控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控

控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及激素调控第三部分在不定根原基起始分化初期,参与原基起始细胞分裂及细胞分裂周期的标记基因表达的LMc半定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 1.材料与方法1.1材料水稻:粳稻中花一11,arll突变体1.2方法1.2.1材料准备:水稻种子,放于培养皿中,37OC黑暗下浸种至露白(24h),然后转移至湿润滤纸上30/c培养d1:将发芽的种子移至装有自来水(pH5.0)的塑料槽尼龙纱网上,生长条件同本章第一部分"生长3d取稻根茎结合部0.5一1.Ocm,固定"1.2.2LeM(Laser一eaptureMierodisseetion)分析4天苗龄的水稻根茎结合部0.5一,.Ocm:在EAA溶液(酒精;冰醋酸二:31)中4e固定过夜"然后由低浓度到高浓度的乙醇(50%!70%!85%!95%!和100%)逐级脱水!二甲苯透明!浸蜡(用52e低熔点石蜡,sigma一Aldrihc,Gemrna)和包埋T(kagai等.,2004;Shibutnai等.,2000)"样品切成7pm厚,置于HistoGeneLCMslide(Areturus,CA,USA)上,用DEPc水37e展片,烘干的切片用二甲苯脱蜡后(分2次,每次10分钟),立即用Pix一eell11LCMsystemA(crturus,MountainView,CA,USA)进行激光捕获(Kekr等,.2003,Nkaazono等.2003)"用PieopureRNAisolationkit(Aiuturus,CA,USA)从捕获到的细胞中提取胭A"再用Ribogreenreagent(Moleeularprobes,Eugene,OR,USA)分别测定从野生型植株中柱鞘的不定根原基发生区域和非发生区域及arlj突变体相应的区域组织5000个细胞中提取的总RNA浓度"参照几boAmpKit操作说明(1tl切://www.areturus.eom),每个样品取98.2ng总RNA用形boAmpKit进行逆转录和第一轮扩增"PeR反应条件:94oe,4min;[94oC,45see,61oC:45see,72oC:lSec8x30循环"相关基因的引物序列:O3.SRC(508bP):UPS.ACCGGGCAGAACTCGAATGGCAATCC3.Lows.CGGAGTCGGTGAACGCGGACAACCTC3.QHB(900bP):Ups.ATCCCGGAAGAGACCAAATCAGA3.Lows.TAGGACTAGGCACAGCGACAAGAG3.图3.月几1基因启动子::GUS融合转基因分析Figuer3.ALRIPormoet-rdrivenGUSexPerssioninvaroustissues.FormAtoJ:lemmatiPs(A),lemmavein(B),PdeieelofyoungPnaicle(C),aurical(D),baseofleafbldae(E),vaseularyclindertissueofPrimyarorotnad!aetarloorst(F),orottiP(G)nadvaseulartissueofnahter(H)rachisnadPrim脚acrhisbnarehes穗轴与一级枝梗连接处(I)minorveins(J,横向的小叶脉)FromKto,0cross一seetionsofdaventitious;ootPrimodriaatfi邝tnode(K),seuetllum(L),younglatearlorot(M),vaseulareylinderofseminalorot困)nadlaetarlorotprimodriumof7d一oldseedlings(o)(K图B护Zooum,M和o中b护50um,N,b犷100um)控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控2.2参与中柱鞘不定根原基起始细胞分裂的标记基因表达分析图5汤四,以,5.c冲君反彭网万基因在不定根原基起始细胞分裂阶段的表达分析(Wt一P=野生型原基部位,a厂11,二突变体类似原基部位.30cycles)Fi即re5.T一PCRanalysisfortheexpressionsof嵘扮双免6艺万and免六月穷inperieyeleeellsadjaeenttoPeriPheralvaseulareylinderinwildtype(WT)andarllmutantplants图6.几个细胞分裂周期标记基因在不定根原基启动初期的表达比较"(DcNA来源:Wt一=P野生型原基部位:Wt一Pn二野生型非原基部位;arll一书交变体类似原基部位.30eyeles)水稻级公(Z巧艺劫霓一typehomoebox基因)和056艺刀基因都在不定根原基启动时最早发生平周分裂的细胞中表达(Kmaiya等,2003)"-25.NAsl基因在正常生长条件下只在中柱鞘细胞特异表达而在其他周围细胞都不表达(工noue等,2003)"用Laser-CaptureMscrodisseetion(LCM)Samplingassay(图4)分别从4天苗龄野生型不定根原基发生区域和突变体相应的区域提取MiniRNA,逆转录后进行RT一PCR分析"结果表明,酬扭和免及沂都在野生型中柱鞘原基部位细胞表达而在arn突变体相应的区域不表达,而口,划夕石中柱鞘细胞的标记基因)在野生型和arn突变体中都表达证实从野生型和突变体分离的样品中确实存在中柱鞘细胞(图5)"这表明突变体中柱鞘不定根原基起始细胞的平周分裂受阻"控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控2.3细胞分裂周期标记基因在不定根原基启动初期的表达分析.