组织与细胞化学2011

null组织化学与细胞化学组织化学与细胞化学南昌大学生命科学与食品工程学院 主讲：范丽华目录目录第一章 概 述 第二章 组织学的研究 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 第三章 光镜标本制作 第四章 光学显微技术 第五章 组织细胞化学 第六章 免疫组织细胞化学 第七章 原位杂交组织化学 第八章 细胞分离技术 第九章 细胞培养与组织工程 第十章 形态计量分析术 第一章 概 述第一章 概 述 第一节　概述 第二节　组织化学与细胞化学的发展史 第一节　概述 第一节　概述 1.组织与细胞化学 1.1定义： 组织化学(histochemistry) 与细胞化学（cytochemistry) 是运用物理学、化学、免疫学和分子生物学等原理与技 术，对组织与细胞的化学成分或酶活性进行定性、定位 和定量研究的科学。  1.2 基本原理：1.2 基本原理： 组织化学（histochemistry)和细胞化学（cytochemistry）技术的基本原理是在组织切片上或被检材料上，加一定试剂，使它与组织或细胞中待检物质发生化学反应成为有色沉淀物，以用光镜观察，若为重金属沉淀，可以用电镜观察，称电镜组织化学（electron microscope histochemistry)。这种方法可用于 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 细胞内的酶类、糖类、脂类。核酸与某些金属元素等。如进一步应用显微分光光度计等测定标本中沉淀物的强度，则能较精确地进行定量研究。 2.研究组织、细胞传统的化学方法2.研究组织、细胞传统的化学方法 传统的组织化学只是利用物理或化学反应显示组织或细胞内的化学成分或酶活性而对其进行定性、定位和定量研究。 null 糖类显示法 最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应)。基本原理是：糖被强氧化剂过碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合，形成紫红色反应产物,PAS反应阳性部位即表示多糖的存在。 酶类显示 细胞内含有多种酶,每一种酶可催化一定的化学反应。酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存在，而不是酶的本身。将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀,即最终反应产物。 　　如欲显示细胞内酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸钠)的溶液（PH5.0) 中孵育，底物经酶的作用，水解并释放出磷酸；用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅沉淀，此时，可在电镜下检出；如再用硫化铵处理时，磷酸铅被置换成硫化铝沉淀，可在光镜下见到。 null 脂类显示 脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹Ⅲ、苏内Ⅵ、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。 核酸显示法 　　显示DNA的传统方法为Feulgen反应。切片先经稀盐酸处理后， 使细胞内DNA水解，打开DNA分子中脱氧核糖核酸和嘌呤碱之间的连接键，使其释放出醛基，再用Schiff试剂处理，形成紫红色反应产物。 　　如用甲基绿-派若宁反应，可同时显示细胞内的DNA和RNA甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。 null 3．现代意义的细胞与组织化学 包括无机物组织化学、酶组织化学、电镜细胞化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学、放射自显影技术、流式细胞术和激光扫描共聚焦显微术等。故现代组织化学的概念已远远超过了原有的范围，理论、内容、技术手段和研究范围都比过去更广泛、更深入。包括经典组织化学、免疫组织化学和原位杂交组织化学在内的广义组织化学是介于细胞学、组织学、生物化学以及分子生物学之间的新兴边缘学科，已成为医学生物学科研工作的重要手段。定量组织化学技术主要用于组织化学的原位定量研究．是组织化学从定性、定位研究进入定量研究的重要手段。