中样本筛选。仪器读取结 果客观，判断结果客观，有助于实现检测的自动化，为临床诊断CT 感染提供了一个很好的试验方法。7. 展望 LC R 技术从出现至今, 已受到越来越多的研究者的注意并将其应用 到自身的研究领域除了以上的不完全列举之外, 利用LC R 法可以作 大量人群中单碱基遗传病多态性的快速筛选和单碱基遗传病的产前 诊断; 微生物亚种和亚型的鉴别;多态性的分析; 法医学中个体D N A 的准确鉴定; 随着癌基因研究的进一步发展,LC R 可能对某些肿瘤 作出基因诊断, 如已清楚的结肠癌r a s 基因的单碱基改变; 对于一 些已搞清其D N A 序列的细菌和病毒等, 均可借助于L C R 进行病原 体诊断[l. ?〕。由于L C R 设计独特, 在某些方面的优势(如检测 点突变) 目前尚不能为其它手段所取代, 且LC R 尚在不断完善和改 进之中, 故其作为一种有效的D N A 扩增和检测技术具有很大的发展 前景。参考文献: 1.Landergen,ct al.LCR,一种新的抗原检测系统国外医学。分子生物 学分册，1990， : 17,212 (1) 2.Barrnger,LCR;every sensitive antigendetecion by means of soecific antibody-DNA conjugates. 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