我们选了几个细胞分裂周期标记基因(LorbieekeR.,等1999):eyeA(S一GZ期):cycBG(2一M期),05cdcZ一3,迅G(:一S期),H3,盘cdcZ一了和oscdcZ一S(期),用LCM-RT一PCR方法,对这些基因在不定根原基启动初期的表达比较进行了析"结果(图1一6)表明:只有cyAc在突变体中表达较弱"因此,推测ARI了基因的突变会引起不定根原基起始细的平周分裂在S一GZ期受阻"控制水招不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控第三章水稻通五21基因的表达与激素调控1材料与方法1.1材料水稻:粳稻中花一11号,arll充更萍植物激素:IAA,NAA,6一BA(6一benzylmainopurine),ABA,GA3,乙烯丰(EthePhon)激素抑制剂:NPA,NBD(Sigma公司)".蛋白质合成抑制剂:e肛(eyeloheximide),ealbiChem,USA生产1.2方法1.2.1水稻培养及各种激素处理方法1.水稻水培法:野生型水稻种子用蒸馏水洗净,放于培养皿中,37e黑暗条件下浸种至露白(d1),然后转移至湿润滤纸上30OC培养2天;将发芽的种子移至尼龙纱网上,自来水生长d4后,进行各种激素处理,处理时间分别为0,0.5,2,6,12,24小时,分别取根茎结合部(1.scm)和根部,所有样品于一70e冷冻保存以备RNA提取"2.水稻0.8%琼脂培养法:将:rll突变体和野生型种子去壳,再依次经过7k00的酒精消毒1分钟,0.%1的氯化汞消毒10分钟,无菌水冲洗5遍,在滤纸上凉干,转入含不同浓度的植物激素(工AA,GA3,6一BA,NAA,eth即hon)的0.%8的琼脂培养基上,放置到组织培养室中生长"生长10天后,将幼苗从琼脂培养基上取下,进行根系表型数据分析"每个处理有10个重复"统计处理方法:SAS软件.控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及徽素调控ARLJ(802bP)UPS.GAAGAAGAAGCGGCGGCCAAGATGAC3.Lows.CTTACGAGCGGTTAAGGTAAGCGTAGGCGA3.05入乙哎SJUPS.CTCGCCCGCTTCCCGTACTA3.Lows.ACCGCCAGAACGTCGAACC3.OSedCZ一3:RIC它ACti月228PbUPS.ATCCCTACTTCAACGACGTG3气Lows.GTCGAATTCTTAAGTCATTACTCATT3.UPS.GGAACTGGTATGGTCAAGGC一3.LoWS.AGTCTCATGGATACCCGCAG一3.2.结果与讨论我们在第一部分,已经分析A几/基因的mRNA原位表达和GUS蛋白表达"在原基启动分化期,A几1在wt整个原基都表达而在日川I中不表达"由于在光镜下,看不到原基的细胞形态的发生,所以不能判断ARLI基因的突变会引起突变体中原基起始细胞分裂终止在细胞分裂周期的哪一步,为此,我们利用LCM一RT一PRC技术,获取不定根原基起始细胞产生的特定区域细胞群的miniRNA,对细胞周期的几个标记基因和参与中柱鞘不定根原基起始分裂的标记基因进行了野生型与arn突变体的比对分析"2.1.L以显微捕获的过程LCM显微捕获的近中柱鞘不定根原基发生区域和非发生区域及arll突变体相应的区域细胞的,4000个细胞,提取总RNA样品,重复两次"控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控激素及抑制剂溶液母液配制方法:溶解方法加碱溶解(MIN0aH),再用蒸馏水定容加稀碱(同上)或盐酸溶解,再用蒸馏水定容加DMSO溶解,再用蒸馏水定容无水酒精溶解,再用蒸馏水定容蒸馏水溶解,定容MDSO溶解,定容石油醚溶解,定容蒸馏水溶解,定容母液浓度10尸材10冬绷10户材10禅M150尸M10户M100ml/L30尸M匕食A一q3八AAAB听认A一n口Ak以六c侧曰户0ATkl工EthePheADTlPRqU曰NM曰产七各激素及抑制剂梯度实验设计如下:激素终浓度(尸M)CH10,10,20,30NPANBD0,0.5,1,O,1,5,10,0,0.01,0.5,10,20200,0,5,10,150.5,0.8,l,10,30,1002,3,AACjNAAIAG5,1010,100,150,200nU八U.月q只Uk11一-L只Ub匕ABAO,1,3,5各激素添加抑制剂梯度实验处理设计如下:处理Eth+CHINAA+CHINAA+NBDNAA+NPAGA3+NBDGA3+NPAEth+NPAEth+NBD终浓度(刚,NBD单位ul/L)150+201+201+10n口,.一门土曰l主+十+1-一,.