作者姓名：王新
作者姓名:王新
专业名称:预防兽医学
指导教师:郭万柱
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题目:猪2型圆环病毒、猪细小病毒核酸疫苗及猪2型圆环-猪细小-伪狂犬
病三价基因工程疫苗研究
作者简介:王新，男，1975年12月生，四川.邛崃人。1997年9月至2001年7月在四川农业大学动物科技学院兽医专业学习，获农学学士学位;2001年9月至2004年7月在四川农业大学动物科技学院攻读预防兽医学硕士学位;2004年7月至今，在四川农业大学动物科技学院攻读预防兽医学博士学位。读博学习期间，在《中国兽医学报》等杂志上发表论文10篇，其中第一作者发表论文3篇;主研课题3项;博士论文的创新点利用四川株PCV2和PPV为材料研制出PCV2核酸疫苗和PPV核酸疫苗;利用PRV SA215为病毒活载体研制出PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗。
摘 要
猪圆环病毒病、猪细小病毒病与伪狂犬病是危害全球养猪业的三种重要传染病，分别由猪圆环病毒2型(porcine Circovius Type 2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)和伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)引起。目前这三种传染病在猪场并发或继发感染现象较为普遍，给养猪业造成了巨大的经济损失，因此，为了预防和控制这些疾病，安全、高效的疫苗是首要的解决途径。
伪狂犬病毒是一个重要的活病毒载体，具有不感染人、基因组容量大、重组病毒遗传稳定等特点，外源基因可稳定地插入其DNA。因此以伪狂犬病毒基因缺失株为表达载体，将其它病原的保护性抗原基因插入到PRV基因缺失疫苗株中，构建二价或多价基因工程疫苗，可以起到对多种疾病的预防作用。本文分别对PCV2和PPV核酸疫苗及PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗进行了研究，其主要研究内容如下:
1. PCV2和PPV核酸疫苗研究
将成功构建的pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2采用脂质体法转染IBRS-2细胞，经Western blotting 检测， 结果显示pcDNA-ORF2 和pcDNA-VP2质粒转染的IBRS-2细胞分别在29 kD和64kD处出现特异性反应带;而同步转染的pcDNA3.1(+)对照却未出现特异性带，从而表明重组的核酸质粒pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2构建成功，并在哺乳动物细胞中获得表达。
将猪圆环病毒2型ORF2基因疫苗和猪细小病毒VP2基因疫苗分别肌注免疫Balb/c小鼠两次，于首免后第14天和第56天采血，作间接ELISA抗体检测试验;检测结果显示重组的核酸疫苗都能诱导小鼠机体分别产生抗PCV和抗PPV 特异性抗体。于首免后第56天，采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)，和流式细胞仪(FACS)法对小鼠的细胞免疫进行检测。淋巴
细胞增殖试验(MTT法)结果显示构建的pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫组小鼠的脾淋巴细胞经刀豆素A(ConA)刺激后，其淋巴细胞转化率(刺激指数)分别为1.57和1.68，明显高于PBS空白对照组(刺激指数为1)和pcDNA-3.1(+)组(刺激指数为1.04)，但是低于PPV活疫苗组(刺激指数为1.76)和PCV2活疫苗组(刺激指数为1.69);而T细胞亚类数量的
+检测结果显示pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫的各试验组小鼠的外周血T淋巴细胞亚类CD8
+的数量显著增加，而CD4的数量却减少。这些结果表明pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗均能诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。
提取小鼠各组织器官染色体基因组进行PCR扩增，结果显示未能从免疫小鼠各组织的基因组扩增出ORF2基因和VP2基因片段，表明ORF2和VP2基因未整合到小鼠染色体上，说明 pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗是安全的。
2. 重组伪狂犬病病毒SA215 (D)的构建及其部分生物学特性的研究
将含有PCV2的ORF2基因和PPV的VP2基因的转移质粒pPI-2.EGFP.ORF2.VP2与PRV 基因缺失株SA215基因组共转染ST细胞，通过同源重组，构建了融合表达PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重组伪狂犬病毒株,命名为SA215(D)。经荧光检测和PCR、Southern 转印杂交鉴定和Western免疫印迹检测表结果表明SA215(D)构建成功。此外，SA215(D)株在Vero、IBRS-2、ST和CEF细胞中的增殖滴度与亲本株SA215相比无显著差异，表明外源基因的插入不影响病毒增殖。将PRV基因缺失株和获得的重组病毒SA215 (D)的ST细胞培养物进行扫描电镜观察，均能观察到PRV典型的病毒粒子存在,两者形态上无大的差异，表明外源基因的插入不影响病毒的形态。另外，重组病毒SA215 (D)在Vero细胞上连续传7代后，结果均能扩增到ORF2基因和VP2基因片段，表明 ORF2基因和VP2基因片段己被稳定地插入到重组伪狂犬病毒SA215(D)基因组中。
将PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗接种小鼠，并对该工程疫苗的免疫原性和安全性进行研究。小鼠安全性试验显示将重组重组伪狂犬病毒SA215(D)株，PRV SA215株和野毒Fa
45株分别以10和10PFU剂量接种小鼠，结果接种Fa株小鼠全部死亡，而接种SA215(D)和SA215株的小鼠全部存活;另外，将这三组免疫小鼠的组织器官进行病理切片观察，结果接种Fa株小鼠的组织病变比SA215(D)和SA215株的严重，而接种SA215(D)和SA215株小鼠的组织病变比较接近。这些结果表明SA215(D)株的毒力显著低于野毒株，而与亲本株SA215相近，初步验证了该重组病毒的安全性。
将PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗加强免疫小鼠后，作间接ELISA抗体检测试验，结果显示SA215(D)能诱导小鼠产生较高的抗PRV，PCV2和PPV的抗体水平，其中抗PRV中和抗体与其亲本株SA215抗体水平相当，能完全抵抗致死剂量PRV强毒的攻击，具有与亲本株疫苗相当的免疫保护效果;淋巴细胞增殖试验(MTT法)结果显示SA215(D)能诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖;而T细胞亚类数量的检测结果显示SA215(D)免疫小鼠能有效提高T细胞数量，增强小鼠的免疫水平。这些结果表明重组伪狂犬病毒SA215(D)制成的PCV2-PPV-PRV
三价基因工程疫苗能成功诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。重组病毒对PRV Fa株在体内定植特性研究显示免疫重组病毒SA215(D)可以抵御PRV Fa株在小鼠中的定植。以上结果表明重组病毒SA215(D)可以作为预防猪2型圆环病毒、猪细小病毒和伪狂犬病的三价基因工程疫苗候选株。
关键词:猪圆环病毒2型;猪细小病毒;伪狂犬病病毒; ORF2基因;VP2基因;核酸疫苗;三价基因工程疫苗;重组病毒;免疫原性
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