肉毒梭菌及肉毒毒素检验1

肉毒梭菌在自然界分布很广，由于生态上的差异出现区域性的差异。以A、B两型分布最广，它的芽胞分布于土壤、沼泽、湖泊、河川和海底，各大洲都能检查出它们的芽胞；而C、D两型则主要存在于动物的尸体内或在腐尸周围的土壤里面；E型菌及其芽胞主要存在于海洋的沉积物、海鱼、海虾及海栖哺乳动物的肠道内；F型曾在动物肝脏引起食物中毒时分离到。引起人食物中毒的主要是A、B、E三型。C、D两型主要是畜、禽肉毒中毒的病原。肉毒梭菌及肉毒毒素检验肉毒梭菌食物中毒与肉毒梭菌及芽胞无直接关系，是肉毒素进入血循环后，选择性的作用于运动神经与副交感神经，主要作用点是为神经末梢，抑制神经传导介质乙酰胆碱的释放，因而引起肌肉运动障碍，发生软瘫。（一）形态及染色肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，是革兰氏阳性粗大杆菌，其大小为（4-6）µm×（0.9-1.2）µm，两端钝圆，一般单个存在，偶有成对或成短链状，无荚膜。周身有4~8根周毛，能运动。芽胞呈卵圆形，大于菌体，位于菌体次末端，使细菌呈匙形或网球拍状。在老龄培养物上呈革兰氏阴性。（二）生长要求和培养特性肉毒梭菌为专性厌氧菌，可在普通培养基上生长。28℃-37℃生长良好，但本菌产生毒素的最适生长温度为25℃-30℃，最适pH为6-8（细菌在8℃以上，pH4以上都可形成毒素），在10％食盐溶液中不生长。在固体培养基上，形成不规则直径约3mm圆形菌落，菌落半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界限不明显，有向外扩散的现象，常扩展成菌苔。在葡萄糖鲜血琼脂平板上，菌落较小、扁平、颗粒状、中央低隆、边缘不规则、带丝状或绒毛状菌落。开始较小，37℃培养3d-4d，可达5mm-10mm，通常不易获得良好的菌落，因易于汇合在一起，有的菌落有大的β—溶血环。在卵黄琼脂生长后，菌落及其周围培养基表面覆盖着特有的彩虹样（或珍珠层样）薄层，但G型没有。在含有肉渣的液体或半流动培养基中，肉毒梭菌生长旺盛而且产大量气体。A、B、F三型表面浑浊，底有粉状或颗粒状沉淀，并能消化肉块，变黑有臭味。而C、D、E三型则表现清亮，絮片状生长，粘贴于管壁。（三）毒素及其类型根据肉毒梭菌能产毒素的抗原特异性可分为A、B、C、D、E、F、G七型，其中C型又分为Cα型和Cβ型。各型毒素，只为其相应的抗毒素所中和（即A型毒素只为A型抗毒素所中和，等等），但Cβ型毒素既可为Cβ型抗毒素又可为Cβ型抗毒素中和。根据肉毒梭菌的生化反应亦可分为两型：一种能水解凝固蛋白的称为解蛋白菌；另一种不能水解凝固蛋白，称为非解蛋白菌。前者能产生A、B、C、D、E、F、G型毒素，后者能产生B、C、D、E、F型毒素。 型别 毒素的来源 主要的易感动物 所致的疾病 抗毒素 A 发酵食品、罐头食品 人、鸡、牛、马、水貂 人食物中毒，鸡软颈病，牛，马水貂中毒 特异性 B 发酵食品、肉制品 人、牛、马、水貂、鸡 人食物中毒，牛，马水貂中毒，鸡软颈病 特异性 Cα 灰绿蝇、蛆、池沼腐烂植物 水禽 禽类软颈病 可中和Cα和Cβ毒素 Cβ 含毒素饲料、腐尸 牛、羊、马、水貂 牛、羊、马、水貂中毒 可中和Cα和Cβ毒素 D 腐肉 牛 非洲牛跛病 特异性 E 生鱼、海生哺乳动物 人 食物中毒 特异性 F 发酵食品、肉品 人 食物中毒 特异性 G — — 食物中毒 特异性（四）生化特性肉毒梭菌能分解葡萄糖、麦芽糖及果糖，产酸产气，对其他糖的分解作用因菌株不同而异。