高效液相色谱原理和操作详解-higmp

WWW. GMP.COM Hi Protecting and Promoting Your Health 如果您有好资源，欢迎与大家分享，投稿邮箱：lugoo@foxmail.com，HiGMP官方 QQ群：5323218 高 效 液 相 色 谱 我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ： 数量 方法 项目 1985 年版 1990 年版 1995 年版 2000 年版 鉴别 9 34 150 检查 12 40 160 HPLC 法 含量测定 7 60 117 387 鉴于 HPLC 应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握 并应用 HPLC。 I．概论 .............................................................................................................................................2 一、液相色谱理论发展简况...........................................................................................................2 二、HPLC的特点和优点 ...............................................................................................................2 三、色谱法分类...............................................................................................................................3 四、色谱分离原理...........................................................................................................................3 II．基本概念和理论 ........................................................................................................................5 一、基本概念和术语.......................................................................................................................5 二、塔板理论...................................................................................................................................8 三、速率理论（又称随机模型理论）...........................................................................................9 III．HPLC系统 ..............................................................................................................................10 一、输液泵.....................................................................................................................................11 二、进样器.....................................................................................................................................13 三、色谱柱.....................................................................................................................................14 四、检测器.....................................................................................................................................16 五、数据处理和计算机控制系统.................................................................................................20 六、恒温装置.................................................................................................................................20 IV．固定相和流动相 ....................................................................................................................20 一、基质（担体）.........................................................................................................................20 二、化学键合固定相.....................................................................................................................22 三、流动相.....................................................................................................................................23 1．流动相的性质要求...........................................................................................................23 2．流动相的选择...................................................................................................................24 3．流动相的pH值..................................................................................................................24 4．流动相的脱气...................................................................................................................25 5．流动相的滤过...................................................................................................................25 6．流动相的贮存...................................................................................................................26 7．卤代有机溶剂应特别注意的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ...................................................................................26 8．HPLC用水 ........................................................................................................................26 V．HPLC应用 ...............................................................................................................................26 一、样品测定.........................................................................................................................27 二、方法研究.........................................................................................................................27 附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则..............................................................................28 一、对起草单位的要求：.............................................................................................................28 二、对复核单位的要求：.............................................................................................................28 I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时， 由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和） 的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称 为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在 1906 年研究用碳酸钙分 离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展 出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送 流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效 液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱 法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典 液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力， 需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC的特点和优点 HPLC 有以下特点： 高压——压力可达 150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为 75 Kg/cm2以上。 高速——流速为 0.1~10.0 ml/min。 高效——可达 5000 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 100 种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在 15~30 min，有些样品甚至在 5 min 内即 可完成。 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高——紫外检测器可达 0.01ng，荧光和电化学检测器可达 0.1pg。 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分 或做制备。 三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱 法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和 气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非 挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法 (LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体 之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡， 故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、 排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲 和色谱法。（此外还有电泳。） 按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法 （正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据 固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过 程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度 5~10μm。