上1上150+1150+10控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控1.2.2RNA提取采用Triozl法提取RNA,操作流程如下:(1)研钵加液氮数次至足够冷,加入样品,研磨至粉末"加入Triozl(每1oomg组织加lml的Trizol),充分研磨,放在室温下解冻"(2)除不溶性物质:2一osC下12000Xg离心10mni,不溶性物质沉淀,将RNA的上清移入1.5ml离心管中"(3)相分离:在巧一30e下放置smni,使核蛋白复合物完全解离"加0.2ml氯仿,剧烈振荡15see,室温下温浴2一3min"2一8e下,(12000xg离心15min,RNA全部溶解于上层水相中,把水相移入另一1.5ml离心管中"(4)氯仿再次去杂质:O,5ml氯仿,剧烈振荡15Sec,室温下温浴2一3min;2一8e下,蕊1200OXg离心15min,把水相转入1.5ml离心管中"(5)RNA沉淀:加入0.sml异丙醇,15一30C0温浴10min;2一sCo下,蕊12000Xg离心10mni,RNA沉积在离心管的底部及侧壁"(6)清洗RNA:加入lml75%乙醇,2一8e下蕊750oXg离心smin,小心将上清液倒掉"(7)再清洗:加入lml75%乙醇,2一8e下,蕊7500Xg离心smin,小心将上清液倒掉"(8)RNA的溶解:将离心管倒扣在吸水纸上5一1Omin,每管加30pl的DEPC水,可在55一60C0下助溶IOmin"(9)尺NA浓度:用DEPC水稀释100倍,用紫外分光光度计(D"640,Beekman)测定OD值,估算RNA浓度"1.2.3RT一PCR混匀下列试剂"Cockati:l41sxFirststrandbuffer(Invitrogen公司)21O.IMDTT(Invitrogen公司)412.sMmDntp(Takara公司)11Rasin(4Ounit/件1)(Pro;:ega公司)共11闪,稍离心,置冰上;控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控1.5ml的离心管中加入5拼g的RNA,1林1的01190(dT),"(Promega公司),及一定体积的DEPC水,共8时"在70e水浴中加热5分钟,后在冰上冷却,稍离心;加入Coektai1A,混匀后42e反应2分钟;加1协1逆转录酶SuperSCriptRTll(Invitrogen公司),用枪头混匀;将管子置于42e空气浴中反应1小时;1小时后,70e反应巧分钟,终止反应;放置在一20e冰箱中保存"1.2.4GUS染色方法(见第二章第二部分)控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控2结果与讨论2.1arll对植物激素的反应及月左21基因表达根据汉尺刀基因启动子序列分析(表l),发现有A舒(auxinresponseafetor),生长素,乙烯和赤霉素和脱落酸等的反应元件,说明这些激素都有可能参与ARL了基因表达调控"植物激素的作用具有剂量效应"同一个激素不同的浓度可能有完全相反的作用"为此,我们首先进行了各激素的浓度梯度试验,以确定适合的浓度"根据已有的报道和激素的一般使用浓度范围,确定了5种激素浓度梯度实验范围:见方法"根据我们的实验结果,在供试的个激素浓度范围内:只有外源添加NAA(IAA),EhtePhon:讨论突变体arll对Q处理会对水稻不定根的生长和数目产生显著影响"所以,下面重点一AA(IAA),EhtePhno这三种激素的反应"表1ARLI基因启动子上的激素反应元件Table1.HormoneresPonsiveelementsexitinthePromoterofARLIFaetororsltename5ite(strand)ElementACGTABREMOTIFAZOSEM1762(+)ACGTGKCARFAT191(+)TGTCTCASFIMOTIFCAMV1618(+)TGACGDPBFCOREDCDC3782(+)ACACNNGERELEE41897-()AWTTCAAAGADOWNAT1762+()ACGTGTCGAREAT512(一)TAACAARGCCCORES(+)GCCGCCRYREPEATBNNAPA1679(一)CATGCASEBFCONSSTPR10A190(+)YTGTCWCWRKY71OS1617(+)TTGACABA一resPonsiveexPressionARF(auxinresPonseafctor)2auxinando/rsalieylieaeidZABA4ERE(ethyleneresPonsiveelement)GA一downregulatedGARE(GA一resPonsiveelement)ethylene一resPonsiveelementABAauxinresPonseelementZgibberellinsignalingPathwya72.1.la厂21突变体对不同植物激素的反应为了检测盯n对植物激素的反应,我们将arll突变体和野生型种子去壳,再经过0.1%的氯化汞消毒10分钟,无菌水冲洗5遍,在滤纸上凉干,转入含不同浓度的"一蔡乙酸("一NAA,a一npahthylaceticacdi,是一种人工合成的生长素)!叼!睬乙酸(IAA,3-indolemaeetieaeid)和乙烯丰(2一Chlorethanephosphorieaeid,ethephon,乙烯丰能产生乙烯,促进水稻不定根的生长)(Lorbiecke和Sauter,1999).的0.8%的琼脂培养基上,放控制水稻不定根原基形成的关键基因月RLI的表达及激素调控置到组织培养室中生长"生长10天后统计植株主根的长度,侧根形成的百分率和每株的不定根数"1!生长素由于生长素有好几种,它们的生理作用略有不同,我们选了两钟:NAA(人工合成)和IAA(天然提取)"表2显示:用a一NAA和IAA处理,野生型植株不定根的数目,随着浓度的增加而增加,NAA和IAA浓度分别达到1.0和10林M时,不定根的数目分别极显著地增加了51%和47%,随后下降,高浓度的"一NAA和IAA对不定根的发生有抑制作用"而种子根及侧根的生长都不同程度的受到抑制"当"一NAA和IAA浓度分别达到0.1件M和1附以上,极显著地抑制种子根的生长(表4)"在1一100件M范围内,IAA对侧根生长没有抑制作用",当"一NAA浓度达到0.8林M以上对野生型侧根生长有极显著的抑制作用,.arl了突变体同野生型植株有类似表现,对生长素更加敏感(表3)".2EhtePhon从表5可看出:10拼M以上的乙烯丰对arll突变体和Wt的主根生长均有抑制作用,并且随浓度的增加抑制会越大"乙烯丰对野生型植株不定根的有明显的促进作用,150卜功诬乙烯丰效果最显著"乙烯丰在10一200尸M的浓度范围内,并不能恢复arlj突变体不定根的生长(图2)"另外,乙烯丰对arll突变体和Wt的侧根生长都没有明显的影响,(相关数据未列出)"表2.