动物繁殖学课件-华中农业大学第19讲

第十章繁殖新技术第四节克隆技术第五节性别鉴定与控制第六节转基因技术第七节胚胎干细胞第19讲第四节克隆技术一、胚胎分割技术概念：同卵双生或同卵多生意义：扩大胚胎来源；充分利用优良种公、母畜受精卵分裂早期胚胎胚胎分割基本过程代孕母牛植入植入分割一、胚胎分割技术⒈显微操作仪分割在操作仪操纵下，左侧用固定吸管固定胚胎，右侧用切割刀（针）的切割部位放在胚胎的正上方，并垂直施加压力，当触到平皿底时，稍加来回抽动，即可将胚胎的内细胞团从中央等分切开，也可以只在透明带上作一切口，切割并吸出半个胚胎成功率高，但需要昂贵的仪器设备。胚胎分割所用到的仪器显微操作仪分割徒手分割一、胚胎分割技术⒉徒手分割0.1-0.2%链霉蛋白酶软化透明带放置于微滴中胚胎分割广义的克隆（无性繁殖）“多莉”doly细胞核移植概念：将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖就可被激活、分裂并发育成新的个体使得核供体的基因得到完全复制胚细胞核移植：容易体细胞核移植：困难细胞核移植步骤程序：供体核的分离技术受体细胞的去核技术核卵重组技术重组胚的融合技术核移植胚激活、培养、移植或重复克隆技术1．供体核的分离技术（1）胚细胞透明带软化（2）体细胞G0/G1期（3）胚胎干细胞G0/G1期血清饥饿法2．受体细胞的去核技术（1）一步法（盲取法）2．受体细胞的去核技术（2）透明带切开法（两步法）①透明带切口：用切口针拨动使第Ⅰ极体（PbⅠ）位于12点的位置，从上部刺入并经PbⅠ基部刺穿对侧透明带；用固定针下缘来回摩擦2~3次，切开透明带；②去核：a.直接去核：用平头吸管自切口处插入，连同PbⅠ及其下方约1/4~1/3胞质去掉。b.挤压法去核：将PbⅠ重新固定于12点位置，用平头吸管自固定管对侧挤压卵，则PbⅠ及其下方部分胞质被挤出。3．核卵重组技术卵周隙注射：在显微操作仪操纵下，用去核吸管吸取一枚分离出的完整卵裂球，注入去除核的受体卵母细胞的卵周隙中胞质内注射：先将供体细胞的核膜捅破，形成核胞体，再将核胞体直接注入到去核卵母细胞的细胞质中，然后进行激活处理4．重组胚的融合技术（1）仙台病毒法（2）电融合法电融合仪5．核移植胚的激活、培养、移植融合后的重组胚经化学激活或电激活后，在体外培养或经过中间受体培养至桑椹胚或囊胚，然后移入与胚龄同期的受体动物子宫角内，获得克隆后代,获得的早期胚也可作为供体核重新克隆治疗性克隆技术三、动物克隆技术的应用前景作为胚胎发生、死亡及其调控，细胞核与胞质间的关系等的研究手段为科学研究提供大量遗传性状一致的实验动物优秀种公、母畜的纯种快速繁育扩群拯救珍贵濒危动物，我国利用异种动物克隆技术，已克隆出了大熊猫囊胚克隆复制转基因动物，建立生物工厂牛胚胎移植和克隆胚胎供体受体细胞胚胎分割移除细胞核细胞核移植培育到桑椹胚冷冻保存胚胎移植克隆牛重复克隆四、克隆技术存在的问题　理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。　实践问题克隆动物的成功率还很低生出的部分个体表现出生理或免疫缺限即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象四、克隆技术存在的问题除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。在畜牧生产中，为什么要对动物进行性别鉴定或性别控制？第五节性别鉴定与控制一、性别鉴定的方法（一）细胞遗传学方法1．核型分析法X、Y染色体在形态上的差异。准确率几乎是100%,耗时太长。一、性别鉴定的方法（一）细胞遗传学方法2．X-连接酶测定法测定X染色体有关的酶的活性的高低。短暂时期内，雌性的两条X染色体都可以被转录和翻译，雌性胚胎中与X染色体相关酶的细胞内浓度及活性是雄性胚胎的两倍。一、性别鉴定的方法（二）SRY基因探针法1990年，英国学者Sinclair和Gubbay发现，哺乳动物Y染色体短臂上靠近常染色体区的35Kb区域存在性别决定区，即SRY基因。荧光原位杂交(Fish)探针首先与报告分子（reportermolecular）结合、杂交，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接荧光染料而进行标记。1~2枚分裂球,2h。阳性，则胚胎为雄性胚胎，反之，则为雌性胚胎。一、性别鉴定的方法（三）PCR法性别鉴定PCR扩增Y染色体上SRY基因的检测技术。胚胎分割结合，几个细胞即可检测。有条带为雄性胚胎，无条带为雌性胚胎。一、性别鉴定的方法PCR结果图示样品孔内标雄性特异条带♀♂♂1、精子鉴定及分离X-精子、Y-精子（吸附、电泳）2、个体鉴定染色体（组型）Y-染色体（SRY探针法）二、性别控制的方法1、流式细胞分类术分离精子(一)流式细胞术分离X精子和Y精子理论基础DNA含量不同X精子DNA含量大于Y精子人的X精子染色体的DNA含量大约比Y精子的多2.8%~3.0%1、流式细胞分类术分离精子（二）流式细胞术分离X精子和Y精子工作原理1、流式细胞分类术分离精子（三）精确性与有效性评价流式细胞术分离X精子和Y精子的纯度能达到90%左右。