食品微生物检验：食品微生物检验基础

食品微生物检验基础Contents第一节细菌学检验基础 一、无菌技术 二、微生物的接种与分离技术 三、细菌的培养方法 四、细菌的生长现象 五、细菌的生化反应检查法一、无菌技术（一）什么是无菌技术　　指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。（二）无菌环境 无菌室 无菌柜 超净工作台1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间（2）无菌室的消毒和防污染 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）. 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）. 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。2、超净工作台   超净台的使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作10~15分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.（三）无菌器材 灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等. 消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等（四）无菌操作1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。2、进入无菌室前的准备（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）用紫外线灭菌处理30~60分钟；（3）检查无菌器材是否完备；（4）洗手消毒；（5）手部消毒后，再穿戴无菌工作服。3、检验操作过程的无菌操作要求（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）在正火焰上方操作；（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）在接种培养物时，协作应轻、准。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。无菌操作–取菌技巧11.接种环前端铂丝部分以酒精灯烧红灭菌，后端铁棒部分过火2.试管前端过火3.打开试管盖（塞）无菌操作–取菌技巧14.试管倾斜，放入接种环无菌操作–取菌技巧15.试管前端过火，盖上试管盖6.接种环烧红灭菌无菌操作–取菌技巧12.自Plate上取单一菌落(方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入)(方法二：plate反面拿起)无菌操作–取菌技巧21.挤出吸球内空气，插上灭过菌的玻璃吸管2.向上為吸，向下為放无菌操作–取菌技巧3 调整微量加样器刻度(吸取范围200~1000μl)2.插上灭过菌的Tip(用力插紧)无菌操作–取菌技巧43.按钮压至第一段（不可压至最底）4.深入液面下2~4mm无菌操作–取菌技巧4无菌操作–取菌技巧41.试管前端过火2.打开试管盖无菌操作–接菌技巧方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌方法三：以Pipetman吸取菌液，按钮压至最底排出菌液方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液无菌操作–接菌技巧无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞操作时离酒精灯外焰区太远试管直放，空气中菌体容易掉入无菌操作–错误示范无菌操作–错误示范吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球随意放置桌面，菌液容易流出至桌上无菌操作–错误示范注意事項–生物性废弃物生物性廢棄物放至正确位置以便灭菌二、微生物的接种与分离技术（一）接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。１、接种工具和方法接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀2.常用的接种方法有以下几种：１）划线接种２）三点接种３）穿刺接种４）浇混接种５）涂布接种６）液体接种７）注射接种８）活体接种(二)分离纯化１.倾注平板法２.涂布平板法倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解1.菌悬液2.熔化的培养基3.培养物4.无菌水３.平板划线法平板划线分离法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。2、划线方法　　三、细菌培养方法由于细菌的种类不同，对培养条件的要求也就不同，细菌对培养条件的要求包括温度和气体。由于大多数细菌所需的温度均是35～37℃，所以细菌的培养方法仅以细菌对气体需求不同进行分类。据此可将细菌培养分为三种，即需氧培养法、CO2培养法、厌氧培养法。(一)需氧培养法此法为一般培养法，适合于需氧菌及兼性厌氧菌的培养。将已接种好的平板(一般需倒置)、斜面或液体培养基置35℃孵箱中培养18～24h，一般的细菌均能在培养基内生长。但对于难于生长或生长缓慢的细菌(如结核杆菌)则需培养3～7d甚至一个月才能生长。(二)CO2培养法某些细菌(如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、布鲁杆菌、溶血链球菌等)分离时，需在5％～10％CO2环境中才能生长良好。根据造成CO2环境的方法不同，CO2培养法又可分为以下几种：1．