发酵过程优化与控制(原理部分)

发酵过程优化与控制汪文俊博士中南民族大学生物科学学院国家民委生物制药工程中心TEL：62164736wangwenjun@mail.scuec.edu.cnQQ：4892648381课程内容与参考书内容发酵过程优化与控制(原理部分)发酵过程优化与控制(工艺部分)发酵过程优化与控制(控制部分)发酵过程优化与控制(实践部分)参考书目发酵过程优化原理与实践陈坚江南大学多尺度微生物过程优化张嗣良华东理工大学发酵过程原理叶勤华东理工大学2学科的交叉与渗透新兴、前沿学科往往在学科交叉中产生3生物技术医药生物技术农业生物技术工业生物技术环境生物技术材料生物技术...用生物或生物分子机器生产产品和解决问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 4工业生物技术含意：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化工业生物技术是生物技术的重要组成部分5底物生物反应器检测控制仪表培养基（灭菌）经加工原料酶细胞生物催化剂（游离或固定化）机械能除菌空气产品提取纯化副产品产品废物热能原材料营养物典型工业生物技术过程6发酵工程──利用微生物进行产品生产抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业基因工程药物、疫苗及抗体产品传统生物技术化学工程生物化工生物加工行业现代生物技术基因工程菌发酵7生物技术产品生产的发展历程发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗菌素发酵工业→氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）→基因工程菌→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动植物生物反应器的名称、定义与范畴：植物生物反应器、动物生物反应器、微生物生物反应器、哺乳动物乳腺生物反应器、利用活体家蚕及动物细胞培养生产有用蛋白、微生物细胞加工厂,….8细胞大规模培养技术细胞大规模培养──微生物、动植物细胞、藻类细胞等，传统技术或基因工程改造细胞代谢产物、生物转化、酶、蛋白质表达和基因质粒等占生物技术产品的40%以上，达1OOO亿美元。9发酵工程产业化发展目前，全球发酵产品的年销售额在1000亿美元左右，并以每年约7％～8％的速率增长。我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题10人类社会经济发展的危机随着人类社会经济发展，当前的能源结构、资源结构、环境状态已不能支撑现有的发展模式。特别重要的是随着煤、石油等能源的耗竭以及环境保护的急需，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标。传统的粗放型经济增长方式必定走到尽头，必需走资源节约型、环境友好型的道路11基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济将工业革命世纪转变到生物技术世纪只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。这种能源结构和资源结构的转变直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。12Idealizedbiorefineryconcept.(ImagecourtesyofOakRidgeNationalLaboratory,OakRidge,TN,USA.)13《细胞大规模培养》在生物技术产业发展中的作用21世纪的生物技术产业究竟是一个什么样的格局？作为生物技术产业的核心，以微生物为代表的过程研究，在已经开始的生物经济时代是处于一种什么状态？能起何种作用？面临怎样的课题?这是人们所关注的问题！14发酵工程的重大转折点二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发，青霉素的发现，迅速形成工业大规摸生产。1928年由Fleming发现青霉素1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基───40u/ml1943年沉浸培养：5m3───200u/ml当今：100m3─200m3───5-7万u/ml链霉素、金霉素、新霉索、红霉素15主要的技术进展：通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。意义：抗生素工业的发展建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法推动了整个发酵工业的深入发展为现代发酵工程奠定了基础16大型发酵罐搅拌装置17现代发酵工程的主要研究内容发酵过程的优化控制技术2.生化过程的模型化3.高密度培养技术4.代谢工程和代谢网络控制5.新型生化反应器的研究和开发6.新型发酵和产品分离技术18第一章绪论一.发酵过程优化在生化工程中的地位二.发酵过程优化的目标和研究内容三.发酵过程优化的研究进展四.流加发酵过程的优化控制19一.发酵过程优化在生化工程中的地位如何才能更好地发挥现代生物技术的作用？以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度(便于下游处理)、较高的底物转化率(降低原料成本)和较高的生产强度(缩短发酵周期)现代生物技术不仅能在生产新型食品、饲料添加剂、药物的过程中发挥重要的作用，还能经济、清洁地生产传统生物技术或一般化学方法很难生产的特殊化学品，在解决人类面临的人口、粮食、健康、环境等重大问题的过程中必将发挥积极的作用20发酵过程优化的主要研究内容第一个方面是细胞生长过程研究第二个方面是微生物反应的化学计量第三个方面是生物反应过程动力学的研究（主要研究生物反应速率及其影响因素）第四个方面的内容是生物反应器工程（包括生物反应器及参数的检测与控制）二.