适用于分离分子量 200~1000 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同 分异构体。 2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体 表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度 不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固 定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化； 另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相 很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如 C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相 色谱法(RPC)。 正相色谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相 为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、 四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强 的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液， 常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留 xxx 下划线 xxx 下划线 xxx 下划线 xxx 下划线 xxx 下划线 xxx 下划线 xxx 下划线 时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为 广泛，据统计，它占整个HPLC应用的 80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些 无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制 流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为 2.5~7.5（2~8）， 太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱 可在pH 1.5~10 范围操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线 （如氨基键合固定相）。 3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形 成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或 季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离 子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子 与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时 间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的 pH 值和离子强度影响。pH 值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作 用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被 测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶 解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠 等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。 离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入 3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与 离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。 5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样 品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不 能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻 能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白 质、核酸等。 xxx 下划线 xxx 下划线 xxx 下划线 xxx 下划线 xxx 下划线 II．基本概念和理论 一、基本概念和术语 1．色谱图和峰参数 ¾ 色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号 -时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 ¾ 基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器 测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 ¾ 噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、 检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 ¾ 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、 温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下 来也会产生漂移。 ¾ 色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流 出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯 Gauss 曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。 前者少见。 ¾ 拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色谱峰的对称性。也 称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药 典》规定 T 应为 0.95~1.05。T＜0.95 为前延峰，T＞1.05 为拖尾峰。 ¾ 峰底——基线上峰的起点至终点的距离。 ¾ 峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。 ¾ 峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个 交点间的距离。W＝4σ ¾半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半处的峰宽。Wh/2＝ 2.355σ ¾ 标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线 x＝±1 时（拐点） 的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的 0.607 倍处。标准偏差的大小说明组分 在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、 柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 ¾峰面积(peak area，A)——峰与峰底所包围的面积。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 Wh/2 h 2．定性参数（保留值） ¾死时间(dead time，t0)——不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂） 通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 xxx 下划线 ¾死体积(dead volume，V0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固 定相所占据的空间。它包括 4 部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相 颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。 其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它 3 部分只起峰扩展作用。为防止峰扩 展，这 3 部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速） ¾保留时间(retention time，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓 度极大值的时间。 ¾保留体积(retention volume，VR)——从进样开始到某组分在柱后出现 浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR ¾调整保留时间(adjusted retention time，t'R)——扣除死时间后的保留时 间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相 等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝ tR－t0 ¾调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)——扣除死体积后的保 留体积。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R 3．柱效参数 ¾ 理论塔板数(theoretical plate number，N)——用于定量表示色谱柱的 分离效率（简称柱效）。 N 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流 动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布， N 可近似表示为： N＝()2＝16()2＝5.54()2 N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组分含 量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确 测定，尤其是对稍有拖尾的峰。 N 与柱长成正比，柱越长，N 越大。用 N 表示柱效时应注明柱长，如果未 注明，则表示柱长为 1 米时的理论塔板数。（一般 HPLC 柱的 N 在 1000 以上。） 若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或 Neff)。 ¾理论塔板高度(theoretical plate height，H)——每单位柱长的方差。H ＝。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H＝，H有效＝。 4．相平衡参数 ¾ 分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下，化合物在两 相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K＝。 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。 在不同的色谱分离机制中，K 有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换 色谱法为选择性系数 （或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况 可用分配系数来表示。 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm 很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条 件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大， K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱 峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时， 才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中 K 值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出 色谱柱；K 值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系 数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前 提。 在 HPLC 中，固定相确定后，K 主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调 整流动相的组成配比及 pH 值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间， 达到分离的目的。 ¾ 容量因子(capacity factor，k)——化合物在两相间达到分配平衡时， 在固定相与流动相中的量之比。k＝。因此容量因子也称质量分配系数。 分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。 上式说明容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是不 保留组分保留时间（t0）的几倍。