能液化明胶，但菌株间有液化能力的差异。缓慢液化凝固血清37℃15d，使牛乳消化，产生H2S，但不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐。（五）抵抗力肉毒梭菌毒素为一种蛋白质，相对分子质量1500000，通常以毒素分子和一种血细胞凝集素载体（相对分子质量为500000）所构成的复合物形式存在，不被胃液或消化酶所破坏，在pH3-6范围内毒性不减弱，但在pH8.5以上或100℃l0min-20min常被破坏。毒素在干燥密封和阴暗的条件下，可保存多年。毒素用甲醛处理后即变为类毒素。毒素及类毒素均有抗原性，注射于动物体内能产生抗毒素。肉毒梭菌加热至80℃30min或100℃10min即可杀死，但其芽胞抵抗力强，煮沸要6h、105℃2h、110℃36min、120℃4min-5min才能将其杀死。肉毒梭菌所有菌株在45℃以上都受到抑制。（六）致病性肉毒梭菌致病的物质基础，是它产生的强烈外毒素——肉毒素，是目前所知的最强烈的细菌外毒素。提纯的外毒素1mg含有三亿个小白鼠的半数致病量，毒素作用于神经系统，引起运动神经麻痹而致病。引起人类食物中毒的主要为A、B、E三型（见表6—30所致疾病一栏），F型亦可引起人类的毒血症，E型肉毒素，可被胰酶激活而毒力增强。人工感染细菌全培养物、细菌的滤液、含毒素的送检材料，均可使小白鼠或脉鼠发病死亡，兔、猫、犬的易感性较低。七）肉毒中毒1、流行病学肉毒梭菌食物中毒又叫做肉毒中毒，是由于人们因误食了被肉毒梭菌污染，并在其中繁殖过程中所产生的外毒素所致。引起肉毒中毒的食品，因饮食习惯和膳食结构不同而有差别。日本发生的肉毒素主要由鱼类、鱼卵等水产品所引起。其中家庭自制食品引起者占93％，市售食品引起者占5.4％。美国发生的肉毒中毒主要由家庭自制的蔬菜、水果罐头、水产品和肉、奶类制品所引起。其中家庭自制食品占72％，市售商品引起者占9.0％。我国发生的肉毒中毒，91.48％由植物性食品所引起，8.52％由动物性食品所引起。在植物性食品中，绝大部分是家庭自制的发酵食品，例如臭豆腐、豆豉、豆酱和制造面酱的一种中间产物，即“米送糊糊”等。这些发酵食品所用的原料粮和豆类常带有肉毒梭菌，发酵过程往往在密闭容器中和高温环境下进行。由于加热时间短，未能杀灭肉毒梭菌芽胞，又在20℃-30℃进行发酵，所以为芽胞生长繁殖并产生毒素提供了适宜条件，如食品不经加热，即可引起中毒。肉类及其制品等动物性食品，在贮存过程中如被肉毒梭菌所污染，在较高室温下数日，肉毒梭菌即可繁殖并产生毒素，带有毒素的食品如食前未经加热或加热不彻底，即引起中毒。2、临床症状肉毒中毒的潜伏期短者仅2h，长者可达10d左右．通常约12h-18h，其特点是潜伏期愈短，死亡率也就愈高，说明其毒素含量高、毒力强。