发酵过程优化的研究内容和目标21发酵过程优化的目标使细胞生理调节、细胞环境、反应器特性、工艺操作条件与反应器控制之间这种复杂的相互作用尽可能地简化，并对这些条件和相互关系进行优化，使之最适于特定发酵过程的进行发酵过程优化的基础是进行生物反应宏观动力学和生物反应器的研究22实现发酵过程优化控制的过程23生物反应动力学研究的目的：是为描述细胞动态行为提供数学依据，以便进行数量化处理生物反应动力学的研究内容：是有关生物的、化学的与物理过程之间的相互作用，诸如生物反应器中发生的细胞生长、产物生成、传递过程等24发酵过程优化涉及非结构模型和结构模型的建立建立动力学模型的目的：是为了模拟实验过程，对适用性很强的动力学模型，还可以推测待测数据，进而确定最佳生产条件25什么是非结构模型？什么是结构模型呢？26非结构模型把细胞视为单组分，则环境的变化对细胞组成的影响可被忽略，即细胞的生长处于所谓的平衡生长状态，此基础上建立的模型称为非结构模型非结构模型是在实验研究的基础上，通过物料衡算建立起的经验或半经验关联模型27结构模型由于细胞内各组分的合成速率不同而使各组分增加的比例不同，即细胞生长处于非均衡状态时，必须运用从生物反应机理出发推导得到的结构模型在考虑细胞组成变化的基础上建立的模型，称为结构模型28生物反应器工程的研究内容生物反应器的形式、结构、操作方式、物料的流动与混合状况、传递过程特征等是影响微生物反应宏观动力学的重要因素29生物反应器中复杂的相互关系30三.发酵过程优化的研究进展20世纪60年代中期,建立了无菌操作的一整套技术20世纪40年代初抗生素工业的兴起，标志着发酵工业进入了一个新阶段40年代末一门反映生物和化工相交叉的学科──生化工程诞生1954年,Hasting指出,生化工程要解决的十大问题是深层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容器、冷却方式、设备及培养基除菌、过滤、公害1964年Aiba等人认为通气搅拌与放大是生化工程学科的核心，其中放大是生化工程的焦点311985年，德国学者卡尔许格尔提出生物反应工程的研究应当包括两个方面的内容∶一是宏观动力学，它涉及生物、化学、物理之间的相互关系；二是生物反应器工程，它主要涉及反应器本身，特别是不同的反应器对生物化学和物理过程的影响1973年Aiba等人进一步指出，在大规模研究方面，仅仅把重点放在无菌操作、通气搅拌等过程的物理现象解析和设备的开发上是不够的，应当进一步开展对微生物反应本质的研究1979年，日本学者山根恒夫编著了《生物反应工程》一书，认为生物反应工程是一门以速度为基础，研究酶反应、微生物反应及废水处理过程的合理设计、操作和控制的工程学32生化反应工程的核心是生物反应过程的数量化处理和动力学模型的建立，实现发酵过程优化则是生物反应工程的研究目标目前一般认为生物反应工程是一门以生物反应动力学为基础，研究生物反应过程优化和控制以及生物反应器的设计、放大与操作的学科生物反应工程的研究主要采用化学动力学、传递过程原理、设备工程学、过程动态学及最优化原理等化学工程学原理，也涉及到生物化学、微生物学、微生物生理学和遗传学等许多学科领域，因此是一门综合性很强的边缘学科33实现发酵过程的优化与控制，必须解决的五个问题:(1)系统动力学；(2)生物模型；(3)传感器技术；(4)适用于生物过程的最优化技术；(5)计算机─检测系统─发酵罐之间的接口技术(如神经网络、专家系统)34其中尤以流加发酵的最优化研究报道居多发酵过程优化控制的研究针对有关发酵产品的生产过程进行微生物生长和产物形成的动力学研究，提出新的或修正的动力学模型或表达式；结合现代生物技术产品的开发，进行基因工程菌、哺乳动物细胞或植物细胞的生长动力学和产物形成动力学的研究；在动力学研究的基础上进行过程优化控制的研究，包括状态观察方程的建立、观察数据的噪声过滤、不可测参数及状态的识别、过程离线或在线的优化控制。35四.流加发酵所谓流加发酵，即补料分批发酵(Fed-batchfermentation)，有时又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法36流加发酵的研究进展1973年日本学者Yoshida等人首次提出了“Fed-BatchFermentation”这个术语，并从理论上建立了第一个数学模型，流加发酵的研究才开始进入理论研究阶段在20世纪70年代以前流加发酵的理论研究几乎是个空白，流加过程控制仅仅以经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇或恒速流加37流加发酵三个方面的重大进展流加发酵的最优化研究20世纪70年代中后期对流加发酵过程的动力学解析结合发酵过程的可测参数对流加过程进行反馈控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸商)法、pH法、代谢物法等）38流加发酵最优化的研究内容包括：状态方程的建立目标泛函的确定最优化底物流加方式的求解流加发酵最优化研究的核心问题是找出最佳的底物流加方式，以维持发酵过程始终处于最佳状态39流加发酵的物料衡算式可以表达为流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值(最大值)原理等40一、何时采用流加发酵方式？二、如何进行底物的流加？在采用流加发酵技术之前要考虑的两个问题41所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制作用高菌体浓度培养即高密度培养系统非生长耦联性次级代谢产物(如产物的合成需要某些营养物质或前体)利用营养突变体的系统(过量加入营养物只能使菌体迅速生长，而目的代谢产物的产量会减少。而当营养物严重缺乏时，菌体生长受抑制，代谢产物的产量也会减小)营养缺陷型菌株的培养一、何时采用流加发酵方式？42流加发酵类型采用流加发酵应该解决的关键问题？流加发酵过程中某些重要参数的确定合适的流加发酵类型的确定流加方式的应用二、如何进行流加发酵操作？431.流加发酵类型442.采用流加发酵应该解决的关键问题(1)流加什么物质？①补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加葡萄糖、饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油脂，有时也能同时起到补充碳源的作用②补充菌体所需要的氮源，有机氮或氨水③加入某些微生物生长或合成需要的微量元素或无机盐④加入酶合成诱导物或前体物质45a.