基因敲除方法及其应用

【收稿日期】2008205220 【作者简介】贺松 (19822) ,男 ,硕士在读 ,从事基因工程菌的构建及其 应用的研究 , Email: jarm190 @ 163. com;张德纯 ,通讯作 者 , Email: zhangdechun46@ sohu. com 文章编号 : 10052376X (2009) 0220181204 【综 　　述 】 基因敲除方法及其应用 贺松 ,张德纯 (重庆医科大学病原生物学教研室 ,重庆 　400016) 【关键词 】　基因敲除 ;基因打靶 ;同源重组 ; RNA干扰 【中图分类号】Q781　　　　【文献标识码】A 　　基因 ( gene)是核酸分子中储存信息的遗传单 位 ,是指储存有功能的蛋白质多肽链或 RNA序列信 息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。基因 敲除 ( Gene knockout)是指借助分子生物学、细胞生 物学和动物胚胎学的方法 ,通过胚胎干细胞这一特殊 的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏 ,使 特定基因失活 ,以研究该基因的功能 ;或者通过外源 基因来替换宿主基因组中相应部分 ,以便测定它们是 否具有相同的功能 ,或将正常基因引入宿主基因组中 置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲 除是揭示基因功能最直接的手段之一。 基因敲除是自 20世纪 80年代末以来发展起来 的一种新型分子生物学技术 ,此后经历了将近 20年 的推广和应用 ,直到 2007年 10月 8日 ,美国科学家 CAPECCH I和 OL IVER SM ITH IES、英国科学家 EV2 ANS因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修 饰原理方面的系列发现分享了 2007年诺贝尔生理学 或医学奖 ,基因打靶技术才获得诺贝尔奖评审委员会 的关注和肯定。通常意义上的基因敲除主要是应用 DNA同源重组原理 ,用设计的同源片段替代靶基因 片段 (即基因打靶 ) ,从而达到基因敲除的目的。随 着基因敲除技术的发展 ,除了基因打靶技术外 ,新的 原理和技术也逐渐被应用 ,比较成功的有 RNA干扰 技术 ,同样也可以达到基因敲除的目的。本文就基因 打靶技术和 RNA干扰技术两个方面综述了基因敲除 的方法及其应用。 1　基因打靶技术 基因打靶技术 ( gene targeting)是指基因工程中 利用活细胞染色体 DNA可与外源 DNA序列发生重 组的性质 ,来进行定点修饰改造染色体上某一目的基 因的技术 ,又称为同源重组技术 [ 1 ]。胚胎干细胞 ( Embryonic stem cells, ESC) 是早期胚胎细胞经体外 抑制分化培养建立的多能性细胞系 ,体外培养时保持 了未分化状态 ,可以传代增殖 ,在发育上类似于动物 早期胚胎的内细胞团细胞 ,具有与早期胚胎细胞相似 的分化潜能和正常整倍体核型两大特点 ,是研究哺乳 动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模 型。ESC分离和体外培养的成功及哺乳动物细胞中 同源重组的存在奠定了基因敲除的技术基础和理论 基础 ,是进行基因敲除研究不可替代的材料。 基因打靶的主要步骤包括 : (1)重组基因载体的 构建 :把目的基因和细胞内靶基因特异片段同源的 DNA分子都重组到带有标记基因的载体上 ,此重组 载体即为基因打靶载体 ,载体要包括外源目的基因、 同源基因片段及标记基因 ; ( 2)导入受体细胞 :用电 穿孔、显微注射等方法把重组 DNA转入受体细胞核 内 ; (3)筛选 :用选择性培养基筛选已击中的细胞 ; (4)检测 :观察被击中细胞的生物学特征 ,将已击中 的胚胎干细胞转入胚胎使其生长 ,对转基因动物进行 形态学及分子生物学检测。