本病的症状比较严重，主要为神经出现麻痹，患者眼睑下垂，出现复视，继而为运动困难，不能抬头，头多倒向一侧或向前，肌肉无力，吞咽和语言都困难，口腔分泌物多，但无法咽下，因此渴感增加，瞳孔放大，对光反射迟钝，还可见有斜视，一般神志仍清楚，后期还发生呼吸困难。患者一般无明显体温变化或稍低于正常，胃肠道无明显症状，但也有少数病例，在发病的初期出现胃肠炎，而后出现典型的神经症状。病程约2d-3d，有些病例可持续2周-3周。不少患者在病的后期，可能出现便秘和鼓肠，死亡率可达30％-60％以上。死亡的原因主要是呼吸困难（麻痹）所致，直到死前神智仍清楚，保持知觉，患者有恐惧感。肉毒中毒愈后一般无后遗症，但某些症状消失缓慢，最终可以恢复正常。也有极别的病例，可能在较长的时期内一直存在某肢体不完全瘫痪的情况。3、预防和治疗（1）预防肉毒中毒的发生，一般有以下几种情况：即制作食品的原料中带有肉毒梭菌芽胞，在食品加工过程中，芽胞未被全部杀灭，在食品加工或贮存过程中，温度较高，缺氧，适宜芽胞的繁殖和产毒；熟食品在食用前未经充分加热使毒素完全破坏。因此，为预防本病的发生可采取下列措施：①食品制造前应对食品原料进行清洁处理，除去泥土和粪便，用优质饮用水充分清洗。特别在肉毒中毒多发地区，土壤及动物粪便的带菌率较高，故要求更应严格。②罐头食品的生产，除建立严密合理的工艺规程和卫生 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 防止污染外，并应严格执行灭菌的操作规程。罐头在贮藏过程发生胖听或破裂时，不能食用。制作发酵食品时，在进行发酵前对粮、谷、豆类等原料应进行彻底蒸煮，以杀灭肉毒梭菌芽胞。③加工后的肉、鱼类制品，应避免再污染和在较高温度下堆放，或在缺氧条件下保存。盐腌或熏制肉类或鱼类时，原料应新鲜并清洗；加工后，食用前不再经加热处理的食品，更应认真防止污染和彻底冷却。④肉毒梭菌毒素不耐热，加热80℃经30min或100℃经30min可使各型毒素破坏，故对可疑食品进行彻底加热是破坏毒素预防肉毒中毒的可靠措施。⑤防止婴儿肉毒中毒，应首先避免不洁之物进入口内。凡能进入婴儿口中的东西（如手指、乳头、玩具等）要注意清洁，以免经口感染。对婴儿的补充食品如水果、蔬菜等应去皮或洗净消毒，不可食用变质的剩奶或蜂蜜。（2）治疗①抗毒素治疗多价肉毒抗毒血清对本病有特效，必须及早给予。在发病后24h内或瘫痪现象发生前注入最为有效，静脉或肌肉注入（5-10）万IU一次，必要时6h后重复给予同量。②支持及对症治疗发病早期确诊为肉毒中毒或疑为本病时，应立即用水或高锰酸钾（1：4000）洗胃并灌肠。病入应安静休息，注意保暖。咽喉部有分泌物积聚时用吸引器吸出。呼吸困难者给氧，必要时进行人工呼吸。吞咽困难者用鼻饲或静脉滴注葡萄糖盐水，发生肺炎等继发感染时给与适宜的抗菌药物。伤口染菌所致的肉毒中毒患者必须彻底清创，并给予抗毒血清。国外资料表明，盐酸胍有促进末梢神经纤维释放乙酰胆碱的作用，故可以治疗肉毒中毒，约有半数可获助益，但对严重的呼吸衰竭者无效。（八）检验程序 GB/T4789.12-20035.检验程序第六章其他微生物指标测定第一节食品中酵母和霉菌菌数测定霉菌和酵母菌广布于外界环境中，它们在食品上可以作为正常菌相的一部分，或者作为空气传播性污染物，在消毒不适当的设备上也可被发现。