底物流加速率b.流加开始时间及总流加时间c.需控制的底物浓度(2)如何流加？46a.最佳底物浓度的确定(包括菌体生长阶段和产物合成阶段)b.底物的消耗速率c.菌体比生长速率()d.菌体对底物的产率系数(Yx/s)及产物对底物的产率系数(Yp/s)(3)流加发酵过程中某些重要参数的确定47a.恒速流加(包括单一速率和分阶段恒速流加)b.指数速率流加c.底物在线测定后的反馈流加(如葡萄糖反馈流加)d.pH-state.DO-stat(4)合适的流加发酵类型的确定485.流加方式的应用(1)恒速流加采用恒流速流加培养时，可得到如下的物料平衡方程式：细胞平衡：碳平衡：产物平衡：体积平衡：49预试验中所得出的流加时刻菌体对所流加基质的消耗速率发酵液中残留基质浓度流加后需要控制的发酵液中的基质浓度恒流速流加过程中的流量F的确定：50在菌体生长阶段采用指数速率流加法的几点假设如下：(a)发酵罐内为理想混合；(b)葡萄糖为唯一限制性碳源；(c)残留菌体对葡萄糖的产率系数(YX/s)为常数；(d)菌体生长遵循Monod方程。(2)指数速率流加51式中：F为体积流加速率(L/h)，S0为流加液中基质浓度(g/L)，Yx/s为菌体对底物的产率系数(g/g)，ms为细胞比维持系数(g/g/h)，X为菌体浓度(g/L)，V为培养液体积(L)，μ为菌体比生长速率(h-1)。对底物葡萄糖进行衡算，则：52对菌体量的变化进行物料衡算，则：假定为常数，则上式积分可得：53由于生长符合Monod方程μ是S的函数，要使μ恒定，S必须恒定，则有：54其中tF为开始指数速率流加的时间，t≥tF，XF和VF分别为tF时刻的菌体浓度和发酵液体积指数速率流加的速率F的表达式为:55方程中各参数要预先求知应用时流加速率F可采用阶梯递增方式进行设定指数速率流加方式应用中的注意事项：56高生产率和高细胞密度发酵1.细胞生长环境的优化策略培养基组成的优化特殊营养物的添加限制代谢副产物的积累2.培养模式所培养细胞的具体代谢行为利用抑制性底物合成目的产物的潜力诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力3.诱导策略4.细胞循环发酵(应用限制：作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大；系统的放大存在许多实际困难)57第二章发酵过程优化原理一.发酵过程优化的微生物反应原理二.发酵过程数量化方法三.微生物反应动力学四.微生物反应优化的一般原理58一.发酵过程优化的微生物反应原理1.大肠杆菌生长过程中观察到下列现象∶(1)在大肠杆菌快速生长期间，生物合成的中间体很少渗漏到胞外培养基中，结构单元(氨基酸、核酸等)的合成速率和聚合形成大分子的速率一致(2)大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化(3)一旦生长培养基中的结构单元足够，细胞就不再合成这些物质(4)特定的代谢途径代谢特定的底物，只有底物存在时，细胞才合成相应的酶(5)若两个不同的底物同时存在于培养基中，细胞先合成能在一种底物上以较高比生长速率生长的酶系，当这种底物消耗完毕，再合成利用另一底物的酶。59(1)底物传递进入细胞(2)通过胞内反应，将底物转变为细胞质和代谢产物(3)代谢产物排泄进入非生物相，即胞外培养基细胞生长过程可分为三个步骤60底物、代谢产物和细胞质成分底物是一种存在于初始非生物相或者摄入物中起作用的可交换的化合物代谢产物是一种作为代谢物产生于某代谢途径进入非生物相的化合物细胞质成分是一种细胞利用底物产生的不可交换的化合物61膜上可能存在三种不同的运输机制：(1)自由扩散(2)协助扩散(3)主动运输前两种机制是沿着浓度梯度进行运输，是被动的过程，在运输过程中不需要提供外部能量。而主动过程逆着浓度梯度进行运输，需要输入一定的吉布斯自由能。62不同底物和代谢产物的扩散过程63微生物细胞的胞内反应分解代谢反应糖类在转化为代谢产物(CO2、乳酸、乙酸和乙醇等)的同时，还形成ATP、NADH和NADPH。NADH和NADPH都在分解代谢反应中产生，但NADPH主要消耗于合成代谢中，NADH则主要消耗于分解代谢途径，如氧化磷酸化生物合成和聚合反应为了合成细胞物质，需要合成结构单元并将其聚合。合成蛋白质需消耗大量的自由能，细胞一般根据其自身需求来调节蛋白质的合成,其合成由蛋白质合成系统(PSS)负责，该系统中核糖体是主要部分，E.coli中大约70%的能量和还原力用于合成蛋白质64合成E.coli细胞对前体代谢物的需求细胞合成所需要的结构单元数在75～100之间，这些物质都是从12种前体代谢物合成得到的，这些前体代谢物就是分解代谢反应的中间产物，因此分解代谢在细胞生长过程中起着双重的作用(为生物合成提供能量和前体代谢物)65（3）次级细胞代谢细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程，称之为初级代谢但许多工业上重要的产品，其合成反应并不与生长过程偶联，我们称之为次级代谢，这些反应合成的产物叫次级代谢产物，就象初级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样乳酸是初级代谢产物，但它是乳酸菌在非生长条件下形成的，许多其它的初级代谢产物也同样是在非生长条件下产生的66初级代谢产物定义为“在细胞生长所需要的反应中形成的产物”可能比较确切一些次级代谢产物定义为“在那些对于细胞生长不重要的反应中形成的产物”67一些工业上重要的初级和次级代谢产物一览68二.发酵过程数量化方法发酵过程的数量化处理包括：1.发酵过程的速度2.化学计量学和热力学3.生产率、转化率和产率只有当变量为可测量时，才有可能对发酵过程进行数量化处理691.发酵过程的速度70发酵过程常规的参数及其测量71菌体生长速度为∶氧和底物利用速度为∶P、C和HV生成速度为:72细胞生长的比速率为：底物消耗的比速率为qs∶产物形成的比速率为qp：73氧消耗的比速率为qo：二氧化碳生成的比速率为qc：发酵热生成的比速率：742.化学计量学化学计量方程表示通用化了的碳源根据元素分析得出的细胞组成表示产物753.