基因打靶技术进行基因 敲除目前使用相当广泛 ,根据其作用方式不同可分 为 :条件性基因敲除法、诱导性基因敲除法、基因捕获 技术基因敲除法等 ,这些方法都是建立在 DNA基因 同源重组技术原理基础之上的 ,现分别展开叙述。 1. 1　条件性基因敲除法 　条件性基因敲除法是指将 某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或 发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。 它实际上是在常规的基因敲除的基础上 ,利用重组酶 Cre介导的位点特异性重组技术 ,在对小鼠基因修饰 的时空范围上设置一个可调控的“按钮 ”,从而使对 小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。 自从 1994年 GU等的第一例应用 Cre2LoxP系统研制 的组织特异性基因敲除小鼠问世以来 ,条件基因敲除 技术迅速取代了传统的完全基因敲除成为主流 [ 2 ]。 条件基因敲除技术利用 Cre2LoxP和 FLP2FRT位 点特异性重组酶系统使得时空特异性基因敲除变为 现实。在特定阶段特定组织或细胞中表达 Cre或 FLP重组酶的转基因小鼠通过与在基因组中引入 LoxP或 FRT序列的小鼠交配 ,可导致子代鼠中特定 组织或细胞中的靶基因被删除。基于 Cre2LoxP系统 的第二代小鼠模型可以克服重要功能基因敲除所导 致的早期致死表型 ,模拟人类疾病相关的体细胞突 变 ,并对突变进行时空上的调控 ,提供了激动人心的 新机会研究已知或者未知基因的在疾病的起始、发生 181中国微生态学杂志 　2009年 2月第 21卷第 2期 和治疗过程中的作用及其机制。近几年来 ,利用细菌 人工染色体 ( bacterial artificial chromosomes, BACs)构 建的 Cre转基因载体通过受精卵注射得到了许多与 内源性基因表达谱相似的 Cre转基因小鼠。2007年 Xu等 [ 3 ]将两种不同细胞特异性的 Cre基因部分缺失 的转基因小鼠交配得到了恢复 Cre重组酶活性的子 代小鼠 ,从而对 Cre在特定细胞中的表达达到了“双 重 ”限制。在构建转基因载体时 ,如果同时将 Cre基 因置于配体或药物可诱导的启动子控制下 ,就可同时 实现在时间和空间水平上对 Cre表达的精确调控。 近几年来研究者利用各种诱导系统结合细胞特异性 启动子构建了多种在时空水平上可调控的 Cre转基 因小鼠 ,为揭示靶基因在特定阶段特定细胞中的功能 提供了强为有力的工具 [ 4 ]。除了利用 Cre转基因小 鼠 ,还可通过感染具有自我剪切功能的表达重组酶的 逆转录病毒和慢病毒以及直接注射可透膜的 Cre重 组酶蛋白而实现重组 ,同时可以减少 Cre重组酶的细 胞毒性 [ 5 ]。 近年来 ,研究者利用组织特异性基因敲除技术揭 示了某些基因在组织器官发育、生理过程以及疾病发 生中的重要功能。国内一些研究者也自主研制成功 了 1O余种组织特异性 Cre重组酶转基因小鼠以及系 列组织特异性条件基因敲除小鼠 ,通过对突变小鼠的 表型分析 ,系统地揭示了 Smad4基因在组织器官发 育和稳态维持以及相关疾病发生过程中的作用和 机制 [ 6 ]。 1. 2　诱导性基因敲除法 　诱导性基因敲除法也是以 Cre /Loxp系统为基础 ,利用控制 Cre表达的启动子的 活性或所表达的 Cre酶活性具有可诱导的特点 ,通过 对诱导剂给予时间的控制或利用 Cre基因定位表达 系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移 到动物体内的过程在时间上的可控性 ,从而在 LoxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定 基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。 