外源生长素处理对水稻不定根数发生的影响Table2.EeffetofExogenousAuxinTreatmentonCrownRootFomrationaPlantNAAConeentration(卜峋00.010.10.50.81.010WildytPe5.1士0.54.9士0.55.3士0.57.0士0.7*7.3士1.4**7.7士1.0**0.0士0.0a川10.0士0.00.0土0.00.0士0.00.0士0.00.0士0.00.0士0.00.0士0.0ALAConeentration(林哟WIId刁厂了1ytp6士10士0.305105.9士0.97.5士0.80.0土0.00.0士0.015301007.3士0.9**6.5士0.7**5.6士0.80.0士0.00.0士0.00.0士0.015.0aDatarePresentthemeans士SEof10Plantsineaehline二Statistieallysigni月acntdjefferneesareindieatedatthes%(*)andl%(**)ProbabilityIeVels(Dunnett.5wto一tailedtest).控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控2.1.2ar.11突变体对N.PA和NBD的反应为了弄清a一NAA和乙烯丰诱导水稻不定根的生长是由于它们的直接作用或通过其它激素的而起作用,我们进行了NPA(N一1一n即hthylphhtalmaciac记,蔡基邻氨甲酞苯甲酸,是一种生长素极性运输抑制剂),NBD(2,5一norbonradiene,2,5一降冰片二烯,是一种乙烯作用抑制剂)的添加实验"首先了以野生型,arll突变体为材料,进行了外源添加浓度梯度试验"结果表明,1.即M完全抑制了野生型的不定根生长,5.印MNPA完全抑制了侧根的生长,根生长失去向地性,地上部分弯曲"arll突变体与野生型植株有相同的表现(表6)"10拼LL一1NBD,完全抑制了野生型植株的不定根(图1),3林LL一,NBD则完全抑制野生型侧根的形成,突变体需要5林LL一,NBD才能完全抑制侧根的形成(图3)"1卜LL一,以上的NBD明显地抑制主根和茎的生长(图2和图4)"根茎结合部的切片分析(图5)表明,1.0林MNPA抑制了不定根原基的启动"而NBD抑制不定根的生长,并不抑制不定根原基的启动"表6外源NPA处理对水稻不定根!主根及侧根形成的影响Table6.EffeetofExogenousNPATreatmentonAdventitiousRoot,SeminalrootandLateralRootFormationandrieegrowth日NPAConeentration(闯)orgnaPlnat00.5151020For.ationWt5.0士0.52.7士2.0**0.0士0.0**0.0士0.0**0.0士0.0**0.0士0.0**arll0.0士0.00.0士0.00.0士0.00.0士0.00.0士0.00.0士0.0Wt9.0士1.56.8士2.17.0士1.54.5士0.7**4.1士1.1**2.3士0.6**口r月7.6士1.56.3士1.96.0士0.24.5士1.2**3.8士1.1**2.1士0.5**Wt100.0士0.055.6士52.721.4士42.6**0.0士0.0**0.0士0.0**0.0士0.0**arll100.0士0,066!7士57.750!0士70.7**0.0士0.0**0.0士0.0**0.0士0.0**ANR.RSIRL(%)aDatarePersentthemeans士s〔of10P.lantsineachIine.ForaIIstatiStiealanaIyses.analysisofvarianecwasusedtoeomPaerPlantsateaehauxineonecntration.Statistieallysigni行acntdiefferneesaerjndieatedatthes%(*)andl%(**)ProbabiliytIevels(Dunnett.5two-taildetest).制水稻不定根原基形成的关键墓因ARLI的表达及激素调控l21086420口Wt.arll`曰"a侧事名彩禽小州卜~Wt刁件-ar111山山_f!Ll,卜,.1卜...l.les.r;J左二nJ皿戴名彩侧隆挺浦O匕.一-门卜-门卜砧月居一-.{-013510NBD浓度(ul/L)图1不同浓度的NBD处理对水稻不定根数目的影响Figuer.1EeffestofNBDTreatmentonAdventitiousRootGorwlhIndCe3NBD浓度510(ul/L)图2NBD处理对水稻种子根生长的影响FigureZEeffetofNBDTeratmentonSeminalRootGrowthinriee连上9曰一日c曲1111llesOC八b`日"a铡事器余月圈州卜一Wt一门卜一arllWtar11一~匕一一.-!一llesieses卜!|LI月.卜1.