产率系数(1)宏观产率系数宏观产率系数(或称得率系数)Yi/j是化学计量学中一种非常重要的参数，常用于对碳源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，其中i表示菌体或产物，j表示底物例如，菌体对底物的产率系数可表示为：76生物反应过程中宏观产率系数的定义总览77有时，以摩尔为单位表示产率系数更有利：值在实践中对推导元素平衡方程很重要，对与氧化磷酸化有关的理论问题也有重要意义78(2)理论代谢产物产率依此计算，=147/180=0.82。此处没有考虑反应过程中NADH及ATP等辅助底物的生成和消耗假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP/S可达理论最高值，称为理论代谢产物产率（a）根据化学计量关系计算例如，由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为∶79（b）由生物化学计量关系计算由该反应式=(147×13)/(12×180)=0.75此处-酮戊二酸的氨基化还原反应中所需要的NADPH由异柠檬酸脱氢反应供给！用生化计量式时,必须清楚有关的代谢途径根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径，进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP等辅底物的物料衡算，结合化学计量关系可求出上式：80(c)实际发酵过程中的产率系数在实际发酵中，产率是变化的，产率取决于下列因素：Y=f(菌株、底物、、m、Ｓ；t、tm、OTR、C/N，P/O)式中m为混合度，S为底物浓度，t为平均滞留时间，tm为混合时间，OTR为氧传递速度，C/N为碳氮比，P/O为磷氧比81另外，Papoutsakis和Lim(1981)用碳流分支的概念来解释菌体产率变化的原因：其中r1和r２分别为碳源分支代谢途径1和途径2的反应速度，MX和MS为菌体和底物的分子量，x是S→X反应的化学计量系数，可见产率只随r２或r１变化在甲基营养菌中存在两种不同的碳代谢流：同化(r2)和氧化(r1)碳源和其它营养物的浓度或温度、pH等培养条件的任何变化都可能引起r２或r１变化这一概念表明，甲基营养菌菌体产率的变化是一个动力学问题，而不是生物合成问题82三.微生物反应动力学被摄入到微生物细胞内的底物中，一部分转化为代谢产物，还有一部分则转化为新生细胞的组成物质。因此，对微生物反应动力学进行研究，至少要对底物、菌体和产物三个状态变量进行数学描述微生物反应是很多种物质参与的复杂代谢过程的综合结果。因此，微生物反应的动力学方程只能通过数学模拟得到83三.微生物反应动力学进行数学模拟的难点在于细胞的生长、繁殖代谢是一个复杂的生物化学过程，该过程既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞外的物质交换，还包括胞外的物质传递及反应为了优化反应过程，首先要进行合理的简化，在简化的基础上建立过程的物理模型，再据此推导得出数学模型。84微生物反应动力学模型的分类85（一）细胞生长动力学模型1.无抑制作用的细胞生长动力学底物消耗速率方程对应为∶温度和pH恒定时，对于某一特定培养基组分的浓度s，Monod方程为∶式中:max称为最大比生长速率(h-1)，Ks称为半饱和常数(g/L)86菌体生长为均衡型非结构生长；培养基中只有一种底物是生长限制性底物；菌体产率系数恒定Monod方程应满足∶842.细胞生长稳定期和延迟期的Monod型动力学式中和是经验常数，取=max和=xmax，(1)延迟期动力学模型的建立(2)生长稳定期动力学模型的建立883.微生物死亡期和内源代谢(1)微生物死亡期的动力学模型Kd为比死亡速率(h-1)对应于由底物生成菌体的一级反应速率为∶(2)内源代谢的动力学模型或：ms为细胞的维持系数(s-1)，Y*X/S为最大细胞产率894.底物和产物抑制的动力学模型(1)底物抑制动力学(Andrew底物抑制模型)式中KIS是底物抑制常数(2)产物抑制动力学（Hinshelwood模型）式中，P为产物浓度，k为动力学常数或：式中KIP为产物抑制常数90（二）微生物产物形成动力学模型Gaden根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关系，将产物形成区分为三种类型类型Ⅰ∶也称为偶联模型（醇类、葡萄糖酸、乳酸）类型Ⅱ∶也称部分偶联模型（柠檬酸、氨基酸）类型Ⅲ∶也称为非偶联模型（抗生素、酶、维生素、多糖）91上述三种类型外还有一种模型是qP与负偶联的模型，例如黑曲霉生产黑色素，其qP与的关系可表示为：当考虑到产物可能存在分解时：式中，k’d为产物分解常数92四.微生物反应优化的一般原理1.发酵过程优化的一般步骤(1)反应过程的简化是指把工艺过程的复杂结构压缩为少数系统，这些系统可以用关键变量来表示(2)定量化系统、准确地检测发酵过程的各种参数(3)分离是指在生物过程和物理过程的各种速度相互不影响的情况下，精心设计实验以获得关于生物和物理现象的数据93数学模型是能以简化的形式表征过程行为，并实现特定目的的数学公式数学模型可将特定结果通用化，并为推论系统的其它性质提供基础建立数学模型的主要目标是：(a)为了预见任何系统的转化率或生产率；(b)用以检查在各种操作条件下工厂操作的性质和行为，检查模型适用的范围(包括外推性)；(c)用于进行工艺优化和计算机模拟；(d)用于检测出可能重要但被忽视了的参数；(e)检查是否已有效地区分生物现象和物理现象；(f)有助于阐明反应机理(4)数学建模942.分批微生物反应过程的优化最优化的目标函数：产量、生产率、纯利润等，有时也对这些指标的其中二个以上进行多目标函数优化最优化的操作变量：反应时间、培养基组成、温度、pH、溶氧等培养基组成的优化预先设定XT为最大菌体浓度，则由可得到底物Si的初始浓度为∶95利用最优实验设计法，即使不能提高产量，也可探索培养基组分的最小需用量，从而避免不必要的浪费无机离子或生长因子等一旦被细胞吸收，在细胞内保持元化学状态，且含量恒定不变。这类营养物质称为储存性底物。可根据这些物质在菌体内的实际含量，用类似于上式的方法确定其需要量当代谢产物的产量与培养基组成之间的关系很复杂，不能用解析函数的方式表示时，可采用实验设计法确定最优初始浓度96第三章生物反应过程的系统优化技术一.系统优化技术概述二.ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用三.有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合系统四.生物反应与产物分离的组合系统97一.系统优化技术概述1.系统的定义奥地利理论生物学家贝塔朗菲于1937年第一次提出,系统是“一个相互作用的诸要素的综合体”。我国科学家钱学森对系统的定义是∶“系统是由相互作用和相互依赖的若干组成部分结合而成的，具有特定功能的有机整体，而且这个整体又是它从属的更大的系统的组成部分”换句话说，系统是同类或相关事物按一定的内在联系组成的整体982.系统的一般形态有：(一)自然系统和人造系统(二)实体系统和概念系统(三)封闭系统与开放系统(四)静态系统和动态系统(五)对象系统和行为系统(六)控制系统和因果系统993.系统应当具备四个基本特征(一)整体性(系统是由两个以上有一定区别又有一定相关的要素所组成，系统的整体性主要表现为系统的整体功能)(二)相关性(各要素组成了系统是因为它们之间存在相互联系、相互作用、相互影响的关系)(三)目的性(系统具有能使各个要素集合在一起的共同目的，而且人造系统通常具有多重目的)(四)环境适应性(环境是指出现于系统以外的事物的总称，相对于系统而言，环境是一个更高级的、复杂的系统。系统必须适应外部环境的变化，能够经常与外部环境保持最佳的适应状态，才能得以存在)1004.生物反应系统优化的基本思想:整体优化的思想，对所研究的对象采用定性或定量的模型优化技术，使系统整体目标最优1005.生物反应系统优化方法的原则主要有以下几个方面：(一)系统整体性原则:不能从系统的局部得出有关系统整体的结论；分系统的目标必须服从于系统整体的目标(二)系统有序相关原则:系统的有序性，是系统有机联系的反映，系统的任何联系都是按一定等级和层次进行的，都是秩序井然、有条不紊的(三)系统目标优化原则:优化问题是在不可控参数发生变化的情况下，根据系统的目标，经常、有效地确定可控参数的数值，使系统经常处于最优状态(四)系统动态性原则:系统优化是一个比较复杂的过程，研究对象内部复杂的相互作用和外部环境的多变性，使系统本身呈现出动态特性(五)系统分解综合原则：分解是将系统中具有密切相关关系的要素进行分组；综合则是完成新系统的筹建过程，即选择具有性能好、适用性强的分系统(六)系统创造思维原则：其一是把陌生的事物看作熟悉的东西，用已有的知识加以辩识和解决；其二是把熟悉的对象看作陌生的东西，用新的方法、新的原则加以研究，从而创造出新的理论，新的技术。100生物反应系统示意图1006.生物系统介绍：(1)生物产品合成的能量(ATP)或辅因子(NADH)再生系统(2)废水生物处理的厌氧─好氧组合处理系统(3)生物反应与产物提取的耦合系统(4)有机废水处理和有用物质生产的耦合系统100二.ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用1.ATP再生系统的定义及分类ATP再生系统可定义为一个需要ATP的生物酶反应系统与一个ATP生物合成系统所构成的耦合系统按底物的不同分类,ATP再生系统可分为:(1)转移高能磷酸基的反应系统(以高能化合物作为底物)(2)采用碳水化合物作为基质的反应系统(以碳水化合物和磷酸基团作为底物)利用碳水化合物为基质的ATP再生系统根据酶源的不同又可分为：(1)自耦合系统(2)种间耦合系统100自耦合ATP再生系统示意图100种间耦合ATP再生系统示意图1002.建立自耦合系统和种间耦合系统必须满足以下条件(1)用于合成产物的酶的活性必须足够强且稳定(2)能大量提供廉价、稳定的前体物质(3)再生ATP的活性足够强且稳定，能与生物合成酶反应成功地耦合(4)可以提供廉价的能量底物(如葡萄糖)和磷酸基团供体(如无机磷酸盐)以利于ATP再生(5)若有类似于分解反应的有害副反应，则必须对其加以控制(6)若底物或预定的产物不能透过细胞膜，则必须设法提高膜的通透性1003.两种系统的不同之处以E.coli作为合成酶活性的受体菌和具有较强ATP生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵母组合而成的种间耦合反应系统自耦合ATP再生系统只用到一种微生物，故该菌中必须同时具有需要ATP的生物合成反应的酶活性和再生ATP的酶活性种间耦合ATP再生系统采用不同的微生物，一种作为ATP合成活性的供体，另一种作为与此相偶联的生物合成酶活性的供体1004.自耦合ATP再生系统（1）GMP(5'-鸟苷酸钠盐)生产过程XMP＋NH3＋ATP→GMP＋AMP＋PPi（2）ATP(腺嘌呤核苷-5'-三磷酸钠盐)生产过程葡萄糖→PRPP(磷酸核糖焦磷酸)腺嘌呤＋PRPP→AMP＋PPi产氨短杆菌同时具有PRPP(磷酸核糖焦磷酸)生物合成活性与ATP生物合成活性，可利用腺嘌呤为前体生产ATP(3)GSH(谷胱甘肽)的生产过程Glu＋Cys＋ATP→-GC(-谷氨酰半胱氨酸)-GC＋Gly＋ATP→GSH＋ADP＋Pi110谷胱苷肽的生物合成过程1105.种间耦合ATP再生系统（1）IMP(5'-肌苷酸钠盐)的生产过程Inosine(肌苷)＋ATP→IMP＋ADP（2）CDP(胞苷二磷酸)胆碱的生产过程氯化胆碱＋ATP→磷酸胆碱＋ADPCTP＋磷酸胆碱→CDP胆碱在（1）和（2）中均采用重组E.Coli和产氨短杆菌（3）GSH的生产过程，可采用两种系统：共固定化系统(S.cerevisiae和E.coli细胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝胶中)和混合固定化系统(S.cerevisiae和E.coli分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用)1106.ATP再生系统存在的问题除了合成产物所需的关键酶以外，细胞内还有许多种酶，其中一些具有分解活性，能将反应的底物和预定的产物转化为副产物微生物细胞具有很强的自我保护功能，作为渗透屏障的细胞膜可防止胞内物质渗出。但当细胞用作酶源时，这种屏障就会阻碍底物和产物进出细胞1107.