null流式细胞术和激光扫描共聚焦显微术使组织化学的定性、定位和定量研究又有了新的突破，特别是激光扫描共聚焦显微术可在三维立体结构层面上对细胞内化学物质进行更深层次的研究，并在各种细胞的微型手术切割以及细胞膜流动性、膜电位、膜通透性、高分子物质扩散和受体移动等的检测方面有了越来越广泛的应用。然而各类组织化学虽有其特定的概念和范围．但都是源于组织化学，且其实验技术也有其共同点。或是在原组织化学基础上进一步发展而成型。 细胞是一个生命体，组织的构成也是由细胞组成，在研究生命规律及探索生命规律的过程中，要应用到许多技术和方法，从而产生了组织化学和细胞化学等学科。 null4.组织化学发展的基础     组织化学基于并源于组织学、细胞学和生物化学，又有别于这些学科。组织化学与组织学和细胞学的区别：前者的着眼点是研究组织细胞内的化学组成及其含量和酶的存在及其活性，而后者的着眼点是研究组织细胞的形态结构及其与功能的关系。 组织化学与生物化学的区别：虽然两者均着眼于组织细胞内的化学组成及其含量和酶的存在及其活性，但是，生物化学技术中通常是将组织和细胞破坏，制成匀浆，然后进行化学测定，而不考虑定位； 在组织化学技术中，是尽可能在组织或细胞内原位显示各种化学成分，故定位性能好。生物化学技术中的化学反应是在试管内进行，而组织化学技术中的化学反应通常是在组织切片或细胞涂片中进行。组织化学要求一定在显微镜下能观察到所检测的化学物质，但在大多数情况下，所见到的并不是某种化学物质本身，而是该物质在其存在部位经过化学反应的产物． 这种产物在镜下可直接或间接被观察到，它所在的位置和数量能够代表该物质的位置和数量。组织化学自出现以来，已取得长足的发展。这些发展以细胞生物学、生物化学、免疫学和分子生物学的快速发展为基础。 null第二节　组织化学与细胞化学的发展史 我国组织化学发展概况 我国的组织化学研究工作起步于20世纪50年代，组织化学家李肇特、张作干教授等人作为我国组织化学发展的奠基者，积极从事组织化学方面的科研和教学工作。并培养出一大批组织化学的专门研究人才。他们在20世纪50年代末率先应用并在全国范围内推广“组织化学”技术，举办组织化学培训班，招收全国各医学院校青年教师和科研人员进修学习，自编组织化学教材，为研究生开办组织化学课程。随后，我国从事组织化学研究的专家还有张保真、王启民、马仲魁和艾民康等，他们为我国组织化学事业的发展作出了突出贡献。 中国解剖学会于1988年3月在广州成立了“组织化学与细胞化学学组”，并决定筹办《中国组织化学与细胞化学杂志》。这标志着中国组织化学与细胞化学的研究进入了一个崭新阶段。国际组织化学与细胞化学学会联合会(International Federation of Societies for Histochemistryand Cytochemistry，IFSHC)是全世界组织化学与细胞化学工作者的学术组织，于1960年9月成立于法国巴黎，每4年召开一次大会。 null我国组织细胞化学家艾民康教授代表中国组织细胞化学工作者于1980年首次参加了第6届IFSHC大会，并在第8届IFSHC大会上当选为联盟理事，中国被正式接纳为会员，从此我国成为IFSHC的成员和理事国。 此后。苏慧慈、成令忠、蔡文琴教授先后当选为IFSHC的理事。中日组织化学与细胞化学研讨会由我国艾民康、朴英杰教授和日本组织细胞化学家小川和郎教授组织发起，继1989年第一届研讨会在广州召开以来，先后在我国西安、沈阳、重庆、上海、日本东京、中国武汉和日本甲府召开了第2～8届会议。这些会议展现了中日两国组织化学与细胞化学领域内的最新研究成果、新理论、新技术方法的进展，并加强和促进了我国组织细胞化学界的国际学术交流细胞生物学发展与组织化学细胞生物学发展与组织化学 细胞生物学是从细胞、亚细胞和分子三个水平研究生命活动规律的科学，组织化学以细胞生物学为基础发展而来。 显微镜的发明与细胞的发现将人类对机体的认识从宏观世界引向微观世界的广阔领域，由此人们从肉眼所见的大体结构开始探索光学显微镜下组织细胞的微细结构，正因为有了对机体微细结构的充分认识，才有可能产生对组织细胞的化学成分进行定性、定位和定量研究的渴求。然而，光学显微镜的分辨率有限，仅能观察到细胞膜、细胞质和细胞核，对于亚细胞结构，即超微结构的观察无能为力。 1932年，德国科学家Knoll和Ruska在西门子(Siemens)公司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对机体的认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家Wilson的名言“一切生物学关键问题必须在细胞中寻找”，至今还有着很深的内涵。