诱导性基因敲除法主要有 Cre /LoxP系统和诱导 系统两个部分组成。Cre /LoxP系统由源于大肠埃希 菌噬菌体 Pl的位点特异性重组酶 Cre和其特定的识 别和作用位点 LoxP组成。其中 Cre由 343个氨基酸 组成、分子量约 38 kD。其特定的作用位点 LoxP为 34 bp的 DNA序列 :由 8 bp非对称的核心序列和两 端各 l3 bp 的反向重复序列构成 : 5′2ATAACTTCG2 TATAATGTATGCTATACGAAGTTAT23′。Cre 的特定 作用位点 LoxP的位置也极富变化 ,可以位于相同或 不同的染色体或 DNA分子上 , LoxP之间既可同向排 列 ,也可反向存在。重组反应的形式究竟是缺失、插 入、重复、倒位或易位中的哪一种 ,由两个 LoxP在 DNA分子上的相对位置来决定。在同一 DNA 分子 上 , Cre介导两个同向排列 LoxP之间的 DNA的缺失 反应。如果两个 LoxP位点呈反向排列 , Cre则诱发 倒位反应。当 LoxP存在于不同的 DNA 分子上时 , Cre则介导缺失、重复、插入及易位等反应。LoxP转 基因动物是用常规基因打靶技术构建的 ,基因组中待 修饰区域的两端各携带有 1个 LoxP位点的转基因动 物。构建该转基因动物的目的是为 Cre介导的重组 反应提供作用底物。诱导系统是指其所携带的 Cre 基因的表达 ,或所表达的 Cre的酶活性具有可诱导特 性的转基因动物 ,或 Cre基固可定位表达的基因转移 系统等。对 Cre基因的表达具有可诱导特眭的转基 因动物来说 ,其控制 Cre表达的启动子的活性具有可 诱导性 ,即 Cre基因平时并不表达 ,只有当诱导剂存 在时 ,控制 Cre基因表达的启动子才有转录活性 , Cre 才会表达。在 Cre的酶活性具有可诱导特性的转基 因动物体内 ,其 Cre基因事先已经过了改造 ,虽然该 酶可组成性地表达 ,但它却没有介导重组反应的酶活 性 ,只有当诱导剂存在时 , Cre的酶活性才能被激活。 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的 方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制 , 以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。 常见的几种诱导性打靶类型如下 :四环素诱导型 ;干 扰素诱导型 ;激素诱导型 ;腺病毒介导型。 诱导性基因敲除方法的优点有 : ( 1)诱导基因突 变的时间可人为控制 ; (2)可避免因基因突变而致死 胎的问题 ; (3)在 2个 LoxP位点之间的重组率较高 ; (4)如用病毒或配体 /DNA复合物等基因转移系统来 介导 Cre的表达 ,则可省去建立携带 Cre的转基因动 物的过程 ; (5)如果在 Cre2ERT和 Ad2Cre表达系统中 采用组织细胞特异的启动子来控制 Cre的表达 ,其诱 导的基因重组的组织细胞特异性还可进一步提高。 1. 3　基因捕获技术 　基因捕获技术敲除基因的方法 酷似以 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因为诱饵来捕获基因。其基本过程是 将一含报告基因的 DNA载体随机插入基因组 ,从而 产生内源基因失活突变 ,并通过报告基因的表达激活 提示插入突变的存在 ,及突变内源基因表达特点。通 过筛选得到的插入突变的 ES细胞克隆经囊胚注射 转化为基因突变动物模型 ,进而分析表型来研究突变 基因功能。