解决ATP再生系统存在问题的办法抑制副反应的方法对于具有分解、转移底物或产物为副产物的酶，可通过选育缺失该酶活性的突变株，或优化反应条件使副产物的形成降低到最小的限度提高膜通透性的方法干燥细胞或用溶剂、表面活性剂处理细胞都可以提高细胞膜的通透性110缺点：固定化操作较为繁琐研究由固定化细胞组成的ATP再生系统生产有用物质的过程，仍是这一领域今后的发展方向（3）固定化微生物细胞的方法该法具有以下优势∶①不需要提取和纯化酶的过程；②细胞可以重复使用；③可以实现连续操作；④反应器占地小；⑤反应控制容易；⑥要处理的液体体积小；⑦可以获得高纯度产品；⑨工厂污染减轻110三.有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合系统合成塑料污染的主要特点是∶(1)污染范围广。江河湖泊，田野山川无处不有(2)污染物增长量快。全世界每年对塑料的需求量为1亿吨。由于价廉、易老化，塑料用量的增加导致其废弃物也迅速增加，倾入海洋的塑料垃圾达数十万吨，陆上的更是难以计数(3)处理困难。塑料具有耐酸碱、抗氧化、难腐蚀、难降解的特性，埋地处理百年不烂；燃烧时产生大量有毒气体，如HCl、硫氧化物、碳氧化物等(4)回收利用难。塑料制品种类繁多，难以分拣回收(5)对生态环境危害大。地膜降低耕地质量，农作物植株矮小，抗病力差；残膜随风飘动，对周围环境、畜牧业、养殖业都有很大的影响110生物可降解塑料的特点：PHAs作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，更重要的是其还具有生物可降解性和生物可相容性。已有研究表明，采用PHAs制作的香波瓶，在自然环境中9个月后，可基本上被完全降解，而用合成塑料制作的同样物品，完全降解的时间约需100年聚羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkoates，简称PHAs)是生物可降解材料的一个研究热点。其中聚--羟基丁酸(简称PHB)及3-羟基丁酸与3-羟基戊酸的共聚物(简称P(3HB-co-3HV)或PHBV)是PHAs族中研究和应用最广泛的两种多聚体110有机废水的资源化处理有机废水是地球环境的一大污染源，但同时也是一种资源，近几十年来，有机废水的资源化技术发展极其迅速，已被认为是消除有机废水污染的最经济有效的途径之一用于高浓度有机废水处理的厌氧消化技术，自20世纪50年代以后得到了迅速发展，先后出现了厌氧滤池(AF)、上流式厌氧污泥床反应器(UASB)、附着膜厌氧膨胀床反应器(AAFEB)、厌氧流化床反应器等，其中UASB的应用最为广泛该反应器能培养并保持大量活性高、沉降性能好的颗粒污泥，因而反应器的处理能力大大提高，水力停留时间大大缩短110有机废水的厌氧处理有机废水的厌氧发酵过程是一个复杂的有多种微生物类群参加的生物化学过程，通常可分为酸性发酵阶段(产酸)和甲烷化阶段(产甲烷)两阶段产酸阶段主要是有机废水中复杂的大分子有机物在厌氧条件下被水解和产酸细菌发酵成为有机酸，如丁酸、乙酸、乳酸和丙酸等。此阶段的细菌种类多，代谢能力强，繁殖速度快。产甲烷阶段主要是产酸阶段产生的小分子有机酸被产甲烷菌利用转化为甲烷110不同研究者的厌氧发酵产物120有机废水处理和PHAs生产耦合系统理论依据是∶有机废水在厌氧处理过程中，产酸微生物能将废水中生物可降解的大分子物质转变为小分子有机酸，如乙酸、丙酸、乳酸、丁酸以及其它可溶性小分子化合物真养产碱杆菌在好氧、碳源充足、贫氮的条件下能利用有机酸在胞内大量积累PHAs将有机废水酸化反应器与PHAs发酵罐相组合，可使酸化反应器为R.eutrophus提供相对稳定、较佳的底物，从而在发酵罐中相对廉价地生产出PHAs120有机废水生产PHAs的主要研究内容1.有机废水生产PHAs的初步条件；2.R.eutropha发酵生产PHAs最佳有机酸种类的确定，包括以有机酸为底物生产PHAs的代谢机理、理论产率和PHAs发酵的实际产率；3.高效厌氧酸化工艺，包括酸化率达100%时有机酸分布的工艺学条件等；4.在小型发酵罐中，以不同浓度的酸化废水为碳源进行分批发酵实验，在对PHAs发酵过程动力学分析的基础上，建立较为合理的PHAs发酵过程动力学模型；5.进行了有机废水生产PHAs流加发酵的初步研究，比较了分批和流加发酵过程中丁酸对PHAs产率的变化120有机废水酸化和PHAs生产耦合系统①进水池②泵③UASB酸化反应器④出水池⑤分离浓缩系统⑥浓缩的有机酸⑦PHA发酵罐1201.有机废水生产PHAs的初步研究有机废水生产PHAs是指R.eutropha以有机废水厌氧酸化的产物为生产PHAs的基质在一定温度下，影响有机废水酸化的主要因素：(a)水力停留时间(HRT)(b)pH值(进水碱度)120酸化阶段HRT对发酵阶段PHAs浓度的影响进水碱度对发酵阶段PHAs浓度的影响1202.R.eutropha利用不同有机酸生产PHAs的比较研究目前研究采用的PHAs生产方式通常有两种:一种是一步发酵法，即细胞生长与PHAs积累相偶联；另一种是两步发酵法，即微生物生长和PHA积累分两阶段进行，第一阶段细胞大量形成，第二阶段细胞基本不繁殖而PHAs大量积累，这种方法需进行菌体的离心收集120(1)一步发酵法生产PHAs采用不同工艺对有机废水进行厌氧酸化，可得到以乙酸、丙酸、乳酸或丁酸等为优势产物的酸化废水。R.eutrophusWSH1对不同酸的利用**初始酸浓度为10g/L，分别在19h、25h、32h、43h、50h加入5g/L的酸127(2)两步发酵法生产PHAs4种有机酸的初始浓度采用10g/L，并分别在发酵的19h、25.5h、32.5h和43h补充加入2.5g/L的酸。PHAs合成阶段初始细胞干重为3.3g/L，细胞中无PHAs积累128(3)R.eutrophaWSH1利用混合酸发酵PHAs初始酸浓度10g/L(乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各2.5g/L)，发酵41h和57h分别加入8g/L的混合酸(乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各2g/L)结论：在生长和合成PHAs阶段对有机酸的利用顺序皆为丁酸>乳酸>丙酸>乙酸1293.有机废水生产PHAs的机理研究(1)废水中大分子物质转化为小分子有机酸厌氧微生物己糖降解最重要的代谢途径是EMP和HMP途径，先生成丙酮酸，然后形成挥发性有机酸、乳酸等。控制不同酸化条件，可以使不同的有机酸成为主要酸化产物。