细胞生物学的发展历程为组织化学的产生和发展奠定了形态学基础。 免疫学发展与组织化学免疫学发展与组织化学18世纪70年代英国医生Edward Jenner研究出用牛痘菌预防天花的方法，为免疫学对传染病的预防开辟了广阔前景。 19世纪末．法国化学家、微生物学家Louis Pasteur在研究人和动物传染病时，分析了免疫现象，并在琴纳的启发下发明用减毒炭疽杆菌苗株制成疫苗，预防动物炭疽病，用减毒狂犬病毒株制成疫苗．预防人类狂犬病。德国细菌学家、免疫学家Emil Adolf von Behring于1890年发现免疫血清中有抗白喉毒素的抗毒素存在． 日本细菌学家北里柴三郎也发现抗破伤风毒素的抗毒素，两人共同研究血清疗法成功。从此，人们开始探词·免疫机制，把细胞的吞噬作用和抗毒素的中和作用看成是特异性免疫的根据，并逐步展开了细胞免疫和体液免疫两大学派的争鸣。体液免疫学派代表是德国细菌学家Ehrlich Paul。他用生物化学方法研究免疫现象。特别是以蛋白质化学和糖化学作为基础，探讨抗原和抗体的本质及其相互作用。于1896年提出抗体形成的侧链学说。null 到20世纪60年代，对体液免疫研究已经达到分子水平，即揭示了抗体的分子结构和功能。同时，对细胞免疫研究也有明显进展，特别是在杂交瘤技术方面的突破性进展，这不仅丰富了细胞学内容，而且为获得单克隆抗体或介质物质开辟了一条新道路。将抗原、抗体的特异性与组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)，形成了一项新技术——免疫组织化学技术。因此，免疫组织化学技术比组织化学技术对细胞成分的检测范围更为广泛．特异性也更强。 生物化学发展与组织化学生物化学发展与组织化学 生物化学是一门运用化学原理及方法研究生命的科学。它一方面是进行细胞组成成分的化学分析，另一方面是对这些成分在生命过程中所发生的化学反应进行分析，而组织化学正是利用这些化学反应原理来实现对组织细胞化学成分的定性、定位和定量研究。 20世纪初，人类已经认识到组成蛋白质的20个 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 氨基酸中的19种。E．Fischer提出蛋白质是由相邻氨基酸之间的肽链连接而成，并推论这些肽链是由一个氨基酸的。—氨基和相邻的羟基连接时脱去水而形成。到19世纪末，其他细胞成分，如脂肪、碳水化合物与核酸也被认知。甚至能被部分提纯。例如，FriedrichMiescher(1871年)在其细胞成分研究中，从死的白细胞核中分离出脱氧核糖核酸(DNA)。但是，当时这一重要发现并没有与遗传联系起来，几乎过于50年之后，才开始认识到DNA在遗传中所起的重要作用。 因此，在生物化学的发展中对生物体大分子物质结构和功能的认识为组织化学奠定了基础。例如。在组织化学中对组织细胞成分中酶的检测，是将组织切片置于含有特异性底物的溶液中，溶液中的底物经组织切片中酶水解、氧化等作用形成反应产物，即初级反应产物。初级反应产物再与某种捕捉剂结合，形成有色的终产物使组织切片中的酶变成在显微镜下可见物，从而在原位检测酶活性，了解它的存在、分布和功能。现代组织化学的发展现代组织化学的发展    近半个世纪是现代组织化学蓬勃发展时期。组织(细胞)化学新方法的建立，使其技术手段更精细，内容更丰富，如Mann自1902年起及此后许多学者的研究，逐渐建立了完善的组织冷冻切片技术，弥补了一般化学固定及石蜡包埋的缺点，可防止脂类、多糖类和无机盐的丢失，防止酶活性丧失等，推动了脂类、黏多糖及酶的组织化学研究。null在蛋白质和氨基酸组织化学显色法的研究中，Danielli(1947年)建立了显示蛋白质(酪氨酸、色氨酸和组氨酸)的四氮盐反应，还有坂口(1925年)建立并经其他学者改进的精氨酸(组蛋白中富含)显色法，Danielli(1950年)和Pearse(19"年)等建立的SS基和SH基反应(显示胱氨酸和半胱氨酸，与角蛋白检测相关)，vanGieson的胶原显示法，Foot(1925年)显示网状纤维的银浸法，Weigert、Verhoeff(1908)和Gomori(1950年)等的弹性纤维染色法，Mallory(1938年)的纤维蛋白染色法等。 null在核酸组织化学显色法的研究中，最著名的是Feulgen和Rossenbeck(1924年)建立的Feulgen-Schiff反应，用以显示细胞核内的DNA。另一个是Brachet于1940～1944年建立的甲基绿—焦宁(pyronine)染色法显示细胞内的RNA。此法使胞质和核仁内的RNA显红色，核内的DNA显绿色，标本色彩鲜艳，为研究者所乐用。 