每一种 ES细胞克隆中含有不同的突变 基因 ,在短期内可建立大量含不同基因突变的 ES细 胞克隆库。突变基因的序列可通过基于 PCR的一些 方法鉴定 ,同时还可能发现一些在体内表达或不表达 的新基因。 基因捕获技术是大规模随机基因敲除技术的方 法之一。研究者利用位点特异性重组酶系统对传统 的基因诱捕策略进行了改进使条件性的基因诱捕成 为可能。在小鼠 ES细胞中进行 ENU诱变可以在 ES 281 Chinese Journal ofM icroecology, Feb12009, Vol121 No12 细胞中直接进行突变基因的筛选 ,使 ENU诱变技术 同样适合于基因驱动的研究。而通过在 cDNA样品 库中检测特定基因的剪接突变 ,使在 ES细胞水平上 进行基因突变的筛选更加方便、有效。近几年来 ,研 究者成功地将不同的转座子系统应用到小鼠中 ,为大 规模地研制基因突变小鼠以及构建新的疾病模型提 供了崭新的途径。在转座子系统基础上 ,同时结合不 同的诱导系统可以对基因突变实现时空水平上的调 控 [ 7 ]。最近 ,利用位点特异性重组酶系统和转座子 系统的一种新的基因诱捕策略为在小鼠基因组范围 内大规模地进行基因突变提供了一种更方便、快捷的 方法 [ 8 ]。 根据报告基因在载体中的位置及报告基因激活 表达的方式 ,基因捕获分为 3种类型 : ( 1 )通过增强 子捕获载体 ( enhancer2trapp ing)整合到顺式增强子元 件附近调控报告基因的表达 ; ( 2 )通过启动子捕获 (p romoter2trapp ing)载体体插入到内源基因编码区序 列中产生融合转录本并表达报告基因 ; (3)基因捕获 载体中在无启动子序列的报告基因上游和下游分别 含有剪接受体 ( sp1 ice accep tor, SA )和多聚腺苷酸加 尾序列 (polyA) ,当含有顺式作用的启动子和增强子 元件被捕获基因转录激活时 ,载体中 SA与内源基因 剪接供体 ( sp lice donor, SD )作用产生上游内源基因 编码序列与报告基因融合转录本 ,使内源基因发生突 变 ,同时报告基因的表达提示内源基因的表达特点。 基因捕获载体在基因组中也有“hot”和“cold”插 入位点。但是计算机模拟显示 ,按照单个克隆被捕获 的百分比 ,如果以多种类型的载体进行足够多次的突 变实验所获得的突变克隆就可以覆盖整个 ES细胞 基因组中全部基因位点。因此 ,新型捕获策略和载体 不断被设计应用。基因捕获插入能提供三类数据作 为突变筛选的依据 ———基因功能、表达模式及序列信 息。而检测突变策略的最重要指标是诱变率。所有 插入型诱变因素 ,包括以基因打靶方式导入基因组的 载体 ,都有一定比率的插入而不产生突变或产生减效 等位基因型突变 ( hypomorphic mutations)。越来越多 成功事例的出现证明基因捕获是一种富有成效的研 究方法 ,能为阐释哺乳动物基因组提供相当多的功能 学数据。如 Ff1基因捕获识别鉴定的新基因可直接 从表型角度分析其功能 ,常可以确定其所在的分子通 路 ;利用基因捕获的方法还可以捕获确定某一分子通 路成员 ;最后 ,基因捕获对于那些不能通过同源重组 产生突变的模式生物研究有深远的意义。 1. 4　其他基因打靶技术敲除基因的方法 　基因打靶 技术敲除基因的方法除了上述的三种方法外 ,还有其 他很多也基于 DNA同源重组技术原理的基因敲除方 法 ,如基因插入突变技术、基因缺失技术、自杀质粒构 建技术等 ,也被一些研究者们所重视。 2　RNA干扰技术 RNA干扰技术 ( RNA interference, RNA i)是指通 过利用短片段的双链 RNA 促使特定基因的 mRNA 降解来高效、特异的阻断特定基因的表达 ,诱使细胞 表现出特定基因沉默的表型。该系统能被 siRNA的 直接途径或非病毒载体和病毒载体 shRNA的表达在 体内外有效诱发。