CO2培养箱法CO2的供应是靠与孵箱连接的CO2钢瓶，瓶中定期充有99.99％的CO2钢瓶上的真空表可指示CO2的输出量并指示补充气体的时间。由于CO2孵箱较昂贵，此法仅供大型实验室应用。二氧化碳培养箱2．烛缸法此法是将已接种的培养基，置于一定体积的磨口干燥缸内，在缸盖口均匀涂上少许凡士林，在缸内同时放入点燃的蜡烛，然后盖严缸盖，蜡烛经几分钟后因缸中氧气减少而自行熄灭，此时缸中的CO2含量约为5％～10％，再将干燥缸放入35℃孵箱中培养即可。二氧化碳培养法3．化学法常用的方法为碳酸氢钠-盐酸法，利用每升容积0.35ml盐酸与0.4g碳酸氢钠接触生成CO2的化学原理产生CO2，以供细菌生长。(三)厌氧培养法厌氧菌由于对氧敏感，在其分离、鉴定以及研究等的过程中，必须为之营造一个低氧化还原电势的厌氧环境，否则厌氧菌就不能生长甚至死亡，因此厌氧环境对于厌氧菌的生长繁殖至关重要。如在液体培养基的表面加盖凡士林或蜡，或在液体培养基中加入碎肉块制成疱肉培养基等。此外，也可以利用物理或化学方法除去培养环境中的氧，以保证厌氧环境。厌氧培养箱由恒温培养室、真空取样室、厌氧操作室、气路、电路控制系统等部分组成，填充气体一般为氮气。四、细菌的生长现象(一)细菌在固体培养基上的生长现象1．细菌在营养琼脂平板上的生长现象细菌经一定时间培养后，在固体培养基表面所形成的，肉眼可见的物体（群落），称为菌落。一个单一的菌落原则上是由一株细菌生长繁殖而成，其特征代表了该菌种细菌的特性。观察的方法是将平皿培养物放在自然光或白炽灯光的前面，从不同角度进行观察。菌落形状：圆形、不整形、扁平、凸起、凹面菌落大小：以mm计算。表面性状：光滑、粗糙、有无光泽等。边缘情况：整齐、不整齐、锯齿状等。颜色：无色、白色、黄色、灰色等。透明度：不透明、透明、半透明等。质地：硬、软、脂状、磨状等。粘度：奶油状、黏液状、膜状易碎等。乳化性：指在生理盐水中，将一菌落在盐水中研磨形成均匀乳状或颗粒状的程度。菌落形态学BacterialColonyMorphology 有荚膜的细菌菌落较大并且表面光滑，而没有荚膜的则表面较粗糙； 具有芽孢的细菌菌落表面常有褶皱并且不透明。 没有鞭毛不运动的细菌，特别是球菌，常形成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌则较大而扁平，边缘波状、锯齿状等；单增李斯特氏菌在普通计数琼脂平板上的菌落2．细菌在鉴定培养基上的特征（1）在血平板上的溶血特征α溶血：在菌落周围出现狭窄的草绿色的半透明区域，而红细胞外形完整。β溶血：在菌落周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带。γ溶血：看不到溶血带的溶血。双环：菌落周围完全溶解的晕圈外有一部分溶血的圆圈。(2)卵黄琼脂中的反应：此培养基用于检查细菌是否产生卵磷脂酶和脂酶，前者是在菌落周围出现一沉淀环，后者则是出现“珍珠包膜”，即在菌落周围出现“珍珠层”，通过反射光可见菌落周围有一层闪光膜。菌落白色混浊环，菌落周围无混浊白环菌落周围有混浊白环乳糖卵黄琼脂平板,借以确定该菌可否产生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相应抗血清所抑制，(3)蛋白水解作用：在菌落周围出现清晰的环。(4)色素：细菌在生长过程中可产生色素。水溶性色素溶在培养基中，使培养基着色，如绿脓色素、荧光色素等；脂溶性色素则使细菌菌落着上颜色，如金黄色葡萄球菌的金黄色菌落。（5）气味：有些细菌在生长过程中可产生气味，有助于细菌的鉴定。能产生特殊气味的细菌有：假单胞菌属细菌可产生葡萄汁气味；变形杆菌产生巧克力烧焦的臭味；链球菌产生地窖里的霉臭；梭菌可产生粪臭、腐败味；产黑色素类杆菌属细菌产生辛辣味等。(二)细菌在液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中一般以培养18～24h，观察生长特性为好。细菌在液体中生长特性包括：1．发育程度以有无生长，微弱、中等、旺盛来表示。2．浑浊度有无浑浊以及浑浊的程度(一般以混、中等、微浑、透明表示)；均匀浑浊、有颗粒；絮状生长。3．沉淀细菌由于重力而下沉，如链球菌的链与链相互缠绕而下沉，出现肉眼可见的沉淀，而上层的液体仍清澈透明，或者由于发酵分解糖产生酸，而使基质中的蛋白质发生沉淀。4．液体表面性状有无表面生长以及生长的性状，如膜状(厚薄)、环状、皱状、是否光滑或呈颗粒状。5．其他有无色素，有无气味，有无产酸情况，有无气体产生。液体培养物的观察未接种形成薄膜形成沉淀混浊生长絮状生长(三)细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基主要用于细菌动力的观察。有动力的细菌在穿刺线处有生长线外，在穿刺线的周围均可见浑浊和细菌生长的小菌落；无动力的细菌仅在穿刺线上有生长，周围的培养基透明清晰。斜面培养物的观察丝状树状念珠状扩展状假根状刺毛状五、细菌的生化反应检查法由于细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌，这种试验称为细菌的生化反应试验。在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的PH值变化。在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。生化试验的 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 1、待检菌应是新鲜培养物。培养18-24h。2、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验。（一）糖类代谢试验（二）氨基酸和蛋白质代谢试验（三）有机酸盐和铵盐代谢试验（四）酶类试验生化试验分类(一)糖类代谢试验1.