null碳水化合物组织化学显色法中，最著名的是McManus(1946年)和Hotchkiss(1948年)建立的过碘酸-Schiff反应(PAS反应)，可使细胞和组织内的多糖、黏多糖、糖蛋白呈红色；Steedman(1950年)建立了用alcian蓝显示酸性黏多糖和透明质酸的方法；Michaelis等(1945年)发现用甲苯胺蓝染色，可使组织中的肝素等酸性黏多糖呈异染性。 null脂类的组织化学显色法中，除用苏丹Ⅲ外，Michaelis(1901年)、Lison(1930年)和Liliie(1944年)等还发现用苏丹Ⅳ、油红O、苏丹黑等脂溶性染料的染色法。此外，还有用锇酸浸染显示脂类的方法。     有关酶组织化学的研究从20世纪40年代兴起，至20世纪50年代初已建立了18类酶的数十种显色方法。Takamatsu(高松英雄)和Gomori于1939年同时证明了碱性磷酸酶的组织化学方法，这一年标志着酶组织化学真正开始，以后相继出现了许多酶的显示方法。此时，随着电子显微镜的问世和超薄切片技术的发展， Scheldon等(1955年)首先将超薄切片技术应用到酶组织化学中，在电镜下观察酸性磷酸酶的分布，Brand等(1956年)又用此法观察到碱性磷酸酶存在于溶酶体内，他们的成就使组织化学技术与电镜技术结合起来，从而开创了电镜组织化学的新领域，使酶在细胞中的定位进入到亚细胞水平。 null1941年Coons和他的同事首次用荧光素标记抗体检测肺组织内肺炎双球菌而获得成功，开创了免疫细胞化学的新篇章。为在荧光显微镜下能够对酶进行观察，Coons等人(1950年)提出了荧光抗体法。但是，荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察。 Nakane等人(1966年)尝试用酶代替荧光素来标记抗体的方法，从而成功地开创了酶标记抗体的新技术(酶标抗体法)。 Sternberger等人(1970年)又将非标记抗体过氧化物酶法成功地引入，建立了过氧化物酶—抗过氧化物酶(PAP)法，使免疫酶法有了很大的进步。 Geoghega(1978年)建立了胶体金标记术。 Hsu等于20世纪80年代发明了亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法(ABC法)。 在此之后．免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术等相继问世。随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进，特别是德国人Kohler和英国人Milstein(1975年)建立杂交瘤制备单克隆抗体技术以来．使免疫组织化学发展到一个新的水平，使免疫组织化学技术在生命科学研究中日益显示出巨大的实用价值。 null 近二十年来，相继发现了多种亲和物质?如植物凝集素(1ectin)与糖结合物(glycol conjugate)、葡萄球菌A蛋白(staphylococcal proteinA)与IgG、生物素(biotin)与卵白素(avldin)(亲和素)、激素、脂质与受体等。这些物质是一些有多价结合能力的物质，不但亲和物质之间有高度亲和力，而且可以与标记物如荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白等相结合。Bayer(1976年)将这种利用两种物质之间的高度亲和力而相互结合的反应进行细胞化学检测的技术称为亲和细胞化学(affinitycytochemistry)。亲和细胞化学技术的建立。提高和增加了免疫细胞化学的敏感性和检测范围，是免疫细胞化学的新发展。 null分子杂交(insituhybridization)技术引入免疫细胞化学，是现代免疫细胞化学向基因水平深入发展的重要标志。 Hall(1961年)首先建立了液相核酸杂交技术，开创了核酸杂交技术的研究和应用。 Bohon(1962年)设计‘了较简单的固相核酸杂交术。 Gall和Pardue(1969年)应用蟾蜍核糖体基因探针与卵母细胞杂交，确定该基因位于细胞核的核仁内，开创了原位杂交组织化学技术的应用。Bauman(1981年)发明了用荧光素标记cRNA探针做原位杂交(FISH术)，Brigat(1983年)建立了生物素标记探针术。 Boeringer等(1987年)发明了地高辛标记探针，并将药盒投放市场，使原位杂交的应用更安全和简便。 1998年，Kononen等首次提出组织芯片(tissuechip)的概念，并很快证实了其应用价值。