Johnson（1989）等对分离精子对母兔宫内受精，其中用X精子受精产下的仔兔中94%是母兔，由Y精子受精产下的仔兔中81%是公兔。1、流式细胞分类术分离精子（三）精确性与有效性评价Johnson（1991）等又对猪做同样的处理，结果分别产下了74%的雌性和68%的雄性仔猪。Cran（1993）和Seidel（1997）等报道，用分离的Y精子进行人工受精（AI）或体外受精（IVF）和胚胎移植（ET）后产下的67头犊牛中，90%为公犊牛，用分离的X精子做相同的处理后产下139头犊牛，其中83%为母犊牛。三、流式细胞分类术分离精子（四）优缺点准确性高分离速度慢仪器昂贵，成本高第六节转基因技术1、概念转基因技术就是用实验室方法将所需要的目的基因导入动物的受精卵，使外源基因与动物本身的基因整合在一起，在动物发育过程中表达，并能稳定地遗传给后代的技术。这种在基因组中稳定地整合有人工的外源基因的动物称转基因动物（transgeneticanimal，TA）你吃过转基因食品吗？不管您愿不愿意，您己经或正在把转基因食品吃进肚里……国内尚没有转基因作物的大规模生产近几年，我国大量从美国、阿根廷等国进口大豆，其中大部分是转基因大豆我国有一半以上的大豆色拉油含有转基因成分第一批列入目录的农业转基因生物是：大豆：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕玉米：玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉油菜：油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕棉花:棉花种子番茄：番茄种子、鲜番茄、番茄酱现在国内都有哪些转基因食品？现在市场上常见的小西红柿算是转基因食品么？利用转基因技术进行动物生产改良、培育新品种和提高生产性能，进行基因治疗利用转基因动物制造具有生物活性的产物，包括器官移植和生物反应器利用转基因动物确定研究手段，包括建立疾病模型和发育调控2、转基因动物的应用外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系3、转基因动物的关键技术转基因动物生产方法示意图基因显微注射法胚胎干细胞移植法反转录病毒法转基因动物的方法1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的“超级小鼠”。通过DNA显微注射获得转基因小鼠示图显微注射法获得转基因动物的成活率胚胎干细胞（embryonicstemcell）胚胎干细胞获得转基因小鼠反转录病毒载体获得转基因小鼠转基因牛①从屠宰场杀掉的奶牛体内收集卵母细胞，体外成熟；②用公牛精液对成熟卵母细胞进行体外受精；③受精卵离心，浓缩卵黄；④将欲导入的DNA微注射到核中；⑤对胚胎进行体外培养；⑥利用非外科移植术将一个胚胎；植入发情的代孕母牛子宫内；⑦对子代进行检测，确定是否转入基因。转基因绵羊、山羊和猪转基因禽类转基因鱼4、转基因动物研究面临的问题整合效率低，成本高表达不理想转基因给动物造成插入突变和机能紊乱产品的安全性问题5、动物转基因技术研究新进展（一）性腺转基因方法（性腺直接注射法）（二）定点制作转基因动物的方法（三）外源目的基因的表达和调控（特异性）（四）转入干扰基因进行RNA干扰（RNAi）调控讲座第七节哺乳动物胚胎干细胞1、概念胚胎干细胞（embryonicstemcells，ESC）是一种从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经分离、体外培养、克隆等得到的具有发育全能性的细胞。2、胚胎干细胞①Blastocyteinnercellmass:ICM囊胚内细胞团②早期胚胎种细胞embryonicgermcells胚儿的原始生殖细胞（primordialgermcells:PGCs）胚胎干细胞的来源3、功能特征发育全能性（totipotenty）、多能性、不断增殖全能性是指ESC在解除分化抑制的条件下具有参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，或发育成完整动物体的能力，其实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定时空顺序依次表达。4、细胞建系技术要点选择抑制ES细胞分化的培养体系早期胚胎及PGCs的选择和分离早期胚胎及PGCS的培养和ESC的分离传代ESC的鉴定及保存5、应用前景组织和器官修复克隆的供体细胞和转基因载体新药的研制与开发其他6、相关问题1.lowefficiencyofES分离plurpotency机理不了解2、ES诱导分化理论及技术水平低思考题胚胎核移植技术的基本步骤有哪些？什么是转基因动物，现今有哪些研究新进展？胚胎干细胞的概念是什么？其有何功能？