糖(醇)发酵试验原理糖类是作为碳源和能量来源提供细菌合成菌体成分必需的原料，由于细菌各自有不同的酶系统，故对糖(醇)类的分解能力不尽相同。有的能分解某些糖类，生成酸又生成气体，有的虽能分解这些糖类但只能生成酸不能生成气体，有的则根本不能分解。借此特点，可以作为鉴定细菌的依据之一。该试验检查细菌对加在基础培养基中的特殊的糖发酵(降解)后产酸或产酸产气的能力。常用的糖、醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖、鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇方法(1)试剂：糖发酵培养基中，常用的指示剂主要有酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫和酸性复红等。前二者颜色反应较敏感，但稳定性较差。后二者比较稳定。特别是对发酵迟缓的细菌，培养时间较长，则以后二者为优。(2)培养基：液体糖发酵管，半固体糖发酵管，固体糖发酵管，双糖(或三糖)高层斜面发酵管。(3)操作：以无菌操作的方法将经分离培养的纯种细菌接种到糖(醇)发酵培养基中，置温箱内，按各类菌所要求温度(通常为37℃)经一定时间(数小时至二周)培养，然后观察结果。气泡导管气泡气泡阳性阳性阴性培养基变为黄色培养基未变色、无气泡产生结果(1)接种的细菌，如能分解培养基中的糖(醇)类而生成酸，由于培养基内加有指示剂，故可使培养基中的指示剂呈酸性反应，如产生气体，则可使半固体培养基内或液体培养基中倒置的小管出现气泡。如若不分解则无任何反应。糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。记录：产酸不产气，阳性，以“+”表示产酸产气，阳性，以“⊕”表示不产酸产气，阴性，以“-”表示(2)在半固体糖发酵管中，还可以观察细菌的动力，若为有鞭毛的细菌，则沿接种线向周围扩散生长。若为无鞭毛菌，则仅在接种线处生长。(3)在双糖(或三糖)高层斜面发酵管中，由于葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的1/10，如细菌只分解葡萄糖，则斜面上产生的酸少，且易被氧化并因产生氨以及细菌分解培养基中的蛋白质产生碱性物质而变弱碱性，故斜面变为粉红色，而底层变酸，指示剂变色。若细菌分解葡萄糖，同时也分解乳糖或蔗糖时，则产酸量较多，底层和斜面均呈酸性，指示剂亦变色。若在此培养基中加入硫酸亚铁或尿素，同时还可以观察细菌产生硫化氢及尿素分解情况。注意事项(1)各种糖发酵培养基，含糖的浓度一般为5～10g/L，有时为20g/L。(2)有些糖类，可因121℃高压蒸汽灭菌时水解变质，特别是在碱性溶液中更易被破坏，故含糖的培养基常用115℃，15min灭菌。亦可先将糖类单独配制成100～200g/L的水溶液，经115℃15min灭菌后，然后再以无菌操作的方法加入已灭菌的培养基中。此外，还可将糖的溶液用滤菌器进行滤过除菌，再加入培养基中。(3)若应用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。2.甲基红(MR)试验原理某些细菌分解葡萄糖的过程中产生丙酮酸，丙酮酸进一步被代谢成为乳酸，乙酸，甲酸等。使培养基的pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色为阳性；有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质，最终的酸类较少，培养基pH较高，加入甲基红指示剂呈黄色为阴性反应。因此该试验是检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力，某些细菌比其他细菌能够产生更多的酸。方法(1)培养基：葡萄糖蛋白胨水(MR/VP培养基)。(2)试剂：甲基红指示剂。(3)操作：待检菌18～24h纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中；37℃培养2～3d，每2ml培养液加2滴甲基红指示剂，立即观察。结果MR阳性：培养物有足够的酸，能使培养基表面甲基红试剂仍保持明显的红色(pH4.4)；MR阴性：培养基表面呈黄色(pH6.0)；延迟反应：橙色，应继续孵育到4天，并重复试验。3.伏普试验(V-P试验)某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P（+）反应。方法(Barritt法)(1)试剂：甲液为60g/Lα－萘酚酒精溶液；乙液为400g/LKOH溶液.(2)操作：首先将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，经37℃培养4d。再按每2ml培养液中加入甲液lml、乙液0.4ml，充分摇动试管，观察结果。结果如立即或于数分钟内出现红色反应者为阳性；若为阴性应将试管置37℃中4h后再进行观察。4.β-半乳糖苷酶试验原理细菌的酶分为结构酶和适应酶。β-半乳糖苷酶是一种诱导酶，它对半乳糖苷的作用是特异的。发酵乳糖的大肠菌类能产生β-半乳糖苷酶-渗透酶和β-半乳糖苷酶，因此能迅速地(在24～48h内)分解乳糖，并通过中间产物半乳糖和葡萄糖形成CO2和H2。非乳糖发酵菌缺少这两种酶，因此乳糖既不能进入菌体，又不能被分解。然而，不能发酵乳糖的细菌可呈现两种表型之一：一是G-P+，即没有β-半乳糖苷酶(G)，但有渗透酶(P)，因此不能发酵半乳糖苷，但能积累半乳糖苷；二是G+P-，具有β-半乳糖苷酶(G)，但没有渗透酶(P)。通过使用有机化合物邻位-硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG) 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 有无β-半乳糖苷酶活性，可预测细菌发酵乳糖的能力。