|卜|l|厂l|l0NBD浓度(ul/L)013510NBD浓度(ul/L):入详;ILha01UnUnbllU`11c八U八U八曰q9自n以`洲甘户O连人O山`患兰求口名攘彩夏月彩州图3NBO处理对水稻侧根形成的影响"Fig一lre.3EeffetofNBDTreatntentonLatera于Gro!VthinRieelR00t图4.NBDFigure4.Gro认沈hin处理对水稻种呀茎生长的影响EeffetofNBDTreatmentonStemRICe.54控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控2.1.3普通切片分析为了确定各处理的原基发生的真实状态,我们对各激素或抑制剂处理d5的野生型植株苗的根茎结合部进行了AFA固定一石蜡一包埋一切片一染色等,最后在显微镜下观察原基发生情况"结果如图(图5)"特别值得注意的是,在第一茎节位上,处于相同生长期的Ethephona一NAA处理的要比野生型多出2一3个不定根原基,我们重复3次,结果很稳定"至于这些根原基的是整个生命过程中总数一定的前提下,提前发生的结果,还是确实多长出的,有待证实"不过,不定根受环境因素影响较大,不定根总数往往是不确定的"因此前,第一种可能性较大"初步的结论是,EthePhon和a一AA的处理,促进了不定根原基的形成"2.1.4arll突变体对植物激素与NPA或NBD的组合处理的反应通过上述实验,我们确定a~NAA!Ethephon的促进不定根发生的最适浓度分别为:1.0刚,150刚;NBD和NPA完全抑制不定根发生浓度分别为:10阻/L和1.0刚."我们进行了以下组合试验:1.Ehtephon(150协M)+NBD(10林讥)一目的是确定:NBD的抑制作用能否被外源的EhtPehon逆转?2.Ethephon(150刚)+NPA(1附)~外源的Ethephon是否通过a一NAA起作用?3.a一NAA(1刚)+NBD(10风/L)一外源的NAA是否通过乙烯起作用4.a一NAA(l刚)十NPA(1附)一NPA的抑制作用,能否被外源的NAA所逆转"结果如图6所示"NBD(10时/L)的处理,完全抑制了侧根和不定根的生长,同时茎主根变的很短和粗壮"但切片发现原基存在,只不过生长受阻;这与以往报道乙烯参与伸长生长相一致"从图6看出,1刚NAP单独处理(A)与NAA(1刚)+NAP(1刚)处理C()相比,虽然也失去向地性,但根上有侧根发生,因此,NAP的抑制作用,能部分被外源的NAA所逆转;NDB的抑制作用(D)不能被外源的Ethephon所逆转(E);Ethephon不是通过a一NAA而起作用(B);外源的NAA是不通过乙烯而起作用(F)"控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控表3.外源生长素处理对水稻侧根发生的影响(表中数据为:长有侧根的种子根的百分比)T曲le3.EffeetofExogenousAuxinTreatmentonLateralRootFormation/(%)NAAConeentration(卜M)Plant01WIIdytPe100.0arl]100.0100.0100.0100.0100.0AIAConeentration(林M)100.0100.0100.033.3**33.3**0.0**0.0**0.0**WIIdytPe口rll100aDatarePresentthemeans士SEof1OPlantsineaehIjne.Statistieallysigni石eantdieffreneesareindiactedatthes%(*)andl%(**)Porbabilitylevels(Dunnett.5wto一tajledtest).表4.外源生长素处理对水稻种子根发生的影响Tab一e4.Eeffctof血ogenousAuxinTreatlnentonSeedRootFormationaNAAConeentration(林M)Planto0.010.10.50.81.010WIIdytPe9.0士1.57.7士1.14.8士1.0**2.5士0.3**2.1士1.2**1.1士0.1**0.2士0.0**arU7.8士1.47.4士1.03.8士0.7**1.5士0.2**1.2士0.2**0.8士0.3**0.2士0.0**AIAConeentration(卜M)WildytPearll151015301003.2土0.4**2.6士0.6**2.3士0.4**2.5士0.2**0.7士0.1**0.6士0.1**4.0士1.2**2.9士0.6**2.7士0.7**2.3士0.1**0.9士0.3**0.5士0.1**aDatarePresentthemeans士SEof1OPlantsineaehline.StatistiacIlysigni石eantdieffreneesareindieatedatthe5%(*)andl%(**)PorbabilityIevels(Dunnett,5wto一tailedtest).表5.外源乙烯处理对水稻主根!不定根发生的影响Table5.EeffetofExogenousEthPonTreatmentonSeminalRootnadAdventitiousRootFormationandrieegrowth/EthephonConeentration(卿orgnaPlallto10100150200WildtPye5.0士0.5a厂210.0士0.0WildtyPe9.0士1.5日了了17.8士1.85.1士1.00.0士0.06.0士0.4*4.9士1.1*7.2士2.1*0.0士0.02.9士0.1**2.8士0.9**8.0士1.4**0.0士0.02.1士0.7**2.5士1.6**6.9士1.0*0.0土0.01.8士0.7**1.9士1.1**RRNL五曰QLJaDatarePresentthemeans士sEof10Plantsineaehline.ForaIlStatistiacIanalyses.analysisofvarianecwasusedtoeomParePIantsat0ethePhoneoneentratjon,Statistieallysigni行acntdieffrencesaerindiCatedatthes%(*)andl%(**)Probabjlitylevels(Dunnett.5wto-tai}edtest).