种子的扩大培养

第六章种子扩大培养生物工艺学第一节种子扩大培养的目的与要求第二节种子制备实例第三节种子制备的技术概要第六章种子的扩大培养第一节种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念:种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子扩大培养的目的与要求种子扩培的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。生理状况稳定，个体与群体。活力强，移种至发酵后能够迅速生长，迟缓期短。无杂菌污染。保持稳定的生产能力。一、谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵第二节种子制备过程举例1、斜面培养培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5琼脂2%，pH7.0～7.2。培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18～24h。生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次。2.一级种子（摇瓶）培养条件：于1000mL三角瓶中，装液200～250mL，32℃培养12h。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5％K2HPO40.1%。培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基。培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32℃培养7～10h。培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%。培养基的特点：菌体生长，更接近于发酵培养基。3、二级种子（种子罐）108～109cfu/mL。（菌数）大小均匀，呈单个或八字排列。（菌体）pH7.0～7.2时结束。（性能）活力旺盛。（活力）种子的质量要求：二、青霉素生产的种子制备制备过程：安瓿管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等。培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细。培养条件：25℃、7d，注意湿度50%左右。1、斜面孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）。培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：25℃、7d，控制湿度。大米孢子的要求：1粒米含1.4×106个孢子。2、大米孢子3、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆。目的：菌体生长。培养条件：27℃，40h。接种量：200亿孢子/t。4、二级种子培养基：同上培养条件：27℃、10~14h。接种量：10%。种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于Ⅲ～Ⅳ期。青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1～4为年青期，4～6期合成青霉素的能力最强。第三节种子制备的技术概要一、种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。二、实验室阶段1、培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽孢的微生物——获得一定数量和质量的菌体。对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。获得一定数量和质量的孢子。菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的菌丝体。便于操作，但需要更仔细的控制。培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。2、培养基选择的原则细菌保藏斜面→活化斜面产孢子保藏→母斜面→子斜面原则：使菌种的传代次数尽可能的少。3、起始接种物的传代问题三、生产车间阶段1、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。缩短发酵时间有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：2、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富在原料方面不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本；二是驯化。以蔗糖为原料成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%琼脂2%例：柠檬酸发酵薯干粉成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁薯干粉10％22-28％(NH4)2SO40.5％琼脂2％谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）→二级种子（小罐）→发酵青霉素：三级发酵一级种子（小罐）→二级种子（中罐）→发酵一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。3、发酵级数的确定发酵级数确定的依据级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2～4级。在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。4、接种量的确定移入种子的体积接种量＝—————————接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7～15%。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响杨博，中国油脂，2002Υ亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理功能。Υ亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵Υ亚麻酸时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体本研究发现，采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和Υ亚麻酸产量。不同接种量影响菌体的生长和发酵青霉素发酵罐生产工艺的改进表1种罐种子液的接种量试验结果（发酵指数以接种量10％为对照）100102.1102.1102.5101.442363230281015202530发酵指数到达40％菌浓度的发酵周期（h）接种量（％，v/v）发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高，发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率。表2种源对发酵提炼生产的影响（以种罐种子液的生产指标作对照）100103.110097.1100106.2种罐种子液发酵罐前期发酵液发酵提炼的生产指数提炼收率（％）发酵指数种源20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好表3两种种源混合接种时的试验结果（以接种量为20％的种罐种子液的生产指标作对照）106.298.7104.8106.299.3105.5106.798.1104.7105.198.3103.3105.497.1102.3102.997.4100.2发酵指数提炼收率（％）发酵提炼的生产指数352015302010301515251510251015201010总接种量（％）种罐接种量（％）发酵罐接种量（％）种龄：是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。5、种龄镜检：24h，多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期30h开始出现芽孢。表4菌龄对产酶的影响62.3766.1274.5552.107256486012182430酶活力（U/mL）发酵时间（h）菌龄（h）量：要求达到一定的浓度。质:菌丝形态、培养液外观（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：C、N、P的含量，pH值，酶活等。无污染（无杂菌）6、种子的质量要求7、影响种子质量的因素原材料质量培养条件温度湿度通气量斜面冷藏时间