若有半乳糖苷酶阳性的细菌存在，无色的ONPG试剂被水解，释放出黄色化合物邻位-硝基苯酚(ONP)。阳性β-半乳糖苷酶试验就是基于对邻位-硝基苯酚的检测。方法(1)培养基：10g/L乳糖肉汤琼脂。(2)试剂：0.01mol/L磷酸盐缓冲液；邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)液。(3)操作：首先将被检菌接种到10g/L乳糖肉汤琼脂上，经37℃培养过夜，以无菌方法取一接种环菌置于0.25ml的生理盐水中做成菌悬液，然后加ONPG液0.25ml，置于37℃温箱或水浴箱中，分别在20min和3h后观察结果。结果如有β-半乳糖苷酶，一般在20～30min即呈现黄色者为阳性；如无此酶则24h不变色。5.七叶苷水解试验原理某些细菌(如粪链球菌)可水解七叶苷，生成葡萄糖和七叶素(为一种珊瑚状的白色结晶)。七叶素可与培养基中的柠檬酸铁试剂的二价铁离子起反应生成黑色的化合物沉淀，使培养基变黑。方法(1)培养基：七叶苷培养基。(2)操作：以无菌方法将试验菌接种到七叶苷琼脂斜面培养基上，经37℃18～24h培养，观察结果。结果培养基变黑色者为试验阳性。若将粪链球菌接种到七叶苷液体培养基中，经37℃4～6h培养，培养基即可。6.石蕊牛乳试验原理牛乳中含有大量的乳糖和酪蛋白，营养丰富，一般细菌均可在其中生长。一种细菌在石蕊牛奶中可表现一种或几种代谢特性，每种代谢特性对一个特定细菌来说都是特异的。这样，就有助于细菌的鉴定：①乳糖发酵；②石蕊还原；③凝固蛋白；④蛋白陈化(消化)；⑤气体产生。有的细菌如产气荚膜梭菌，对牛乳具有强烈发酵反应，产酸、产气、凝固、胨化几乎同时发生。所产生的气体，可将培养基表层的凡士林冲至管口，牛乳可全被胨化变清，这种被称为“汹涌发酵”是为该菌所特有。有的细菌不发酵乳糖，而分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂变蓝紫色。方法(1)培养基：石蕊牛乳培养基。(2)操作：首先将培养基表面的一层凡士林在酒精灯上熔化，然后无菌取被检菌接种到石蕊牛乳培养基中。接种后将培养基直立，置37℃温箱培养，观察结果。结果产酸：若发酵糖产酸，使石蕊指示剂变为粉红色。产气：若发酵乳糖同时产气者，可冲开覆盖在培养基上的凡士林。凝固：若发酵乳糖产酸甚多，可使酪蛋白凝固。胨化：若将凝固的酪蛋白，继续水解成蛋白胨，此时牛乳培养基的上段则变清。产碱：若不发酵乳糖，分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂变蓝紫色。（二）氨基酸和蛋白质代谢试验不同细菌分解蛋白质能力不同，可利用不同氮源来合成菌体蛋白质，可通过检测加入蛋白质分解代谢后的产物或pH变化鉴定细菌。1.靛基质（Imdole）试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。方法(1)培养基：蛋白胨水。(2)试剂：Kovac试剂；欧氏试剂。(3)操作：纯培养物接种蛋白胨水培养基35℃培养24～48h，沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0.5ml，分为两层，观察。结果两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴性。靛基质试验照片靛基质+2.硫化氢试验原理某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色硫化物。方法与结果(1)琼脂穿刺法：培养基：三糖铁培养基、含硫酸亚铁(或醋酸铅)的半固体培养基。操作：将试验细菌以接种针沿管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经37℃24h培养后，观察结果。结果：培养基变黑色为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。制好的培养基对照管斜面红色，底面黄色培养基全黄色斜面、底部黄色，并产生H2S斜面红色，底部黄色，产生H2S底面黄色，并产生CO2(2)醋酸铅试纸法：培养基：含胱氨酸的半固体培养基、浸有醋酸铅的滤纸条。操作：待检菌穿刺接种培养基，悬挂醋酸铅纸条，37℃培养24～48h。结果：试纸呈黑色为阳性。该法较敏感。3.尿素酶试验原理有些细菌(如某些变形杆菌)具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨,使培养基pH上升，而变成碱性，使含有酚红指示剂的培养基变成红色。方法(1)培养基：尿素琼脂。(2)操作：将待检菌接种于尿素培养基，37℃培养18～24h，观察结果，如为阴性应继续观察4d。结果培养基变红为阳性，不变为阴性。尿素酶试验图阳性1、未接种2、尿素酶阳性3、尿素酶阴性4.明胶液化试验原理某些细菌产生明胶酶可使明胶分解，失去凝固力，使其由半固体转化为液体状态。天然存在的蛋白质分子太大不能进入菌体细胞，因此，细菌为了利用这些蛋白质，首先必须将其分解为较小的组分。某些细菌分泌细胞外类蛋白水解酶(明胶酶)来分解蛋白质，这种能力有助于细菌的鉴定。方法(1)培养基：明胶培养基(2)操作：将待检菌穿刺接种于明胶培养基，同时设置对照管(未接种细菌)，20℃培养5～7d，观察。在孵育期间，每24h取出试管(包括含细菌的试验管相对照管)放冰箱(或冰浴)内约2h，检查明胶是否已被消化(液化)，每天一次，直到7d，除非发生液化。有许多菌种要证实明胶液化需要延长孵育时间。结果半固体培养基不再凝固为阳性。注意事项:明胶在≤20℃时为固体，≥35℃时则为液体。从凝胶(固态)转变为液体大约在28℃。所以，明胶管在≥35℃下孵育时，在决定是否液化以前，必须先放在冰箱或冰浴中冷却一段时间。因细菌在培养基的表面生长引起液化，当明胶管还温热时不要摇动，否则液化的明胶与培养基液体混合，由此忽略阳性结果，造成假阴性。5.