控制水稻不定根原基形成的关键基因月RLI的表达及激素调控图6.NAA!Ethephon与NBD不[1NpA的组合试验"(wt处理10d统计,A:NpA(luM);B:NpA(lMu)+Ethephon(150uM);C:NPA(luM)+NAA(luM);D:NBD(10ul/L)处理:E:NBD(10ul/L)+Ethephon(150uM),F:BND(10ul/L)+NAA(luM)"2.2植物激素对刃五21基因表达的调控2.2.IA五21基因对植物激素的反应图7A到E:l刚a一NAA(B),150刚ethyphon(C),对野生型的不定根的形成有显著的促进作用,而1刚NAP(D)和10风L一,NDB(E)则完全抑制野生型的不定根的形成"相应的RT半定量结果(图7,L)显示,通过a一NAA,EthPehno和NPA处理,ARLI基因在根与根茎结合部的表达水平都上调,在根中表达水平上调明显要高于根茎结合部(图7L)"这4种处理都强烈诱导A几班根中的表达,而在根茎结合部,除了NAP,A几1基因的表达量与不定根形成的数量成正向的关系"这说明A几1基因是控制不定根形成的,并且是一个生长素和乙烯反应基因"NPA诱导ARLI基因在根茎结合区强烈表达,是由于这一区域包含有盾片(Scutelhim),这就与我们先前看到的盾片上GUS染色很深相一致(第二章的图3.L)二我们利用pA几:1:GUS转基因水稻种子,在0.8%gaar培养介质进行分别用NAA(一刚),Ethephon(一50M),NPA(1刚)和10此L一,NBD.处理5天,把整个根尖包括根控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控茎接合部和盾片然后进行GUS染色,脱色后观察主根的下半部和整个不定根的APRL::]UGS 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 表达"经过1林MNPA处理过的主根尖和盾片,我们可以观察到浓GUS染色(图7.K),这可能是由于生长素在根尖和盾片的积累造成"2.2.2生长素和乙烯调控月人21基因的时间曲线为了弄清植物激素诱导A几了基因的表达有多快,我们用4天水培苗进行1刚"一NAA和150刚ethephon处理时间试验,处理时间为24h"结果表明Q一NAA在30分钟内显著的诱导A几了基因的表达(图7N),而乙烯的诱导要迟后6小时(图7M)"为了弄清生长素是非直接作用于A几1基因,我们将终浓度20刚CHX(蛋白质合成抑制剂eycloheximide,CalbioChem.USA),分别加入到含Q一NAA(1刚)和对照(水)中进行处理实验(图7.0)"EthPehno的时间曲线试验,是将4天苗分别在含有10,15和20刚CHX的150刚ethephon溶液,处理6小时后取样提取RNA,进行RT一PRC分析(图7,P)"RT一PRC结果表明:CHX对Q一N从的诱导刀万艺1基因表达没有抑制作用,而20刚CHX对ethephon诱导刀五艺1基因表达有抑制作用,因此,a一NAA是直接作用于ARLI基因,而乙烯是间接作用于ARLI基因"控制水稻不定根原基形成的关健基因月RLI的表达及激素调控图7.植物激素对ARL了基因表达的调控Fig一re7.ResPonsestohomronesofwildytPeandarllmutantPlantsintemrofadventitiousrootgrowth.AtoE:wildytPe10d一oldseedlings.ControlA(),treatedwithl林MQ一AA旧),150拼MethePhon(C),l件MNPA(n)and一0Lu,NBD(E).FtoJ:"rzzmutnatlod一oldseedlsngs.eontrol(F),treatedwith一林M砰NAA(o),一50林Methephon(H),loMNPA(I)and一0LL一,NBo(J).K:ousstainingofrootsundereontroleondition(l),l/MQ-NAA(2),150林Methephon(3),loMNPA(4)nad10LL一INBo(5).L:RT一pCRanalysisofeXPresethyPhone(M),l林Ma一NAAN()andamixtureofl林MQ一NAAand20拼Meyclollexi:nide(O)ofr4d一OldseedlingsofthewildtyPeundersoIutioneuItureattimePintsof0,0.52,6,12and24hr.(P)ofr4d一oldseedlingsofthewildtyPeundersolutioneultureattimePintsof6hrwithamixtureof150抖Methyphonands林M(3lane),101林M(2lane)and20拼M(llane)eyeloheximide鞘叶节第一节WtarlljkkEthePh助图三激素处理5天的wt茎基部的切片分析(以未处理的wt和arl了突变体做对照)(图妞中,D,J,Nba=r15oum,其余为Zooum")控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控第四章效左21基因的增强表达与抑制表达1.