k＝0 时，化合物全部存在于流动相中，在固定 相中不保留，t'R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时 间越长。 容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及 温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由 于t'R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。 ¾选择性因子(selectivity factor，α)——相邻两组分的分配系数或容量因 子之比。α＝＝ （设k2＞k1）。因k＝t'R/t0，则α＝，所以α又称为相对保留 时间（《美国药典》）。 要使两组分得到分离，必须使 α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配 性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表 示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。 5．分离参数 ¾分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比 值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R＝。当W1＝W2时，R＝。当 R＝1 时，称为 4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为 95.4%，内侧峰基重 叠约 2%。R＝1.5 时，称为 6σ分离，裸露峰面积为 99.7%。R≥1.5 称为完 全分离。《中国药典》规定R应大于 1.5。 xxx 下划线 xxx 下划线 ¾ 基本分离方程——分离度与三个色谱基本参数有如下关系： R＝×× 其中称为柱效项，为柱选择性项，为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特 性有关，后两项与色谱过程热力学因素有关。 从基本分离方程可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一 是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度， 提高柱效。②增加选择性。当α＝1 时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能 分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值；b. 改 变柱温；c. 改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法， 可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于 0 时，R也趋于 0；k2增大，R也增大。 但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵 敏度。一般k2在 1~10 范围内，最好为 2~5，窄径柱可更小些。 二、塔板理论 1．塔板理论的基本假设 塔板理论是 Martin 和 Synger 首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱 看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分 在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为： 1） 色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分 配定律，并很快达到分配平衡。 2） 样品加在第 0 号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。 3） 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。 4） 在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。 虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到 分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱 流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色 谱柱柱效。 2．色谱流出曲线方程及定量参数（峰高 h 和峰面积 A） 根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述： C＝e 或 C＝e 由色谱流出曲线方程可知：当t＝tR时，浓度C有极大值，Cmax＝。Cmax就是 色谱峰的峰高。因此上式说明：①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分 的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定 时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。 由流出曲线方程对V(0~∞) 求积分，即得出色谱峰面积A＝×σ×Cmax＝C0。 可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ 代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 。 xxx 下划线 三、速率理论（又称随机模型理论） 1．液相色谱速率方程 1956 年荷兰学者 Van Deemter 等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高 度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论——速率理论。它把色 谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效） 的影响。 后来 Giddings 和 Snyder 等人在 Van Deemter 方程（H＝A＋B/u＋Cu，后称 气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速 率方程（即 Giddings 方程）： H＝2λdp＋＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2f 2．影响柱效的因素 1）涡流扩散（eddy diffusion）。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分 子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A＝2λdp，dp为填料直径， λ为填充不 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 因子，填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为 3~10μm， 最好 3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱 压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。总的说 来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料，A＝0。 2）分子扩散（molecular diffusion）。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子 在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u＝2γDm/u。 u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速 时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很 小，通常仅为气相的 10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项 可以忽略不计。γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入 的柱参数，用以对Dm进行校正。γ一般在 0.6~0.7 左右，毛细管柱的γ＝1。 3）传质阻抗（mass transfer resistance）。由于溶质分子在流动相、静态流动 相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩 散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间 上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质 阻抗项 Cu 又分为三项。 ①流动相传质阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流路中流路 中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处 于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展 宽。 ②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm为常数。这是由于溶质分子进 入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展 宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大， 传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻 力，是提高液相色谱柱效的关键。 Hm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p 成正比，与扩散系数Dm成反比。因此应 采用低粒度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动 相时，易产生气泡，因此一般采用室温。 ③固定相传质阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液 的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df的平方成正 比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔 离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化 学键合固定相时Hs可以忽略。 从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施： ①进样时间要短。②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致 严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u作图，则有一 最佳线速度uopt，在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约 0.03~0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在 1mm/s的条件下操作。⑤较小的检测器死体积。 3．柱外效应 速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素， 即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各 方差之和，即： σ2＝σ2 柱内＋σ2 柱外＋σ2 其它 柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的 所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用 “零死体积接头”连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应尽可 能小。研究表明柱外死体积之和应＜VR/。其次，希望将样品直接进在柱头的中 心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样 体积≤VR/2。 柱外效应的直观 标志 禁止坐卧标志下载饮用水保护区标志下载桥隧标志图下载上坡路安全标志下载地理标志专用标志下载 是容量因子 k 小的组分（如 k＜2）峰形拖尾和峰宽增 加得更为明显；k 大的组分影响不显著。由于 HPLC 的特殊条件，当柱子本身效 率越高（N 越大），柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典 LC 中则影 响相对较小。 III．HPLC 系统 HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置 等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、 在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微 机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分 收集装置。 最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪， 绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度 洗脱，柱填料从单一品种发展至几百种类型，检测器从单波长至可变波长检测器、 可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理 不再用绘图仪，逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理 系统。 目前常见的 HPLC 仪生产厂家国外有 Waters 公司、Agilent 公司（原 HP 公 司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂 等。 一、输液泵 1．