苯丙氨酸脱氨酶试验原理某些细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸和游离氨，加入FeCl3试剂与苯丙酮酸螯合后出现绿色产物，随后绿色可褪去。延长时间后，所生成的绿色会较快褪色。苯丙酮酸如与柠檬酸铁相遇则产生棕黑色。方法(1)培养基：苯丙氨酸培养基。(2)试剂：100g/LFeCl3溶液。(3)操作：被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，37℃培养18～24h，滴加100g/LFeCl3试剂数滴于斜面上，自上流下观察。结果须在5min内作出判断，出现绿色为阳性。加氯化铁试剂出现绿色+6.氨基酸脱羧酶试验原理细菌产生的脱羧酶可使氨基酸脱掉羧基，生成胺和CO2，胺可使培养基pH升高，用指示剂显示这个变化。常用的氨基酸有三种，脱羧反应如下：(1)赖氨酸：赖氨酸经过赖氨酸脱羧酶作用生成尸胺和CO2。(2)鸟氨酸：鸟氨酸经鸟氨酸脱羧酶的脱羧作用，产生腐胺和CO2。(3)精氨酸：L-精氨酸经精氨酸脱羧酶的作用，可产生精胺和CO2。方法(1)培养基：氨基酸脱羧酶培养基。(2)操作：待检菌接种于氨基酸培养基及对照培养基，35℃培养1～4d。延长时间则常有假阳性出现，假阳性系由蛋白胨中其他种氨基酸分解而造成，故必须同时接种对照管。结果检测培养基由黄色变紫色为阳性，黄色为阴性，对照(无氨基酸)为黄色。试验管对照管阳性+阴性-对照管变黄试验管变黄阳性反应试验管颜色变化过程紫色→黄色→紫色原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（10~12h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性，指示剂显紫色。阳性反应试验管颜色变化过程：紫色→黄色→紫色7.精氨酸双水解试验原理细菌分解精氨酸产碱不限于精氨酸脱羧酶。精氨酸双水解酶可使精氨酸经过两次水解，产生鸟氨酸、两分子氨和一分子CO2。经气相色谱分析证明，沙门菌分解精氨酸系由于精氨酸双水解酶，而大肠埃希菌则系由于精氨酸脱羧酶。方法(1)培养基：含精氨酸的氨基酸脱羧酶试验培养基及对照培养基。(2)操作：自斜面培养物接种，作肠杆菌科的鉴定时可覆盖灭菌的液状石蜡，作假单胞菌属的鉴定时则不能覆盖液状石蜡。于37℃培养。结果指示剂颜色转为碱性时为阳性。即溴甲酚紫转为紫色，酚红转为红色。但由培养基pH的改变不能证明是由精氨酸脱羧酶或由精氨酸双水解酶，欲鉴别应作气相色谱分析。8.肉渣消化试验原理肉渣消化试验是测定细菌对蛋白质的另一种分解能力。某些梭菌在生长过程中可将肉渣消化。例如肉毒梭菌有很强的消化能力，疱肉培养基可被消化而呈黑色，有助于和其他梭菌的鉴别。方法(1)培养基：疱肉培养基。(2)操作：试验菌按常规法接种于疱肉培养基，用蜡笔于培养基的肉渣上缘画一横线作为标记。于37℃培养数日。结果观察管内肉渣的高度有无变化，即可判定肉渣是否已被部分消化。9.凝固血清消化试验原理某些细菌液化凝固血清，系由于这些细菌产生一种胞外蛋白酶的作用所致方法(1)培养基：吕氏血清培养基。(2)操作：取试验细菌，以无菌方法接种于吕氏血清斜面上，经37℃培养数日，观察结果。结果凝固之血清发生液化为阳性。(三)有机酸盐和铵盐代谢试验1.柠檬酸盐利用试验原理有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，能在除柠檬酸盐外不含其他碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐，生成碳酸钠，使培养基变成碱性。方法(1)培养基：柠檬酸盐培养基。(2)操作：被检菌接种于柠檬酸盐斜面培养基上，35℃培养l～4d，观察。结果培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性。指示剂为：1%溴麝香草酚蓝(酒精溶液)或0.04%苯酚红10mL/1000mL水用脱脂棉过滤，制成后为黄绿色。斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-2.马尿酸钠水解试验三氯化铁法原理：B群链球菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀.方法培养基:马尿酸钠培养基。试剂：三氯化铁溶液。操作：待检菌接种马尿酸钠培养基，35℃培养48h，离心沉淀，取上清液0.8mL加入三氯化铁溶液0.2mL，立即混合均匀，经10～15min观察结果。结果：出现稳定的沉淀物为阳性，轻摇后沉淀物溶解为阴性。茚三酮法原理：马尿酸被细菌分解后，形成苯甲酸及甘氨酸。甘氨酸在茚三酮的作用下，经氧化脱氨基反应，生成氨，CO2和相应的醛，而茚三酮则生成了还原型茚三酮。其中形成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，形成紫色化合物。方法：试剂：l％马尿酸钠水溶液；3.5g茚三酮溶于100mL的1：1的丙酮，丁酮混合溶液。操作：0.4ml待检菌与等量的1％马尿酸钠水溶液混合后，35℃培养2h，加入0.2ml茚三酮试剂，振摇后观察。结果：出现紫色为阳性。3.丙二酸盐利用试验原理某些细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠可被分解生成碳酸钠，使培养基变碱性。溴麝香草酚蓝：溴麝香草酚蓝是一种酸碱指示剂，变色范围pH6.0(黄)～7.6(蓝)。普通水是中性，pH也就是7左右，差不多呈淡蓝，溶有二氧化碳后，由于会形成碳酸，碳酸是弱酸，因此pH不会降太多，变黄。当中过渡颜色是绿色。方法(1)培养基：丙二酸钠培养基。(2)操作：被检菌接种于丙二酸盐培养基，于35℃培养24～48h后观察结果。结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。阳性+(四)酶类试验1.