材料与方法1.1材料水稻:粳稻中花一11,arll突变体菌株:大肠杆菌DHSQ,农杆菌菌株EHA105"质粒:pCAMBIA13912,peAMBIA13o一,pUem一T,pBSsK工具酶:Smal!pstl!Xbal!BmaHI!EeoRI!Bglll!Hindlll!Kpnl!Sael!Sall!T4DNA聚合酶!T4DNA连接酶!EXTaqDNA聚合酶,pfu聚合酶"1.2方法1.2.IA欣1超量表达载体的构建第一步,将CaMV35S启动子(Odell等.,1985)亚克隆到pCAMB工A1301上EcoRI和SaC工两酶切位点子间;第二步,将豌豆核酮糖一1,5一二磷酸疏化酶(RuDPcas)e小亚基rbes一Eg的polyA附加序列(Coruzzietal.,1984)插入到Hind111和Pstl之间的位点,载体改造为:355一pACMBIA1301"第三步:以中花11基因组DNA为 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,用Pfu聚合酶和引物(Ups.CATCCGAATTATTGCTGGCAGAGA3.,Lows.TCGAGATCACCGGAGCAAGAAG3.),PCR扩增获得A几了基因ORF,然后用Smal位点将其连接导入355一pACMB工A1301"酶切检测并测序"检测正确的质粒经2500伏电击转入农杆菌菌株EHA105,加入1k60的甘油一70e保存,备用"1.2.2.RNA干涉载体的构建利用RNA一1nterference技术抑制A几了基因的表达,来达到基因敲除的效果"构建方法:反义方向的刀几了cNDA片段(278bp),加上玉米硝酸还原酶基因的第二个内含子采(龙研了)和正义方向的刀RLI基因CDNA(278bp)一起插入p以MB工A1301(在EC叭I和BamHI之I司插有CaMV35S启动子和在Pstl和Hindl工I之间插有NOSpoly控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控resPeetively(CKO)."RT一PCRanalysisofr28runningeyelesofractingeneand30eyclesofrARLJgenesionofARLjinrootsandstem一baseofwildtyPeseedlingsundereontroleondition,root(l)andste:n-baseregion(2):l协MQ一NAA,root(3)andstem一base(4);150林MethePhon,root(5)andsrem一baseregion(6):l抖MNPA,root(7)andstem一baseregion(8)nad10LL一.NBD,root(9)andstem一base(10).Belowis一nRNAlevelofactingene.Mtoo:TimeeourseexPerimentswith150林M.3小结1.外源添加1.0件MNAA,150林MehtPehon,每株的不定根数都有显著的增加,与对照相比,分别增加了51%和60%"然而,这些处理并不能恢复arll突变体的不定根的形成"侧根的生长都受到程度不同的抑制"2.1协MNPA完全抑制植株的不定根和侧根的生长,根生长失去向地性而对主根的生长没有抑制,地上部分弯曲"10拼LL一,NBD,除了抑制不定根和侧根的生长外,还抑制主根的伸长"根茎结合部的切片分析表明,1样MNPA抑制了不定根原基的启动"而NBD只抑制不定根的生长,并不抑制不定根原基的启动"突变体有与野生型类似的表现,表明ARLI基因只控制不定根原基的启动和发育,并不影响生长素和乙烯的作用路径"3.ARL了是一个生长素和乙烯反应基因,a一NAA在30分钟内显著的诱导A几了基因的表达,而乙烯的诱导要迟后6小时"生长素是直接作用于ARLI基因,而乙烯间接作用于ARLj基因"控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控A)的多克隆位点构建成A几了基因干涉载体,酶切检测并测序"检测正确的质粒经2500伏电击转入农杆菌菌株EHA105,加入1k60的甘油一70e保存,转基因用"1.2.3水稻转基因方法水稻转基因采用Hiei(1994)的方法步骤"转基因的受体材料为水稻中花一11号成熟胚诱导的愈伤组织;农杆菌采用EHA105;50mg/L潮霉素用作筛选物质(详见第一章方法)"1.2.4水稻材料准备野生型和转基因水稻种子经%1的稀硝酸室温下破休眠1h2后,用蒸馏水清洗7遍,放于培养皿中,37/C黑暗下浸种至露白(24h),然后转移至湿润滤纸上30/C培养d1;将发芽的种子水培,方法同第一章"培养时间IOd和2d5,统计和观察表型,分别取野生型和转基因植株的根部,于一70e冷冻保存以备RNA提取"1.2.4RNA的提取和RT一PCR具体步骤参见第三章"1.2.5序列比较分析序列分析采用blast软件进行internett匕较(NCBI,NationalCenterforBioteehnologyInformation)(http://wo.nebi.nlm.nih.gov/BLAsT)"刀几了基因编码区长864bp,在BAC(OSJNBb0OSON02)上的位置为53292一54155,无内含子"我们设计了一对引物ARLICU/CL用于扩增ARLI基因的基因组和cDNA序列"引物ARLICO/CL的序列位置为BAC(OSJNBb0050N02)53291一54176"1.2.6测序以pCR产物或克隆好的质粒用MegaBACE1000(AnlershamPhmaraeia,usA)测序"已测序列用DNASATR和NCBI数据库分析并去除载体序列"控制水稻不定根原基形成的关键基因ARLI的表达及激素调控2.