泵的构造和性能 输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系 统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应 ＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在 0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到 100 ml/min；③输出压力高，一般应能 达到 150~300 kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。 泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为 螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋 泵缸体太大，这两种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。 柱塞往复泵的液缸容积小，可至 0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别 适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响； 泵压可达 400 kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克 服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好 （RSD为 0.1%左右，串联泵为 0.2~0.3%），但出故障的机会较多（因多一单向 阀），价格也较贵。 各品牌输液泵的基本参数： 项目 Waters 515型 HP 1100 型 LC-10ATvp 型 Elite P200 II 型 检定要 求 流速范围 0.001~10 0.001~10 0.001~9.999 0.01~4.99 调节精度 0.001 0.001 0.001 0.01 流量精密度 RSD 0.1% 0.15%（<0.3%） 0.3% 0.5% 1.5% 流量准确度 ±2.0% ±5.0% ±2.0% 最高压力 4000 Psi 40 MPa 39.2 MPa 40.0 MPa 密封圈寿命 流动相的脉冲 2．泵的使用和维护注意事项 为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行 操作： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱 塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相 最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用 Millipore 滤膜（0.2µm 或 0.45µm）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗 或更换。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内， 尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由 于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体 将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗 后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相， 可以是甲醇或甲醇-水）。 ③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱 塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 ④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变 形，产生漏液。 ⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大 量气泡，泵就无法正常工作。 如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障： ①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打 开泄压阀，使泵在较大流量（如 5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个 50ml 针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。 ②压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物， 可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微 细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡， 或将砂滤棒浸入稀酸（如 4mol/L 硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立 即清洗。 ③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能 是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。 3．梯度洗脱 HPLC 有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同 一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。 梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度 和 pH 值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可 以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线 漂移和降低重现性。 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、 凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进 行梯度洗脱。 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些 特殊问题，必须充分重视： ①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些 溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶 剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。 ②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析 前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱 柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产 生气泡。 ③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。 例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压 大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输 液泵或色谱柱能承受的最大压力。 ④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需 让 10~30 倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平 衡。 二、进样器 早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀 或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样， 进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC 进样方式可分为：隔膜进样、停 流进样、阀进样、自动进样。 1．隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头 内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的 柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用（如 10MPa 以上）；此外 隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到 1~2%；加之能耐各种 溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。 2．停流进样。可避免在高压下进样。但在 HPLC 中由于隔膜的污染，停泵 或重新启动时往往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信 号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。 3．阀进样。一般 HPLC 分析常用六通进样阀（以美国 Rheodyne 公司的 7725 和 7725i 型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组 成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降 5~10% 左右），但耐高压（35~40MPa），进样量准确，重复性好（0.5%），操作方便。 六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样 时，进样量应不大于定量环体积的 50%（最多 75％），并要求每次进样体积准 确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产 生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的 5~10 倍（最少 3 倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应， 确保进样的准确度及重复性。 六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用 0.45µm 滤膜过滤， 以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置， 否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时， 过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结 束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲 洗。 4．自动进样。用于大量样品的常规分析。 三、色谱柱 色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱 系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于 HPLC 的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚 合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为 3,5,7,10μm 等，柱效 理论值可达 5~16 万/米。对于一般的分析只需 5000 塔板数的柱效；对于同系物 分析，只要 500 即可；对于较难分离物质对则可采用高达 2 万的柱子，因此一般 10~30cm 左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。 柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外， 还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好 的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的 部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就 是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起 30 倍粒径的厚度。在一般的液 相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。 1．柱的构造 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。 柱管多用不锈钢制成，压力不高于 70 kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管， 管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过 抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相 同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛 板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径 0.2~20µm(5~10µm)，取决于填料粒度，目的 是防止填料漏出。 色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：①常规分析柱 （常量柱），内径 2~5mm（常用 4.6mm，国内有 4mm 和 5mm），柱长 10~30cm； ②窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱 semi-microcolumn），内径 1~2mm， 柱长 10~20cm；③毛细管柱（又称微柱 microcolumn），内径 0.2~0.5mm；④半 制备柱，内径＞5mm；