氧化酶试验(Kovacs试验)原理氧化酶(又称细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，能使还原型的细胞色素C氧化成氧化型的细胞色素C，氧化型细胞色素C又使对苯二胺氧化，生成红色的醌类化合物。方法(1)试剂：10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液，或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液。(2)操作：取滤纸片蘸取待测菌落少许，加试剂一滴，观察颜色变化。也可用滴管吸取试剂，直接将一滴滴在待测菌菌落上，观察颜色变化。结果：阳性者立即呈现粉红色或红色，颜色逐渐变深至深紫色。成蓝色为+不变色或为红色为-2.过氧化氢酶试验(触酶试验)原理过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢分解为水和氧。方法(1)试剂：新鲜配制的3％过氧化氢水溶液。(2)操作：挑取1环固体培养基上的待测菌菌落，放于洁净玻片上或试管内，滴加3％过氧化氢数滴，观察结果。实验时必须用18～24h新鲜培养物。陈旧培养物可能使触酶失活，出现假阴性结果。此外，不宜挑取血琼脂上的菌落，因红细胞内含有触酶，会导致假阳性结果。结果30s内有大量气泡产生者为阳性，无气泡产生者为阴性。菌落－平板－1滴3％的过氧化氢。阳性。过氧化氢酶：3.硝酸盐还原试验原理某些革兰氏阴性杆菌在代谢过程中，能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸反应生成重氮苯磺酸，再与α-萘胺结合，生成红色的N-α萘胺偶氮苯磺酸。方法(1)培养基：硝酸盐培养基。(2)试剂：①甲液：对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml；②乙液：α-萘胺0.5g，5mol/L醋酸100ml。操作：待测菌株接种到硝酸盐培养基中，35℃18～24h培养后，加入0.1ml甲、乙液等量混合液于试管内，观察结果。结果出现红色为阳性，无颜色变化为阴性。4.过氧化物酶试验（1）原理:过氧化物酶的作用是将过氧化氢中的氧转移给可被氧化的物质。（2）其反应如下：试验时，若以联苯胺(4,4-二氨基联苯)作为被氧化的物质，试验细菌如有过氧化物酶存在时，加入过氧化氢可使苯胺氧化成为蓝色的联苯胺蓝。（3）方法试剂：盐酸联苯胺溶液；3％过氧化氢溶液。操作：将盐酸联苯胺溶液与过氧化氢溶液等量混合后，滴加于菌落上，立即观察结果。（4）结果阳性者于2min内呈现蓝色。5.脱氢酶试验（1）原理细菌的脱氢酶可使相应的作用物脱去氢，但此作用需要一个可还原的化合物作为受氢体。若用美蓝（亚甲蓝，Methyleneblue）作为受氢体的话，细菌如有脱氢酶存在，可使美蓝还原成美白(无色)。但是，美白易被空气中氧气所氧化，故此试验应在隔绝空气下进行。染料、医药、鉴识血迹如果用无色TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）作为受氢体，在有脱氢酶存在的情况下，TTC可以接受氢而成为红色的Formazan（甲臜zā)。后者不再被氧气所氧化，所以试验不必在密闭的条件下进行。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2）方法试剂：1︰30000美蓝水溶液；pH7.4磷酸盐缓冲液；0.1mol／L的作用物水溶液。操作：①取试验菌肉汤培养物10ml，离心后以缓冲液洗2次，再加缓冲液5ml，制成菌液。②取试管3支，每管加美蓝水溶液0.5ml，于第1管和第3管各加菌液1ml，第2管加缓冲液1ml，置37℃水浴中15min。③第1管和第2管各加作用物2ml，第3管加缓冲液2ml。④各管加无菌液状石蜡0.5ml，使覆盖于液面上。⑤置37℃水浴中，每5min观察一次，记录美蓝变白时间，共观察2h。(3)结果若第1管变白即为相应作用物的脱氢酶阳性，不变色为阴性。第2管与第3管为对照管，应不变色。6.氧化三苯基四氮唑试验(TTC试验)(1)原理部分细菌可还原无色可溶性的氯化三苯基四氮唑，成为红色的三苯甲臜(Formazan)。(2)方法(i)试剂贮存液：用无菌蒸馏水配制Na2HPO4饱和液，取氯化三苯基四氮唑(TTC)775mg，溶于100mlNa2HPO4饱和液中混匀后，放置于暗处，可保存2～3个月。应用液：取贮存液4ml，加Na2HPO4饱和液至100ml，混匀后，置暗处，可用2～4周。(ii)操作：①以无菌吸管吸取清洁中段尿2ml置于无菌试管中。②加TTC试剂应用液0.5ml。③混匀后，置37℃,8h培养后观察结果。(3)结果出现红色者为阳性，淡红色者为弱阳性，不变色者为阴性。7.脂酶试验(1)原理某些细菌产生卵磷脂酶，即α-毒素，在有钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成混浊沉淀状的甘油酯和水溶性的磷酰胆碱。(2)方法培养基：卵黄琼脂培养基。操作：将待检菌划线接种于卵黄琼脂平皿上，于35℃培养3～6h。(3)结果产生卵磷脂酶的细菌，培养3h后，在菌落周围形成乳白色混浊环，6h后扩散至5～6mm。8.磷酸酶试验(1)原理磷酸酶是一种单膦酸酯的水解酶，可使单磷酸酯水解，其反应可根据反应基质的不同而异，如用磷酸酚酞为基质，经磷酸酶水解后可释放出酚酞，在碱性环境中可呈红色。(2)方法培养基：于1000ml溶化的适宜琼脂培养基并冷至45℃时，加入过滤除菌的1％磷酸酚酞溶液lml，摇匀后倾注平板。操作：取被检菌的纯培养物接种上述平板，于35℃培养18～24h，于平板盖内加l滴浓氨水，熏蒸片刻。 (3)结果 如有酚酞释出，菌落即变为粉红色9.DNA酶试验(1)原理DNA酶可将脱氧核糖核酸(DNA)长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。