到目前为止 , RNA i技术作为基因 沉默的一个工具 ,被研究人员广泛应用到包括功能基 因组学、药物靶点筛选、细胞信号传导通路分析、疾病 治疗等研究领域 [ 9 ]。与传统的基因敲除技术相比 , RNA i技术具有投入少 ,周期短 ,操作简单等优势。 RNA i阻断基因表达的机理 [ 10 ] :双链 RNA进入 细胞后 ,一方面能够在 D icer酶的作用下被裂解成小 分子干扰 RNA ( small interfering RNA, siRNA ) ,而另 一方面双链 RNA还能在 RdRP (以 RNA为模板指导 RNA合成的聚合酶 , RNA2directed RNA potyraerase, RdRP)的作用下自身扩增后 ,再被 D icer酶裂解成 siRNA。 siRNA的双链解开变成单链 ,并与某些蛋白 形成复合物 , A rgonaute2是目前唯一已知的参与复合 物形成的蛋白。此复合物同与 siRNA互补的 mRNA 结合 ,一方面使 mRNA被 RNA酶裂解 ,另一方面以 siRNA作为引物 ,以 mRNA为模板 ,在 RdRP作用下 合成出 mRNA的互补链。结果 mRNA也变成了双链 RNA,它在 D icer酶的作用下也被裂解成 siRNA。这 些新生成的 siRNA也具有诱发 RNA i的作用 ,通过这 个聚合酶链式反应 ,细胞内的 siRNA大大增加 ,显著 增加了对基因表达的抑制。从 21～23个核苷酸的 siRNA到几百个核苷酸的双链 RNA都能诱发 RNA i, 但长的双链 RNA阻断基因表达的效果明显强于短的 双链 RNA。 近些年来 , RNA i技术成为基因敲除的热点 ,应用 相当广泛。例如 ,将针对 M 2BCR /ABL融合基因设计 合成的 dsRNA转染慢性髓细胞白血病 K562细胞系 , 结果发现 mRNA的转录和 BCR /AB I癌蛋白的表达 减少 ,基因被敲除 ,引起强烈的细胞凋亡反应 ;利用 RNA i技术抑制白血病细胞多药耐药基因表达 ,结果 显示不仅肿瘤细胞耐药被逆转 ,而且还发现前列腺素 E的合成和释放减少 ,提示白血病细胞多药耐药基因 不仅具有降低细胞内药物浓度抵抗药物杀伤作用 ,而 且还可能参与了前列腺素 E等体内化学递质的代 谢 ,在自血病细胞的其他生物学行为中发挥作用 ;针 对形成胶质瘤的关键因子表皮生长因子受体独特的 外显子 1及 S交接序列设计的 siRNA可有效地抑制 人胶质母细胞瘤系的表皮生长因子表达 ,并且发现 siRNA介导的表皮生长因子受体缺失可明显引起胶 质瘤 AKT磷酸化水平下降及 P13K的抑制 ,细胞凋亡 增加 ,细胞周期 G22M期阻滞 [ 11 ]。陈功星等 [ 12 ]为了 研究特异 siRNA 作用于大肠癌细胞株 SW 480 中 PLK1 ( Polo21 ike kinase 1)基因表达的 mRNA对该细 胞分裂生长的影响 ,设计了对应于 PLK1基因表达 mRNA不同位点的 10种特异 siRNA ,经化学合成后 , 用脂质体转染 SW 480细胞 ,实时定量 PCR检测 PLK1 381中国微生态学杂志 　2009年 2月第 21卷第 2期 基因的表达 ,观察不同的 siRNA作用强度 ,并计数细 胞了解相应细胞的生长情况 ,W estern2blot观察 PLK1 表达蛋白的变化和流式细胞计数分析细胞周期改变。 发现 10种 siRNA均可敲除 PLK1基因表达的 20%以 上 ,其中 P1、P4和 P93组敲除 mRNA达 80%以上 ,这 3种 siRNA及其混合物对 PLK1基因 mRNA的作用 具有相应浓度效应 ,在 25nmol/L时达到最佳作用效 果 ,而且相同浓度的混合物作用效果更好 (超过 95% ) , PLK1表达蛋白质明显降低 ,细胞周期在 G2 期受到阻碍。72h后的各种 siRNA浓度下细胞生长 变化与 PLK1基因的 mRNA水平变化相一致。