代谢方程分别为∶C6H12O6+4H2O→2CH3COO-+2HCO3-+4H++4H2C6H12O6+2H2→2CH3CH2COO-+2H2O+2H+C6H12O6+2H2O→CH3CH2CH2COO-+2HCO3-+3H++2H2C6H12O6→2CH3CHOHCOO-+2H+130(2)有机酸合成PHAs的代谢途径R.eutropha利用小分子有机酸合成的PHAs主要为聚羟基丁酸(PHB)、羟基丁酸和羟基戊酸的共聚物(PHBV)以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸为碳源时PHAs的合成途径:131132(3)不同有机酸对PHAs的产率与理论产率的比较不同有机酸对PHAs的产率与理论产率的比较在一步发酵法中，由于所消耗的有机酸有一部分用于合成细胞的合成，因而四种有机酸对PHAs的实际产率均小于两步法，但它们对PHAs和细胞的产率之和却大于两步法的产率133(4)产酸相产物分布及其影响因子的研究(a)HRT对酸化产物分布的影响HRT对酸化产物分布的影响134(b)不同pH条件下UASB反应器出水产物分布1354.不同初始酸浓度对PHAs发酵过程的影响当硫酸铵浓度为1.5g/L时，初始酸浓度在20g/L左右较佳136丁酸消耗速率大大超过乙酸和丙酸的消耗速率,当初始酸浓度为5、10、15、20和25g/L时，最终发酵液中残留的丁酸浓度为∶0、0.01、0.16、0.58和3.81g/L137PHAs浓度的变化残留细胞量随时间的变化初始酸浓度:○5g/L;□10g/L;△15g/L;20g/L;◇25g/L1385.PHAs分批发酵动力学(1)细胞生长动力学139(2)PHAs形成模型1406.以有机废水酸化产物为底物进行PHAs流加发酵（1）流加发酵过程曲线将UASB出水中的总有机酸浓度浓缩至150g/L左右，进行PHAs生产的流加发酵，发酵结果见图141(2)酸化废水发酵过程中丁酸对PHAs的产率变化142四.生物反应与产物分离的组合系统生物反应与产物分离的组合系统也称为原位(insitu)产物分离过程或提取生物转化，即在生物反应发生的同时，选择一种合适的分离方法及时将对生物反应有抑制或毒害作用的产物或副产物选择性地从生产性细胞或生物催化剂周围移走生物反应与分离(或分配)相组合的技术选择性地从培养液中连续分离有抑制性、有毒性或不稳定性产物，或者将底物以一种可控的方式添加到培养液中，对生物反应过程都能产生极大的促进作用143生物反应与产物分离组合系统的特征耦合过程作为一种新的反应工程技术，可适用于各种生物反应过程耦合过程是一种集成式单元操作，其生物反应器具有特殊的结构实现产物及时分离的方法有很多，但必须考虑产物的特性及具体的生物反应体系来合理选择和设计144分离技术选择原则考虑工程及经济因素，理想的分离技术应当是操作费用低、性能稳定、工程上易于实现的技术分离技术应当具备生物相容性，适宜的分离技术应当对生物反应不造成负面影响，不会造成生物催化剂或细胞的失活、变性和死亡，也不会改变生物反应的代谢和调节机制；应当考虑产物或副产物物理化学特性和生物学特性；考虑系统的流体特性，因为流体力学性质决定并影响分离过程的传质，从而影响分离的容量和速度，如高粘度的非牛顿型流体就不能用膜分离技术；1451.随程溶剂萃取内部随程萃取是指萃取剂在反应器中与培养基直接接触，以便将产物萃取到溶剂中去例如，在利用帚状地霉发酵生产酯类风味物质的研究中，内部溶剂萃取技术得到了很好的应用内部溶剂萃取的特点是∶溶剂和液相混合均匀，因而有利于传质的进行；但溶剂也可能在培养液中形成稳定的乳化作用，这对溶剂与产物的分离不利146外部随程萃取是指萃取剂和培养液在反应器外的萃取装置中逆流接触，从而萃取产物的过程用这种方法可以减轻内部溶剂萃取中的乳化问题假如用己烷进行内部溶剂萃取时，因为在发酵系统中加入挥发性溶剂，会导致传氧困难，即便细胞处于产物合成的旺盛期也会减少产物的生成，即所谓的“相毒性”(phasetoxocity)。外部随程萃取则不存在这一问题，在外循环中多余的溶剂可用气体抽提去除，若细胞对溶剂敏感，还可在微量溶剂回流反应器前进行脱气处理1472.渗透萃取例如，在丙酸、乙酸和乳酸的发酵生产中，利用渗透萃取技术可降低产物对微生物的毒害作用，从而大大提高发酵水平渗透萃取是一种基于膜技术的萃取系统膜技术在萃取中具有能够增加传质面积和降低乳化程度及减轻溶剂对微生物的毒害作用的优点Solichien采用氧化三辛基膦(TOPO)与煤油的复合体系作为溶剂，由于萃取剂和培养液被膜隔开，萃取剂对细胞的毒性有所降低1483.渗透蒸发Susumu等人采用聚二甲基硅氧烷中空纤维膜(PDMS－HF)结合氮气作为载气，可从水相中连续分离乙醇和异丙醇渗透蒸发技术具有分离因子高、操作费用低、对膜结构的无限制性及操作时具有较高的机械强度等优点例如，在乙醇生产中，渗透蒸发是将乙醇从发酵液中连续分离的最有效手段，由于降低了产物抑制和分离操作费用，生产率得以显著提高1494.其它生物反应与产物分离技术(1)气体抽提(2)吸附(3)结晶(4)层析技术(5)电渗析(6)动电技术(7)受控底物分配(8)在酶学上的应用1505.生物反应与产物分离组合系统的发展趋势新的分离技术不断出现，主要体现在:新的选择性更强、生物相容性更好的生化分离方法的开发和应用(如基于分子识别的分离方法)；将传统分离技术组合使耦合系统的选择性更好、效果更理想，如前面介绍的膜技术(1)目前的研究更加深入和细化，包括:有抑制或毒害作用副产物的选择性分离；选择性地供给营养底物；不可发酵底物或老龄化细胞的分离151代谢工程一、代谢工程概述代谢工程的基本理论及应用策略的形成：对于发酵工业和人类的经济活动来说，活细胞这种自身固有的代谢网络的遗传特性并不是最佳的。为了大量积累某种代谢产物，就必须打破微生物原有的平衡状态，这就需要对细胞的代谢途径进行修饰。微生物细胞在代谢繁殖过程中，经济、合理地利用和合成自身所需的各种物质和能量，使细胞处于平衡生长状态。152随着基因工程技术的飞速发展，利用基因克隆改变代谢流，扩展和构建新的代谢途径，尽可能最大限度地提高目的代谢产物的产率，已取得令人瞩目的成果。3.现代发酵工业通过以代谢控制发酵理论为指导，应用基因突变来改造微生物原有的调节系统。由于该工程在很大程度上依赖于传统的化学诱变技术及设计精巧的选择程序，因此手段单一，结果不尽人意。