长链DNA可被酸沉淀，水解后产生的寡核苷酸则可溶于酸，在DNA琼脂平皿上加入盐酸后，在菌落周围形成透明环。(2)方法培养基：DNA酶试验培养基。操作：点状接种待检菌于DNA琼脂平皿上，35℃培养18～24h，用lmol/L盐酸倾注平皿，观察结果。 (3)结果 菌落周围产生透明环为阳性，无透明环为阴性。10.血浆凝固酶试验(1)原理金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌的表面，产生凝固。凝固酶可分为两种，一种是与细胞壁结合的凝固酶，可用玻片法测定；另一种是菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶，可用试管法测出。(2)方法(i)玻片法：在玻片上分别滴加新鲜人或兔血浆及生理盐水各一滴，挑取待检菌的菌落，分别与血浆和生理盐水混合，立即观察结果，如血浆中有明显颗粒出现，而生理盐水中无自凝现象为阳性。有凝块均匀混浊血浆生理盐水血浆凝固酶试验(ii)试管法：小试管3支内各加入l︰4稀释的新鲜人或兔血浆0.5ml，①其中一支加待检菌18～24h肉汤培养物0.5ml，②另一支加阳性菌株18～24h肉汤培养物0.5ml，③再一支加肉汤培养基0.5ml为阴性对照，轻振混匀。3支试管放37℃水浴中3～4h，观察结果。(3)结果待检菌株管和阳性菌株管出现凝固，阴性对照管不出现凝固，为阴性。阳性反应阴性反应不凝固少量、零散凝固明显的块状凝固巨大块凝固完全凝固，倒置不流动金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验第二节免疫学基础第二节免疫学基础自1896年Widal和Sicad将免疫凝集反应技术用于伤寒的诊断以来，已经过去了一个多世纪，在这100多年里，免疫学技术得到了巨大的发展。凝集反应：当颗粒性抗原与其相应的抗体特异结合时，在电解质存在下，两者比例合适时，可出现凝集颗粒，此现象称凝集反应。凝集反应主要分为直接凝集和间接凝集反应两类。目前免疫学技术已经广泛地应用于医学检验、农业、生物分类、食品检验、法医鉴定以及有毒有害物质的鉴别和检验等诸多方面。一、抗原与抗体（一）抗原（Antigen，Ag）1、抗原的定义和特性（1）定义抗原是指进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。完全抗原包括下面两方面的免疫性能：一是免疫原性,指抗原进入体内刺激免疫系统产生抗体或形成致敏淋巴细胞的特性，具有这种能力的物质称为免疫原；二是免疫反应性，指抗原能和对应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的特性，又称为反应原性。有些物质，例如某些真菌毒素，单独存在时只有反应原性而无免疫原性，是非免疫原物质，被称为半抗原（hapten）。半抗原必须经过改造后才具有免疫原性（2）免疫原性免疫原性是完全抗原非常重要的性质之一，一种抗原能否成功地诱导免疫动物（宿主）产生免疫应答取决于以下几个方面的因素：抗原结构和性质、宿主的反应性和免疫方式。在抗原的结构和性质方面，包括抗原的异质性、分子量大小和化学结构等。异质性是指抗原物质和宿主动物本身物质之间的差异。分子量的大小也是影响抗原免疫原性的一个重要因素，一般当抗原的分子质量大于10ku时，均具有较好的免疫原性，分子质量越大，免疫原性越强。大分子物质的结构比较复杂，所含有效抗原基团的种类和数量也较多。宿主的反应性和免疫方式也影响着抗原的免疫原性，宿主的个体发育、生理状态和遗传性等都对免疫原性有很大的影响，所以不同种动物，甚至同种动物的不同个体对同一抗原的免疫均有差异。宿主的主要组织相容性复合物的基因控制着免疫应答。宿主的免疫方式，即免疫动物的机体与抗原的相互作用方式对抗原的免疫应答也有很大影响，主要包括抗原的进入途径、剂量、次数、间隔时间等。抗原的免疫原性能否真正得到体现除了取决于抗原本身的组成和结构外，还与免疫动物的生理状态和免疫方式等有密切的关系。（3）特异性抗原的特异性表现在两个方面：在免疫原性上，一种抗原只能诱发一种特异的免疫应答，结果形成特异性抗体或致敏淋巴细胞；在反应原性上，抗原只能与抗原诱导产生的特异性抗体或致敏淋巴细胞进行反应。抗原特异性是由特异性的抗原决定簇决定的。抗原决定簇或称为抗原表位,是位于抗原物质分子表面或者其他部位的具有一定组成和结构的特殊化学基团，它能与免疫系统中淋巴细胞上的受体及相应的抗体分子结合，是免疫原引起机体特异性免疫应答和免疫原与抗体特异性反应的基本构成单位。抗原的特异性是免疫学技术广泛应用于疾病诊断、鉴别和防治的基础。在分子生物学研究方法中使用的免疫分子探针也是基于这种高度的特异性。2、抗原的分类抗原的分类方法很多，可以根据来源分，也可以根据其化学组成与理化性质，以及亲缘关系等来进行分类天然抗原：天然具有抗原性的生物物质，如血浆、酶、激素。含多种抗原成分，具有种的特异性如血浆中的血浆蛋白质具有多种抗原性。人工抗原：用人工方法将没有免疫原性的小分子化合物联指于蛋白质载体上所制成的复合抗原。完全抗原：既具有免疫原性又具有反应按抗原性质原性的物质。不完全抗原：只有反应原性而没有免疫原性的物质。不完全抗原简单半抗原（半抗原）复合半抗原（1）按抗原性质分（2）按化学组成分蛋白质抗原：蛋白质破坏、改变丧失；蔗糖可抑制其变性多糖抗原：与蛋白质结合后，刺激动物产生抗体；福尔马林处理后对热稳定类脂抗原：类脂多糖、蛋白多糖复合物、特异性多糖抗体、细菌细胞壁多糖蛋白复合物异种抗原(heteroantigen)：与免疫动物不同种属的抗原。同种抗原(Alloantigen)：与免疫动物同种属的抗原，能刺激同种而基因型不同的个体产生免疫应答。自身抗原(Autoantifen)：动物的自身组织细胞、蛋白质在特定条件下形成的抗原，对自身免疫系统具有抗原性。异嗜性抗原(Heterophilantigen)：是指与种属特异性污垢、存在于人、动物、植物及微生物之间性质相同的抗原（交叉抗原）。