结果与讨论2.IA人艺1基因的增强表达我们以CaMV(acul了1f口~"osojcvz.ru)s3S5启动子构建过量表达载体,通过EHA105农杆菌转入中花一11,诱导使该基因在植株内过量表达"对转基因纯合植株营养液培养,IOd和25d取样分析"经初步观察,与野生型对比,并没有发现过量表达植株表型上的异常情况(图1)"对两个刀凡了一S5增强表达转基因株系(l个数据未列出),进行了RT表达检测,结果表明ARLI基因的表达量与野生型无明显差异"这种结果可能是由细胞内的基因沉默机制造成的,需要更换启动子"不过工nukai等(2005)用水稻Actj刀1启动子构建转化获得的Crll异位(eCotpic)过量表达转基因植株,也未诱导产生任何异位不定根"这暗示:刀几了奏适釉勺正常表达己经足够不定根原基的启动,除了ARLI基因外,还存在另外的决定不定根形成的重要因子"2.ZA人21基因的抑制表达我们利用RNA干涉技术构建ARL了基因敲除载体,转中花一11,使该基因在植株内转录体降解达到敲除效果"对转基因纯合植株进行正常营养液培养1d0和25d取样分析"我们观察了T1代11个株系,与野生型对比,发现干涉植株出现3种不同的表型(图l)1.光根的株型,没有侧根,只有主根,而且矮小,植株的生长受到一定的抑制"(图1,RNAi一3)2.与日厂了/表型一样的株型"(图1,NRAi一1)3.与arll表型类似样的株型(图1,RNAi一2),只不过侧根较短"我们对干涉株系进行RT表达检测(图1和图2),结果表明,正常条件下,ARLI基因在野生型中表达较强,而在A几1基因抑制表达的3种表型植株中表达微弱,光根表型RNAi一3更弱"ARLI基因的表达量与不定根发生成正向关系,这说明ARLI基因确实控制不定根的发生"控制水稻不定根原基形成的关键纂因ARLI的表达及激素调控Wtarl]RNAi一IRNAi一ZRNAi一3P355一RLIARL]ACtin10dseedling1.月五21基因的抑制表达和过量表达与表型的关系"10d苗龄根浏欣1,33eyeles.Aetin,27eyeles)Wt:图取野生型;arll突变体,OVER:增强表达株系:无喇j一1涉株系"(RT一PCR中花n--,2一:干WTRNAi一laRNAi一lARL了AClni图ZA欣1基因的抑制表达与表型的关系"(25天苗龄根:ARLI,33eyeles.Aetin,27eyel旦s)控制水稻不定根原基形成的关键基因ARL了的表达及激素调控展望与拟南芥很少形成不定根相比,水稻等单子叶植物能产生许多不定根,这些使水稻成为不定根发育研究的模式材料"然而,关于水稻根系发育的遗传和分子信息非常有限,涉及不定根发生发育的基因及分子机理知之甚少"主要原因在与双子叶植物相比,不定根发育的突变体很少被筛选和鉴定"目前,通过筛选不定根发育异常的突变体,来研究水稻不定根发生发育遗传机制,是目前最有效的方法之一"不定根对环境因素的敏感性,增加了对特异的不定根突变体的筛选和单个遗传基因的鉴定的难度"目前报道的水稻不定根发生发育的相关突变体非常少"crll突变体这就为水稻不定根发育机理研究提供了方便"发育生物学,两个基本问题:第一,细胞是如何知道应该什么时候开始分化,也就是分化的信号和起因是什么?第二,一旦细胞开始分化,这一过程是如何被控制的"对于ARLI基因来说,目前,这两个问题还未弄清楚,还有许多问题有待进一步研究"不定根原基分化的信号和起因可能是Auxni或其极性运输"Auxni及极性运输是一个方向;根据LOB基因的报道,ARL了可能参与了细胞的极性建立和不对称细胞分裂"第三,基因在不定根的表达不是专一性表达,而arlj突变体与野生型相比,只有不定根表型有差别,可推测可能通过其他下游基因而起作用"过量表达实验,也未诱导产生任何异位不定根工nukai等,2005)"这说明:A几了重糙哟勺正常表达已经足够不定根原基的启动,除了ARLI基因外,还存在另外的决定不定根形成的重要因子,找下游基因是一个方向"控制水稻不定根原基形成的关键基因月RLI的表达及激素调控AbstractRootarchiteeUtre15akeydetemrinnatofnutrientnadwateruseefficieneyineroPs.ThePrim娜rootofrieePlnat15short一lived.Thereofre,PlnatacquisitionofwaternadnurtientsduringhtegrowingPeriod15mainlydePendentonadventitiousnadlateralroots.ComParedwihtArbaidoPsis,,thegenetienadmolecularinofmrationondeveloPmentofther00tsystemofcroPs15limited.DuetohtesimPlieityofrootsturetureandvaailbailityofroot一sPeeificmutants,extensivestudieshvaebeeneonduetedinhterootdeveloPmentofArbaidoPsis,However,onlyasmallnmuberofmutnatshavebeenofundinmonocots,nadnogenescoerrsPondingtothesemutnatshavebeenidentified.AgrowingnmuberofstudieshvaeofeusedonhtehcaraeterizationofrootdeveloPmentineerealsusingmutationnaalysis二HereweerPortfindingsofranovelgeneeonrtollinginitiationofdaventitiousrootPri