各类食品和粮食由于遭受霉菌和酵母菌的侵染，常常发生霉坏变质，有些霉菌的有毒代谢产物引起各种急性和慢性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性。实践 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ，一次大量食入或长期少量食入，能诱发癌症。目前，已知的产毒霉菌如青霉、曲霉和镰刀菌在自然界分布较广，对食品的侵染机会也较多，因此，对食品加强霉菌的检验，在食品卫生学上具有重要的意义。酵母菌和霉菌能通过下列方式而引起问题：①合成毒性代谢产物；②能抵抗热、冰冻、抗菌素或射线照射；③酵母菌和霉菌能够转换其他对细菌不利的物质，而促进细菌的生长。它们能够利用果胶和其他碳水化合物、有机酸、蛋白质和脂类这样一些化合物，使食物表面失去色、香、昧。一般不认为酵母菌是蛋白质分解性的微生物，近年来的研究指出，有一些酵母菌能分解广谱蛋白质物质。一、原理霉菌和酵母菌菌数的测定是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数（粮食样品是指1g粮食表面的霉菌总数）。霉菌和酵母菌数主要作为判定食品被霉菌和酵母菌污染程度的标志，以便对食品的卫生状况进行评价。二、检验程序 GB4789.15-2010霉菌和酵母计数􂠽􁄺􁺔􅁠􀀃􄳝􃦠􀩠􄝉􂆡􄅵􁭄5.2培养待琼脂凝固后，将平板倒置，20摄氏度培养5天，观察并记录。常见产毒霉菌的鉴定第二节罐头食品商业无菌检验罐藏食品因保质期长、营养丰富、安全性高而倍受消费者喜爱。罐藏食品是将食品原料经过预处理，装入容器，经杀菌，密封之后制成的，通常称之为罐头。罐头密封是为了防止外界微生物侵入，而加热杀菌是要杀死存在于罐内的致病菌、产毒菌和腐败菌。合格的罐头，因罐内保持一定的真空度，罐盖和罐底是平的或向内凹陷。按其pH的不同可分为低酸性罐头、中酸性罐头、酸性罐头和高酸性罐头。以动物性食品原料为主要成分的罐头属低酸性，它们富含有大量的蛋白质。以植物性食品原料(水果、蔬菜)为主要成分的罐头属中酸性或高酸性，主要富含碳水化合物等。一、罐藏饰品的常用专业术语罐头食品的商业无菌：罐头食品经过适度的杀菌后，不含有致病微生物，也不含有通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物的状态。密封：食品容器经密闭后能阻止微生物进入的状态。胖听：由于罐头内微生物活动或者化学作用产生气体，形成正压，使一端或两端外凸的现象。泄漏：罐头密封结构有缺陷，或由于撞击而破坏，或罐壁腐蚀而穿孔致使微生物入侵的现象。低酸性罐头食品：除酒精之外，凡杀菌后平衡pH大于4.6，水活性值大于0.85的罐头。酸性罐头食品：杀菌后平衡pH等于或小于4.6的罐头食品。二、罐头腐败变质的原因罐头腐败变质的原因有化学因素，如中酸性罐头容器的马口铁与内容物相作用引起的氢膨胀；物理因素，如贮存温度过高，排气不良，金属容器腐蚀穿孔等；更主要的引起腐败的原因是罐内污染了微生物而导致腐败变质。这些微生物的污染来源有两种情况：(一)杀菌后罐内残菌有微生物罐头杀菌要考虑罐内食品的营养性质，因为商业灭菌只强调杀死病原菌、产毒菌，并没有达到完全无菌的状态。