组织芯片又称组织微阵列(tissuemlcroarray，TMA)，它是将数十个乃至数以千计不同来源的组织样品黏贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上，形成组织微阵列。在同一反应条件下对组织芯片进行免疫组织化学染色、原位杂交、FISH或原位PCR等，以了解病变组织与相应正常组织内靶基因或蛋白质的细胞来源、分布特征和表达差异等。它的最大便利之处在于可以对大量组织标本同时进行检测，缩短了检测时间，减少了不同染色玻片间人为造成的差异，使得各组织或穿刺标本间对某一生物分子的测定更具有可比性。组织芯片虽说是一种快速、高通量获取生物信息的好方法，但是由于使用石蜡切片，对那些只能应用于冷冻组织切片的抗体或核酸分子杂交方法则不适合。为了弥补这一缺陷，最近美国又发展了冷冻细胞阵列(frozencellarray)，其基本原理与组织芯片相似，但使用的材料是新鲜的细胞系而不是经固定剂固定、石蜡包埋的组织 细胞生物学发展与组织化学  细胞生物学发展与组织化学  细胞生物学是从细胞、亚细胞和分子三个水平研究生命活动规律的科学，组织化学以细胞生物学为基础发展而来。显微镜的发明与细胞的发现将人类对机体的认识从宏观世界引向微观世界的广阔领域，由此人们从肉眼所见的大体结构开始探索光学显微镜下组织细胞的微细结构，正因为有了对机体微细结构的充分认识，才有可能产生对组织细胞的化学成分进行定性、定位和定量研究的渴求。然而，光学显微镜的分辨率有限，仅能观察到细胞膜、细胞质和细胞核，对于亚细胞结构，即超微结构的观察无能为力。1932年，德国科学家Knoll和Ruska在西门子(Siemens)公司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对机体的认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家Wilson的名言“一切生物学关键问题必须在细胞中寻找”，至今还有着很深的内涵。细胞生物学的发展历程为组织化学的产生和发展奠定了形态学基础。 第二章　组织学的研究方法 第二章　组织学的研究方法 第一节　概述 第二节　组织学制片概述 第三节　取材和固定 第四节　固定后的处理 第五节　染色及染色方法 第一节　概述 第一节　概述 　 组织学（histofogy）是应用显微镜研究机体微细结构及其相关功能的科学，是在解剖学的基础上从宏观到微观发展形成的，故又被称为显微解剖学（microscopic anatomy）。 组织学的研究内容，首先要研究组成机体的形态结构与功能单位——细胞；继而 研究在细胞及其产物所组成的基本组织（primary tissue）——上皮组织。结缔组织、肌肉组织和神经组织；在此基础上研究各器官系统的微细结构及其有关功能.null 组织学是重要的基础课程，只有对机体微细结构的深入了解才可能透彻地阐明其功能；组织学的研究极大地促进了生理学的发展、生物化学的进步也促进了组织学的发展，例如，将生物化学及分子生物学的原理用于组织学而建立起组织化学及分子细胞学，将免疫学的原理用于组织学而建立起免疫组织化学等。从而使人们得知各种细胞与组织的化学组成、分子结构及其基本生命现象，这些知识已成为现代组织学的重要组成部分。 第二节 组织学制片第二节 组织学制片1.组织学制片方法 非切片法 直接取物体进行观察，不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法。 包括： a.整体封藏法 水螅 鸡胚 蛙胚 b.涂片法 针对液体或半液体。 血液 骨髓 腹水 c.活体标本观察法 蛙口腔黏膜的纤毛运动 细胞吞噬 d.分离法 　分离三种肌细胞　神经纤维　脊髓前角神经细胞 e.铺片法 肠系膜　可观察肥大细胞　弹力纤维　胶元纤维等　 f.磨片法 　骨组织或牙齿　 切片法 需依靠切片机将组织切成薄片的方法。 null2.组织切片制作流程： 杀死、取材与固定、洗涤、脱水、透明、透入、包埋、切片、贴片、染色、封藏。 第三节　取材和固定第三节　取材和固定1.取材与固定（组织切片制作的关键步骤） 取材：首先动物组织需从动物体中取出。方法有多种,主要是视材料的种类，实验动物个体大小及观察的目的而定。 杀死的方法：大的个体(实验动物)用刀，斧头，麻醉等方法. 小的个体（实验动物）采用大号剪刀或断头法等。 取材注意事项：取材需速度快，取材以后，应立即进行固定。否则细胞会自溶。 null固定 固定的目的： 防止组织腐败及自溶。 将所需要的物质原位沉淀、保存，尽量使各种成分保持与原来（活着）的状况相仿。 3. 沉淀下来以后，会造成组织的折光率的变化。