PCR反应体系与反应条件
标准
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的PCR反应体系：10X扩增缓冲液10ul各200umol/L种dNTP混合物引物各10?100pmol0.1?模板DNA2ug2.5uTaqDNA聚合酶1.5mmol/LMg2+加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1?lumol或10?100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因
工程
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酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0?7.5，小量分装，-20C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50?200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化
方法
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通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNAMg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5?2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90?95C变性，再迅速冷却至40?60C,引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70?75C,在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100?300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94C变性，65C左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93C?94Clmin足以使模板DNA变性，若低于93C则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至CC,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引40?60物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C物，55C为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以含量约50%的引下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）在Tm结合，提高复性温度=Tm值-（5?10C）值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性PCR反应的特异性。复性时间一般为30?60sec，足以使引物与模板之间完全结合。③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：70?80C150核苷酸/S/酶分子C60核苷酸/S/酶分子C24核苷酸/S/酶分子高于90°C时，DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70?75C之间，常用温度为72C,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3?4kb的靶序列需3?4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30?40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
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