罐内可能有一些非致病的微生物存在，这些微生物在罐内的特殊环境下，一定的保存期限内，一般不会生长繁殖，但是如果罐内条件有变化，这部分微生物就会生长繁殖而导致罐头的腐败变质。经高压蒸汽杀菌后的罐头内残留的微生物大多是耐热性的芽胞细菌。(二)杀菌后发生漏罐由于罐头密封性能不好，杀菌后发生漏罐而造成微生物污染。通过漏罐而造成污染的主要污染源是冷却水。罐头在热处理后要通过冷却水进行冷却，冷却水中的微生物就有可能通过漏罐处进入罐内。空气也是造成漏罐污染的污染源，但不占主要地位。通过漏罐处污染的微生物种类很多，包括耐热菌和其他各类细菌。二、罐藏食品腐败的类型罐头由于微生物作用而造成的腐败变质，可分为嗜热芽胞细菌、中温芽胞细菌、不产芽胞细菌、酵母菌、霉菌等引起的腐败变质。(一)嗜热芽胞细菌引起的腐败变质发生这类变质大多数是由于杀菌温度不够而造成的。通常发生三种类型的腐败变质现象。1、平酸腐败平酸腐败也叫平盖酸败。变质的罐头外观正常，内容物却在细菌活动之下变质，呈轻重不同的酸味，pH值可下降0.1-0.3。导致平酸腐败的微生物习惯上称平酸菌，大多数是兼性厌氧菌。例如嗜热脂肪芽胞杆菌，该菌耐热性很强，能在49℃-55℃温度中生长，最高生长温度在65℃，一般pH6.8-7.2的条件下生长良好，当pH值接近5时不能生长，因此，这种菌只能在pH5以上的罐头中生长；另一类细菌是凝结芽胞杆菌，它是肉类和蔬菜罐头腐败变质的常见菌，它的最高生长温度是54℃-60℃，该菌的突出特点是能在pH4.0或酸性更低的介质中生长，所以又称为嗜热酸芽胞杆菌，在酸性罐头，如番茄汁或番茄酱罐头腐败变质时常见此菌。平酸腐败无法通过不开罐检查发现，必须通过开罐检查或细菌分离培养才能确定。平酸菌在自然界分布很广，糖、面粉、香辛料等辅料常常是平酸菌的污染来源。平酸菌中除有专性嗜热菌外，还有兼性嗜热菌和中温菌。2、TA菌腐败TA菌是不产硫化氢的嗜热厌氧菌的缩写。TA菌是一类能分解糖，专性嗜热，产芽胞的厌氧菌，它们在中酸或低酸罐头中生长繁殖后，产生酸和气体，气体主要有二氧化碳和氢气。如果这种罐头在高温中放置时间太长，气体积累较多，就会使罐头膨胀最后引起破裂。变质的罐头通常有酸味。这类菌中常见的有嗜热解糖梭状芽胞杆菌，它的适宜生长温度是55℃，温度低于32℃时生长缓慢。由于TA菌在琼脂培养基上不易生成菌落，所以通常只采用液体培养法来检查它，例如用肝、玉米、麦芽汁、肝块肉场或乙醇盐酸肉汤等液体培养基，培养温度采用55℃，检查产气和产酸的情况。3.硫化物腐败腐败的罐头内产生大量黑色的硫化物，沉积于罐内壁和食品上，致使罐内食品变黑并产生臭味，罐头的外观一般保持正常，或出现隐胀和轻胀，敲击时有浊音。引起这种腐败变质的菌是致黑梭状芽胞杆菌，此菌属厌氧性嗜热芽胞杆菌，生长温度在35℃-70℃之间，最适宜生长温度是55℃，耐热力较前面几种菌弱，分解糖的能力也较弱，但能较快地分解硫含的氨基酸而产生硫化氢气体。此菌如在豆类罐头中生长，由于形成硫化氢，开罐时会散发出一种强烈的臭鸡蛋味；在玉米、谷类罐头中生长会产生蓝色的液体；在鱼类罐头中也常发现。该菌的检查可以通过硫酸亚铁培养基55℃保温培养来检查，如形成黑斑即证实有此菌存在。罐头污染该菌一般是原料被粪肥污水污染，再加上杀菌不彻底造成的。