即增加折光性，并使易染色。 4. 通过固定以后,使组织产生硬化现象,有利于切片的制作。 null 2．固定的对象 构成细胞的主要物质是蛋白质,它分散在细胞内,所以固定的对象是蛋白质。 null 作为固定剂的化学试剂必须具有能凝固或沉淀蛋白质,脂肪等成分,并具有强的渗透力. 固定剂必须具备的性质: 1)迅速渗入组织杀死原生质(渗透速度要快),即很快能将细胞杀死,不会使组织产生变化。 2) 渗透要均匀。(使组织内外尽量保持一致) 3) 尽量避免出现膨胀和收缩状况。 4) 尽量避免使组织块变形,卷曲。 5) 使细胞内蛋白质凝固,沉淀。 6) 增加折光性,媒染作用和染色能力。 7) 使组织变硬,适于切片,但又不至于使材料坚硬而松脆。 8) 固定以后,又能有保存组织的特性(如用福尔马林浸泡)。 3．组成固定剂的性质和条件 null4.固定剂的作用方式（三种） 1)使蛋白质变性.蛋白质变性会成为沉淀物质,其是不可逆的.例：酒精 使蛋白质变性不是与蛋白质形成化合物，而是使蛋白质脱水而使之变性。 2）固定剂与蛋白质发生化合作用，改变了蛋白质的结构，产生沉 淀。 3）使蛋白质冻胶化，固定液与蛋白质间起了化学上的结合，改变了 分子结构，不产生沉淀，是使蛋白质凝胶化，并不溶与水。 null5. 固定剂的媒染效果 生活细胞大多不易染色，但经过固定后便易染色，这是由于固定 剂与蛋白质相结合，同时也能与染料分子结合，从而使蛋白质着 色。 null6.固定剂的穿透率。 穿透率要强，迅速，才能在短时间内使组织内外都得到固定。 null7.取材和固定应注意事项 1）固定的材料要新鲜。 组织会产生自溶。夏天不超过2-4小时。材料取出后应立即固定,有些组织自溶很快。冬天不超过12小时。 2）取材的部位要准确。（要清楚所需的材料位于动物体内哪个位置） 3）取材工具要锋利，动作需仔细。 4）切取的组织块必须小而薄，一般取0.3-0.5mm厚的组织块进行固定。 5）清洗。如小肠组织需清洗其内的黏液及食物残渣，才能投入到固定剂内。 6）组织块附加标记的方法。 组织块取得较多并放在同一容器内，易发生混淆。应加标签以区别之，并注明固定液，材料，日期等。 7）固定剂的用量。 固定组织，一般所采用的固定液体积为组织块的10-15倍，容器勿过小，材料勿太多。 null8 .常见固定剂的性质及使用 -)单纯固定剂 A 甲醛（纯甲醛为一种气体）溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林。市面上出甲醛浓度通常为37-40% 。甲醛使用时，需采用新鲜的。放置时间较长的甲醛会变成多聚甲醛。为强的还原剂，其不可与氧化剂混合使用。 作为固定剂的优点：渗透力强，使组织收缩少，固定均匀 。能较好的固定脂肪，神经及髓鞘，且能固定高尔基体，线粒体。缺点：不能固定白蛋白和核蛋白。 B 乙醇（为无色透明的液体)其可与水与任意比例混合。 优点:可以沉淀白蛋白,球蛋白,核蛋白。缺点: 不宜作低温固定 ,渗透力较弱,使组织收缩,酒精浓度超过50%可溶解组织内的脂肪.类脂体,血色素等。 C 醋酸（具刺激味的无色液体) 固定组织通常用5%的HAC。PH2-6，能防止细胞自溶及腐败。 优点: 其能沉淀核蛋白,是种好的染色质固定剂.穿透速度快.固定时间较短,通常1小时即可。缺点:其不能沉淀白蛋白、球蛋白使组织膨胀,高浓度HAC会破坏线粒体和高尔基。　 null D 苦味酸(常见的一种酸)为一种强酸,黄色结晶.其在干燥空气中激烈晃动,会发生爆炸,苦味酸的运输以溶解在水中的饱和苦味酸,浓度为1%。 作为固定液的优点: 能沉淀所有的蛋白质。 缺点: 使组织收缩，穿透力弱。 E 重铬酸钾 橙红色的结晶,强氧化剂,不可与还原剂(酒精)等混用.重铬酸钾溶液中加醋酸后,产生铬酸,才能使蛋白质产生沉淀。 优点:穿透力较强。 缺点:使组织产生一点膨胀。 F.锇酸(四氧化锇)为黄色的结晶,为强的氧化剂。 优点:其为脂肪及类脂体的唯一的固定剂,能将线粒体及高尔基体固定成为黑色. 可保持组织柔软。 缺点:穿透速度慢,难固定组织,毒性高,易损伤眼睛及黏膜,价格昂贵。 G 氯化汞:通称升汞,剧毒,呈白色粉末状,以针状结晶为最纯。 优点:其对蛋白质有较强的沉淀作用,能沉淀一切蛋白质(包括核蛋白)，能充分固定细胞质和细胞核。 缺点：null二)混合固定液 １.Bouin液　 苦味酸饱和水溶液　甲醛　冰醋酸　 该固定液渗透力强,使组织收缩少.固定时间12-24小时. ２.Carnoy液　无水乙醇　氯仿　冰醋酸　 对组织穿透速度快,多用于糖原,脱氧核糖核酸固定. ３.Zenker液　重铬酸钾　升汞　双蒸水　冰醋酸 采用该液,须脱汞处理. ４.Helly液　 重铬酸钾　升汞　双蒸水　甲醛 第四节 固定后的处理 第四节 固定后的处理 1.