实验 4 氨基酸的薄层层析
一、实验原理
薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。由于该方法具有操作简便、
层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点,已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化
学工业、农业生产和食品等领域,对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。
薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相(展开溶剂)
在固定相上流动时,由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样,不同氨基酸在展开溶剂中的
溶解度不一样,点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同,因而可以彼此
分开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行,而将样品各组分分离开。本实验应用硅
胶作为固相支持物,用羧甲基纤维素钠作为粘合剂,以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开
剂,测定混合氨基酸中各分离斑点的 Rf值(Rf值详见第一篇第三章第五节),以分离和鉴别混
合氨基酸的成分。
氨基酸的显色反应:茚三酮水化后生成水化茚三酮,它与氨基酸发生羧基反应生成还原
茚三酮、氨基醛,与此同时,还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑
点显色。
二、实验材料
(一)样品
1.氨基酸
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
溶液:
(1)0.01mol/L 丙氨酸:称取丙氨酸 8.9mg 溶于 90%异丙醇溶液至 10ml。
(2)0.01mol/L 精氨酸:称取精氨酸 17.4mg 溶于 90%异丙醇溶液至 10ml。
(3)0.01mol/L 甘氨酸:称取甘氨酸 7.5mg 溶于 90%异丙醇溶液至 10ml。
2.混合氨基酸溶液:将 0.01mol/L 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。
(二)试剂
1.硅胶 G(C.P.)
2.0.5%羧甲基纤维素钠(CMCNa):取羧甲基纤维素钠 5g溶于 1000ml 蒸馏水中,煮沸,
静置冷却,弃沉淀,取上清备用。
3.展开溶剂:按 80:10:10 比例(V/V)混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水,临用前配制。
4.0.1%茚三酮溶液:取茚三酮(A.R.)0.1g 溶于无水丙酮(A.R.)至 100ml。
5.展层-显色剂:按照 10:1 比例(V/V)混匀展开剂和 0.1%茚三酮溶液。
(三)仪器及器材
1.层析板(6× 15cm);
2.小烧杯;
3.量筒(10mL);
4.小尺子;
5.吹风机;
6.毛细玻璃管;
7.层析缸;
8.烘箱。
三、实验步骤
(一)实验流程
→ → →
(二)操作步骤
1.制板
↓
(1)调浆:称取硅胶 3g,加 0.5%的羧甲
基纤维素钠 8ml,调成均匀的糊状。
(2)涂布:取洁净的干燥玻璃板 a均匀涂
层 b。
(3)干燥:将玻璃板水平放置,室温下
放置 0.5h,自然凉干。
(4)活化:70℃c烘干 60 分钟。
a. 玻璃板要清洁平整,无油污。
b. 粘在玻璃板侧面边上的硅胶
粉应去掉,否则在层析时会有较
强的边缘效应。
c. 应逐步加温,温度过高易导致
涂层裂开。
2.点样
↓
(1)标记:用铅笔距底边 2cm 水平线上
均匀确定 4个点并做好标记。每个样品间
相距 1cm。
(2)点样:用毛细管分别吸取丙氨酸、
精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液,轻轻
接触薄层
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
面点样。加样原点扩散直径不
超过 2mm。点样后用电吹风 a轻轻吹干,
必要时重复加样 b。
a. 用冷风吹干,避免破坏氨基
酸。最好从玻板背面吹。
b. 重复点样时必须等第一点样
品干后再点第二点。
制板 点样 层析 显色
3.层析
↓
将薄层板点样端浸入展层-显色剂,展层-
显色剂液面应低于点样线 a。盖好层析缸
盖 b,上行展层。当展层剂前沿离薄板顶
端 2cm 时,停止展层,取出薄板,用铅笔
描出溶剂前沿界线。
a. 样点不能浸入到溶液中。
b. 将层析缸盖涂上凡士林,防止
层析液挥发。
图 9-8 薄层层析装置
4.显色 用热风吹干或在 90℃下烘干 30min,即可显出各层斑点。
(三)注意事项
1.吸附剂
薄层层析用的吸附剂如氧化铝和硅胶的颗粒大小一般以通过 200 目左右筛孔为宜,如果
颗粒太大,展开时溶剂推进速度太快,分离效果不好。反之,颗粒太小,展开时太慢,斑点
易拖尾,分离效果不好。
2.点样
点样的次数依照样品溶液的浓度而定,样品量太少时,有的成分不易显示,样品量太多
时易造成斑点过大,互相交叉或拖尾,不能得到很好的分离,点样后的斑点直径一般为 0.2cm。
3.避免污染
整个层析过程中,避免用手接触层析板,必要时戴上手套。
四、结果与讨论
(一)结果
1.层析结果:
图 9-9 氨基酸薄层层析结果图
2.数据记录
按照下表记录各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离(a)及溶剂前缘至样品原点中心距
离(b)
各斑点
色斑中心至样品原
点中心距离(a)
溶剂前缘至样品原
点中心距离(b)
丙氨酸
甘氨酸
精氨酸
混合点 1
混合点 2
混合点 3
平均 a值
溶剂前缘至样品原点中心距离(b)
3.结果计算与记录
原点到溶剂前沿的距离
距离原点到层析斑点中心的
=
f
R
各斑点 Rf值 氨基酸名称
丙氨酸 —
甘氨酸 —
精氨酸 —
混合点 1
混合点 2
混合点 3
4.常见问题及处理
问 题 解 析
(1) 斑点拖尾,不集中 硅胶颗粒太小;层析液因为挥发浓度降低。
(2) 斑点未显色
茚三酮因存放时间长失效;显色时未用热风吹干,或
者烤箱温度不足。