(二)中温芽胞细菌引起的腐败变质中温芽胞细菌最适宜的生长温度是37℃，包括需氧芽胞细菌和厌氧芽胞细菌两大类型。1、中温需氧芽胞细菌引起的腐败变质这类菌耐热性较差，许多细菌的芽胞在100℃或更低一些的温度下，短时间就能被杀死，少数种类的芽胞耐过高压蒸汽处理而存活下来。常见的引起罐头腐败变质的中温芽胞细菌有：枯草芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌等，它们能分解蛋白质和糖类，分解产物主要有酸及其他一些物质，一般不产生气体，少数菌种也产生气体，如多粘芽胞杆菌、浸麻芽胞杆菌等分解糖时除产酸外还有产气，所以前一类群的中温芽胞杆菌引起平酸腐败，而后一类群的中温芽胞杆菌引起平酸腐败变质时有气体产生。2、中温厌氧梭状芽胞细菌引起的腐败变质这类细菌属厌氧菌，最适宜生长温度为37℃，但许多种类在20℃或更低一些的温度都能生长；还有少量菌种能在50℃或更高的温度中生长。这类菌中有分解糖类的丁酸梭菌和巴氏固氯梭状芽胞杆菌，可在酸性或中性罐头内发酵丁酸，产生氢气和二氧化碳，造成罐头膨胀变质。还有一些能分解蛋白质的菌种，如魏氏梭菌、生芽胞梭菌及肉毒梭菌等，这些菌主要造成肉类、鱼类罐头的腐败变质，分解其中的蛋白质产生硫化氢、硫酸、氨、吲哚、粪臭素等恶臭物质井伴有膨胀现象。此外往往还产生毒性较强的外毒素，细菌产毒以后释放到介质中来，使整个罐内充满毒素，可造成严重的食物中毒。据目前的研究证明，肉毒梭菌所产生的外毒素是生物毒素中最强的一种，该菌也是引起食物中毒病原菌中耐热力最强的菌种之一，所以罐头食品杀菌时，常以此菌作为杀菌是否彻底的指示细菌。(三)不产芽胞细菌引起的腐败变质不产芽胞细菌的耐热性不及产芽胞的细菌。如罐头中发现不产芽胞细菌，常常是由于漏气而造成的，冷却水是重要的污染源；不产芽胞细菌的检出有时是由于杀菌温度不够而造成的。罐头中污染的不产芽胞细菌有两大类群：一类是肠道细菌，如大肠杆菌，它们的生长可造成罐头膨胀；另一类不产芽胞的细菌主要是链球菌，特别是嗜热链球菌、乳链球菌、粪链球菌等，这些菌多发现于果蔬罐头中，它们生长繁殖会产酸并产生气体，造成罐头膨胀，在火腿罐头中常可检出粪链球菌和尿链球菌等不产芽胞的细菌。(四)酵母菌引起的腐败变质这类变质往往发生在酸性罐头或高酸性罐头中。主要种类有圆酵母、假丝酵母和啤酒酵母等。酵母菌及其孢子一般都容易被杀死。罐头中如发现酵母菌污染，主要是由于漏罐造成的，有时也因杀菌温度不够造成。常见变质罐头有果酱、果汁、水果、甜炼乳、糖浆等含糖量高的罐头，这些酵母菌污染的一个重要来源是蔗糖。发生变质的罐头往往出现浑浊、沉淀、风味改变、爆裂膨胀等现象。(五)霉菌引起的腐败变质霉菌引起罐头变质，说明罐内有较多的气体，可能由于罐头真空度不够，或者漏罐造成，因为霉菌属需氧性微生物，它的生长繁殖需要一定的气体。霉菌腐败变质常见于酸性罐头，变质后外观无异常变化，内容物却被烂掉，果胶物质被破坏，水果软化解体。引起罐头变质的霉菌主要有：青霉、曲霉、柠檬酸霉属等。少数霉菌特别耐热，尤其是能形成菌核的种类耐热性更强，例如纯黄丝衣霉菌是一种能分解果胶的霉菌，它能形成子囊孢子，加温85℃30min或87.7℃10min还能生存，在氧气充足的情况下生长繁殖，并产生二氧化碳，造成罐头膨胀。