结果 表明化学合成的特异 siRNA对 SW 480细胞中 PLK1 基因表达具有消除作用 ,混合物作用更强 ,在细胞水 平上抑制了 SW 480细胞的分裂生长。范钰等 [ 13 ]根 据 STAT3基因特点 ,设计合成 STAT3 siRNA ,并转染 人结肠癌细胞系 HCT116 后 , 采用 RT2PCR 检测 STAT3 mRNA ,采用软琼脂集落培养试验检测癌细胞 锚着不依赖性增殖 ,采用 Boyden小室模型试验检测 癌细胞的侵袭能力 ,结果表明 STAT3 siRNA可有效 抑制结肠癌细胞集落生长和侵袭能力。 运用 RNA i技术来诱导基因表达的沉默是一种 制备基因功能缺失表型的有效的新方法。将 RNA i 技术用于基因敲除有其很大的优点 : (1)比同源重组 法更加简便 ,周期大大缩短 ; ( 2)能够快速而简单地 制备某个功能缺失表型 ; ( 3) RNA i技术也已经可以 通过 shRNA表达盒子能够在细胞中像在动物模型中 一样产生有效的、稳定的和可调节的基因沉默作用 ; (4)对于哺乳动物 ,如对于一些敲除后小鼠在胚胎时 就会死亡的基因 ,可以在体外培养的细胞中利用 RNA i技术研究它的功能 ; (5)由于 RNA i能高效特异 的阻断基因的表达 ,它成为研究信号传导通路的良好 工具 ; (6) RNA i还被用来研究在发育过程中起作用 的基因 ,如可用 RNA i来阻断某些基因的表达 ,来研 究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着 关键作用。 3　基因敲除技术的应用前景 随着功能基因组学的兴起和发展 ,基因敲除技术 被人们广泛的用于探讨基因功能的研究 ,通过基因敲 除技术逐渐明确了大量模式生物和重要功能微生物 的全基因组 ,并能准确定位功能基因 ,从基因水平上 更加清楚的认识微生物的代谢规律。同时 ,敲除载体 及相关技术的完善可进一步推动微生物代谢工程的 广泛应用 ,通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢 流向 ,阻断有害代谢产物积累 ,可望降低成本 ,大幅度 提高生产水平及产品纯度。 近 10多年来 ,由于抗生素的滥用 ,细菌耐药率有 增长趋势 ,耐药菌株也逐渐增多 ,解决细菌耐药性问 题已经成为当务之急 ,选择合理有效的抗生素已经成 为目前医学界的难题 ,研究致病菌的耐药机制以及研 发新型抗菌药物更是迫在眉睫。从功能基因组学的 角度来研究细菌的耐药基因 ,并采用基因打靶技术和 RNA i技术对细菌耐药机制进行探讨 ,以便研制抑制 细菌耐药、增强抗菌药物疗效和开发新的抗菌药物 , 以及研制和开发具有预防和治疗作用的功能性食品。 在肿瘤的化疗治疗过程中 ,肿瘤细胞在接触化疗 药物后对某一药物耐药 ,往往对其他结构、机制上相 似或相异的多种药物产生耐药 ,即肿瘤多药耐药现 象。肿瘤的多药耐药是导致化疗的失败主要原因 ,也 是肿瘤化疗急需解决的难题。运用 RNA i技术诱导 肿瘤耐药基因同源基因转录后沉默 ,丧失其耐药功 能 ;或运用基因打靶技术直接敲除肿瘤耐药基因 ,或 致使肿瘤耐药基因突变 ,从而可增强肿瘤细胞对化疗 药物的敏感性。也可采用基因敲除技术敲除肿瘤细 胞关键性基因或致使肿瘤细胞关键性基因发生突变 , 抑制肿瘤细胞生长 ,或者诱导肿瘤细胞凋亡 ,用于肿 瘤的基础研究和临床治疗。 另外 ,基因敲除技术还可运用于基因结构与功能 研究、细胞生活周期调控机制研究、食品发酵工程基 因工程菌的研究、无毒活体疫苗的制备研究以及遗传 病的基因治疗等诸多方面。可见 ,基因敲除技术具有 非常好的应用前景和广阔的发展空间。 【参考文献 】 [ 1 ]贺淹才. 简明基因工程原理 [M ]. 北京 :科学出版社 , 2005: 389. 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