153代谢工程的第一个应用实例：1974年，Chakrabarty在假单胞菌属的恶臭假单胞菌（P.putide）和铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）中分别引入几个稳定的重组质粒，增加了两者对樟脑和萘的降解催化活性。这标志着代谢工程作为一门学科的诞生。154一般定义：通过某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性或运用重组DNA技术来创造新的化合物。代谢工程的定义：具体定义：代谢工程是应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的基因操作，以改变微生物原有的调节系统（酶的功能和输送体系的功能、甚至产能系统的功能），通过有目的地对细胞代谢进行修饰（功利性修饰）以改变细胞某些方面的代谢活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢获悉功能的实现），从而达到实现目的代谢活性的提高这一预期目标的一个崭新的领域。155代谢工程注重酶学、化学计量学、分子反应动力学以及现代数学的理论及技术为研究手段，在细胞水平上阐明代谢途径与代谢网络之间局部与整体的关系、胞内代谢过程与胞外物质运输之间的偶联以及代谢流流向与控制的机制，并在此基础上通过工程和工艺操作达到优化细胞性能的目的。代谢工程的研究手段代谢工程中的遗传手段可以采用基因工程技术，也可以采用常规诱变育种技术，但前者有机会引进外源基因和外源调节因子，这同传统的改良菌种的遗传方法不同。代谢工程通过对特定的生化反应的遗传基础进行修饰或用重组DNA技术导入新的生化反应来改进蛋白质分子的性质。156　对代谢流量及其控制进行定量分析的方法与用来实现预期的遗传修饰的分子生物学技术的结合，对代谢网络进行定量分析，并在此基础上进行代谢改造（代谢网络重构），以最大限度地提高目标产物的产率。代谢工程的实质157代谢工程所要解决的问题是什么呢？代谢工程要解决的主要问题：改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质流在不同途径中的流量分布158典型目标是：修饰初级或次级代谢，将碳架物质流导入目的产物的理想载流途径以获得产物的最大转化率159具体表现为：①提高细胞现存代谢途径中目标产物的产量；②改造细胞现存代谢途径，使其合成新产物，这种新产物可以使中间代谢产物或修饰型的最终产物；③对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新产物；④优化细胞的生物学特性，如生长速率、某些极端环境条件的耐受性等。160代谢工程设计的主要内容包括：①生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；②代谢流的定量分析；③代谢网络的重新设计；④中心代谢作用机理及相关代谢分析；⑤基因操作。161代谢工程关注的最多的是代谢途径的组合而非单一的反应。完整的生化反应网络就是代谢工程必须要考察的，重视代谢网络和目标产物的热力学可行性、代谢流及其控制。代谢工程的精髓在于其从传统的单一酶促反应分析向相互作用的生化反应系统转移，更强调了代谢网络的概念，也只有这样，生物体代谢活动和细胞功能的图视效果才能被强化。162代谢工程的原理与方法是在基于功能基因组信息重建的代谢网络系统分析的基础上采用DNA重组技术改造细胞代谢系统。主要包括关键的三个步骤：（1）是合成(synthesis)---即性能改进的重组菌的构建；（2）是分析---即重组菌的代谢途径分析，特别是其性能与原菌种性能的比较；（3）是设计---即为下一步基因工程的目标进行设计。163代谢工程原理与方法164代谢工程最为突出的特征就是强调生化反应途径与代谢流及其体内条件下的控制相关联。将代谢流的定量分析方法与代谢流控制的分子生物学技术结合在一起，系统、合理地修饰生物细胞的遗传性状是代谢工程的基础。165代谢工程的一个基本目标就是阐明代谢流控制的因素和机制，可以说对代谢流控制的全面理解是代谢网络修饰的基础166系统研究代谢流及其控制机制包括以下三大基本步骤：①建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测定其流量的方法。　通常从测定细胞外代谢产物的浓度入手进行简单的物料平衡。由于一个代谢途径的代谢流并不等于该途径中一个或多个酶的活性，所以酶法分析并不能提供代谢网络真正的代谢流信息，除非相应的酶在体外分析条件下存在并具有活性。167②在代谢网络中施加一个已知的扰动，以确定在系统松散之后达到新的稳态时的代谢流。常用的扰动方式包括启动式的诱导、底物流加、特定碳源消除或物理因素变化等。任何有效的扰动对代谢流的作用都是可以接受的，但扰动必须定位于紧邻途径节点的酶分子上。一种扰动往往能够提供多个节点上的相关信息，这对于精确描述代谢网络控制结构所必需的最小实验量是至关重要的。168③系统分析代谢流扰动的结果。如果某个代谢流的扰动对下游代谢流并未能造成可观察的影响，那么就可以认为该处的节点对上游的扰动式刚性的，相反则成为柔性的。一般地，在刚性节点处，不能通过改变上游酶活性来影响下游代谢流。除了上述对代谢途径的物质流和能量流进行分析外，代谢工程还包括信息流分析，如信号转导途径等。随着分子生物学研究的不断深入，生物体内各种形式的信号转导途径作用机制目前已得以阐明，从而形成了代谢工程新的分支----信号转导代谢工程。169在研究方法和技术方面它有三大常用手段：①检测技术。常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，这包括：体内确定代谢流的物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反应进程和性质的酶促反应动力学分析方法；测定同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的光谱学方法，如核磁共振、质谱、液相色谱分析和气相色谱分析等；生物传感器技术。170②分析技术。在获得大量生化反应基本数据的基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法