也叫Fossman抗原（Fossman，瑞典病理学家）。（3）按来源分（4）按存在部位分菌体抗原：（O存在于细胞壁、主要成分为脂多糖）为数种成分所组成，按O抗原分类表面抗原鞭毛抗原：（H）指存在于鞭毛，主要成分为蛋白质。H抗原细菌抗原也有不同菌群特异性荚膜抗原：主要成分为多肽深部抗原指细菌的内部结构所形成的抗原物质（免疫中不起作用）病毒抗原：V抗原：不耐热S抗原：可溶性（二）抗体1、抗体的定义、分布和分类抗体（antibody，Ab）是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）。通常Ab和Ig可作为同义词使用。抗体主要存在于动物血清中，也存在于动物的其他体液和体外分泌液，例如乳汁和细胞分泌液中。另外，抗体还存在于某些细胞，例如B淋巴细胞的膜上。Ig包括很多种类，根Ig的理化特性和与抗原结合方式的不同，Ig可以分为类和亚类，例如人类的Ig可分为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE五大类，其中IgG和IgA分别可进一步分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA1、IgA2亚类。小鼠Ig的分类和人类Ig分类相同，但是IgG的亚类稍有差别，分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgG是Ig中主要的组成成分，约占血清总蛋白质的15%。应用于免疫学技术中的抗体主要是IgG和IgM，以IgG最为常用。2、抗体的结构不同种类Ig的存在形式不同，以人的Ig为例，IgG、IgE和IgD以抗体单体的形式存在，而IgM和IgA则通常由多个抗体单体组成。IgM是由五个抗体单体通过J链（joiningchain）连接在一起的五聚体，而IgA则是由J链连接在一起的二聚体、三聚体甚至四聚体。Ig的类型:据根研究内容的不同，免疫检测技术可以分为细胞免疫检验技术和体液免疫检验技术两大类。细胞免疫检验技术主要检测免疫活性细胞及其功能，在医学检验、诊断和相关研究中应用较多。体液免疫检验技术则主要是检测抗原和抗体等免疫活性物质，它除了用于医学检验和分析外，在生物分类、食品检验、法医鉴定等诸多方面都得到了广泛的应用。该技术主要是以抗原抗体的特异性反应为基础而建立起来的。二、常用的免疫学技术（一）抗原－抗体反应抗原-抗体反应，即抗原和抗体之间的特异性反应，可以发生在体内，也可以发生在体外，前者可以介导体内毒素中和、杀菌和溶菌等作用，后者在体外进行，是免疫检测技术的基础，但是它们的基本反应特性是相同的。在进行体外免疫学实验时，通常是以存在于血清中的抗体(也是抗体的主要存在形式)为材料进行的，所以体外免疫学反应又称为血清学反应。1、抗原抗体反应的原理抗体（Ab)是球蛋白分子，在水溶液中，由于分子之间电荷等的相互作用而呈胶体状，不会自然沉淀，同样(可溶性)抗原(例如蛋白质)在溶液中一般也不会自然沉淀。当抗原(Ag)和对应的特异性抗体结合反应时，电荷减少或消失从而使它们由亲水胶体变为疏水胶体，形成肉眼可见的抗原-抗体复合物。抗原与抗体的特异性结合是基于抗原和相应抗体分子之间的结构互补性与亲和性进行的，这些特性是由抗原和抗体分子的一级结构决定的。抗原抗体分子之间的特异性结合力包括电荷引力、范德华(vanderWaals)力、氢键和疏水作用。2、抗原-抗体反应的特性抗原-抗体反应的最大特点是①特异性，抗原抗体反应实际上是抗原决定簇和抗体的超可变区之间的相互结合，由于它们两者之间在化学结构和空间构型上高度互补，所以决定了它们之间的反应是高度特异的。其次是②可逆性，抗原抗体之间的反应是可逆的。反应平衡常数K＝k1/k2，其中k1为正反应速度常数，k2为逆反应速度常数。由于K值反映了抗原抗体之间的结合能力，抗原抗体之间的亲和力通常也以它来表示。影响K值的因素很多，主要包括电解质的种类与浓度、pH值和温度等。在实践中可以通过调节这些影响因素来促进或削弱抗原抗体的结合。例如，在抗体的亲和层析中，首先调节pH值等因素使抗体结合在固定化的抗原上，通过洗脱液洗涤去除不能结合的其他杂质，然后调节洗脱液的pH值至酸性，使抗体与抗原的结合力削弱或消失，从而被洗脱下来，达到纯化的目的。抗原抗体反应的另一个非常重要的特性是③比例性，即只有抗原抗体的比例适当时才能出现最强的反应，通常表现为沉淀最多或吸光值最大等现象。１、凝集反应2．沉淀反应3、补体结合试验4．免疫标记技术常见的血清学反应１、凝集反应颗粒性抗原＋相应抗体→凝集块。包括：直接凝集反应、间接凝集反应、反向间接凝集反应、协同凝集反应等。凝集反应包括：单向琼脂扩散、双向琼脂扩散、对流免疫电泳、火箭电泳等。2．沉淀反应对流免疫电泳常用于鉴定血清型。即将抗原和抗体在琼脂凝胶孔中电泳，带负电荷的抗原向正极运动，带正电荷的抗体向负极运动，二者在琼脂凝胶中相互作用而形成沉淀线。火箭电泳（rocketelectrophoresis）又称电免疫扩散法，主要用于检测标本中某一免疫球蛋白含量。方法是将含有已知抗体的琼脂制成琼脂板。冷凝后，在液板上的阴极端挖一排小孔。孔中分别加入一定量的待检样品及不同稀释度的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 抗原，进行电泳。抗原向阳极移动，并与抗体结合。在抗原、抗体比例适当的部位形成锥形沉淀峰，其形状如火箭。该峰的高度与抗原量成正比。可快速测出标本中抗原的含量。本法的敏感度与单向琼脂扩散相仿，技术操作较为复杂，但需时间较短。用荧光素、酶、放射性同位素、胶体金、电子致密物等标记已知抗原或抗体，通过检测标记来反映抗原抗体反应的情况，从而间接地测出被测抗原或抗体的存在与否或量的多少。（1）免疫荧光技术：（2）免疫酶技术：（3）放射免疫测定法：3．免疫标记技术(4)免疫印迹法：(5)免疫金标技术：(6)免疫PCR：免疫酶技术目前常用的是ELISA（酶联免疫吸附试验）Thanks！