洗涤 洗涤的目的 组织在固定后一定要把渗入组织里面的固定液洗去，然后进行下一个过程，为防止组织中留有较多的固定剂影响脱水剂，甚至可在组织中发生沉淀或结晶而影响观察，特别是对陈旧性标本更应注意流水冲洗，尽可能减少组织中的酸性程度和甲醛色素。对于混合性固定液，更应及时洗涤，有利于脱水，切片和染色。 null洗涤的方法 1．固定剂以水配置者 用流水冲洗，可使组织中固定液随时溢出和随时洗去。大的动物组织冲洗时间为24小时左右，小动物组织冲洗时间为2-10小时。冲洗的时间基本根据固定的时间而定,新鲜的标本固定时间短,需及时脱水者,冲洗时间短。 2 固定剂含乙醇者 一般不要求冲洗，如需冲洗必须采用与固定剂溶度相近的乙醇冲洗。 3 特殊固定液洗涤法 重铬酸钾 流水冲洗12-24小时，或用亚硫酸，或用1%含氯水溶液进行洗涤。 锇酸 流水冲洗12-24小时，务必冲干净。 苦味酸 用50%或70%乙醇浸泡。尽量洗去黄色。 氯化汞 用0.5% 碘酒溶液反复加入到70%乙醇中，直至黄色不再褪去为止.再用硫代硫酸钠或70%乙醇洗去碘。 null2.常用脱水剂 乙醇 为常用的脱水剂。脱水能力强，并能使组织硬化。一般的脱水顺序是 70%、80%、90%、95%I、95%II、无水乙醇I、无水乙醇II 、无水乙醇III。应注意的是脱水必须在有盖的瓶子内进行。 丙酮 沸点为56℃ ，脱水作用比乙醇强，但对组织块的收缩较大。脱水时间通常为1-3小时。 正丁醇 为无色液体，沸点100-118℃，微溶于水。一般使用方法为：组织块经固定及冲洗后先入50%-70%-80%乙醇中脱水，然后转入正丁醇12-24小时浸蜡。 叔丁醇 是异丁醇的一种，无毒，熔点为25℃。 电镜上常用的中间脱水剂。null3.透明 透明的目的 在制片过程中有两次透明，第一次是脱水以后的透明；第二次透明是染色后的切片透明。组织块透明的目的是便于浸蜡包埋，切片透明目的是有利于光线的透过，便于显微镜的观察。 透明剂的种类 1 二甲苯 2 甲苯 3 苯 4 香柏油 null4.浸蜡 5.包埋 6.切片 7.贴片 8.染色 第五节 染色及染色方法 第五节 染色及染色方法 1.天然染料 苏木精 本身不作为染料，其氧化产物苏木红才作为染料。 氧化的方式： 1） 自然氧化作用 2） 化学氧化作用 卡红 靛兰 地衣红 巴西木素 null2. 人工合成染料 生色团与助色团 酸性、碱性与中性染料 1)酸性染料（阴离子染料）生色团位于其分子的阴离子处。 2)碱性染料（阳离子染料）生色团位于其分子的阳离子处。 null3.异染现象 染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变，因而观察到被染的组织显示与该染料本身颜色不一样，此现象为异染现象。 4.荧光染料 是指需要经过波长很短（低于400nm）的紫外线照射激发以后而发出荧光的一类特殊染料。 第三章 光镜标本制作 第三章 光镜标本制作 组织学的研究方法很多，并随着科学技术的发展，又不断创建新技 术，在应用中要根据研究的目的和内容，选用相应的方法才能获得 预期的效果。这里仅就最常用、最基本的一些方法做简要介绍。 null 第一节　涂片、铺片、磨片标本的制备 第二节　切片标本的制备 第一节　涂片、铺片、磨片标本的制备 第一节　涂片、铺片、磨片标本的制备 1.涂片标本的制备 涂片（smear）法是常用的一种方法，如血液等可直接涂于载玻片上制成涂片标本，干燥后进行固定、染色及封固。 2.铺片标本的制备（stretched preparation） 用于疏松结缔组织、神经等柔软组织或肠系膜等薄层组织，可将其铺于载玻片上，撕开、展平制成铺片标本，待干燥后进行固定染色。 　　 null3.磨片标本的制备（ground section） 用于坚硬组织的标本制作，如骨和牙等坚硬组织除用酸（如稀硝酸）脱钙后再按常规制成切片标本外，也可直接将其磨成薄的磨片标本进行观察。第二节　切片标本的制备 第二节　切片标本的制备 观察机体各部的微细结构时，首先要制成薄片，就是切片法，其中以石蜡切片（Paraffin section）最为常见。null其制备程序大致如下: ①取材与固定： 取材要尽量新鲜动物材料。取得新鲜材料后，切成适当的小块1.0立方厘米大小）立即投入固定剂（fixative）中进行固定，使组织中蛋白质迅速凝固，防止组织自溶或腐败，以保持生活状态下的结构。常用的固定剂有甲醛、酒精、醋酸、苦味酸、锇酸等。 ②脱水（dehydtation）、透明（clearing）与包埋（embedding）: 把固定好的材料用乙醇将组织内的水分脱掉，经二甲苯透明后，再浸入已融化的石蜡中进行浸透、包埋。 ③切片（section）与染色（staining）： 用切片机（microtome）切成5～10μm的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行染色，最常用的染色法是苏木精（hematoxylin,haematoxylin)和伊红（eosin）染色简称HE染色。配制后的苏木精染液呈碱性，可使细胞核内的染色质及细胞质内的核糖体等染成蓝紫色，称嗜碱性（basophilia)；伊红是酸性染料，可使多数细胞的细胞质染成粉红色，称嗜酸性（acidophilia）；耐碱性和酸性染液亲合力都不强的，称为中性（neutroPhilia）； ④封固（mounting）： 切片经脱水、透明后，于切片上滴加中性树胶和盖片进行封固后，贴标签备用。 null除HE染色外，还有多种染色方法。有的能特异性的显示细胞内某些结构，如使用雷锁辛品红（resorcin-fuchsin)染液显示组织内的弹性纤维；有的细胞经重铬酸盐处理后，呈棕褐色，称嗜铬性（chromaffinity）；有的组织成分经硝酸银处理时，可使硝酸银还原，形成银微粒附着在组织中呈棕黑色，该特性称为亲银性（argentaffin）；有的组织结构成分，本身不能使硝酸银还原，需加还原剂方能使硝酸银还原，形成棕褐色很微粒附着在组织结构上，这种性质称为嗜银性（argyrophilia）；如肥大细胞中的颗粒经甲苯胺蓝（tofuidine blue）等碱性染料染色后,呈紫红色，这种现象称异染性(metachromasia），其原理可能是染料在溶液中以单体存在时呈蓝色，当它与颗粒中具有大量阴离子的多糖成分耦合后，聚合成多聚体而呈紫红色。 null除石蜡切片外，在制作较大结构（如眼球、睾丸等）的切片时，常用火棉胶包埋法；骨和牙等坚硬的组织，可用弱酸（稀硝酸）脱钙后，用石蜡或火棉胶切片（celloidin section）法制成切片标本；还有，为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，可选用冷冻切片（frozen section），它是将组织先在低温下快速冻结，经直接切片后进行染色，或将组织块置入液氮（-196℃）内快速冷冻，用恒冷箱切片（cryostat section）后进行染色。 第四章　 光学显微技术 第四章　 光学显微技术 第一节 光 镜 技 术 　 第二节 　 电子显微镜技术 第一节 光 镜 技 术第一节 光 镜 技 术几种特殊显微镜术: 相差显微镜 干涉微分相差显微镜 荧光显微镜 暗视野显微镜 共焦激光扫描显微镜相差显微镜相差显微镜 是用于观察生活细胞或未经染色细胞的形态结构。生活细胞无色透明，细胞内各种结构间的反差很小，在一般光学显微镜下难以观察到细胞的轮廓及内部结构，必须使用相差显微镜。 相差显微镜的结构特点是： ①装有不同大小环状光阑的聚光器。 ②物镜内装有位相板。 ③中心望远镜装置。相差显微镜的基本原理是通过上述装置。把透过标本的可见光的相位差变成振幅 差，从而提高了标本内各种结构之间的对比度，使标本中的结构清晰可辨。 null 若观察生长在培养瓶中的生活细胞，则需应用倒置相差显微镜（inverted phase con- trast microsope）。它与相差显微镜基本相同，它的特点是物镜安装在载物台的下方，光源及长焦距聚光器安装在载物台的上方；可以对体外培养细胞进行长时间观察、拍照、摄电影及录像等以 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 生活细胞的行为。 干涉微分相差显微镜干涉微分相差显微镜 基本原理与相差显微镜非常相似，但它有一装有分光器的聚光器，利用分光器将光束分为两组，一组光束通过被检物，另一束则通过周围介质，旋转检偏器，光的干涉形成光程差，可随旋转，两光束形成不同的角度，于是被检物呈现出不同颜色，致使生活细胞如同染上颜色一样，故又称为光染色。它与相差显微镜相比，除有鲜艳的颜色外，在细胞周围不出现明亮的晕环。 荧光显微镜 荧光显微镜 是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。它是装有、能产生紫外线（短波长）的光源及系列滤片装置的显微镜。由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光，如维生素A呈绿色荧光、心肌细胞内脂褐素呈棕黄色～金黄色荧光。但是,细胞内的某些成分只有与荧光素结合后，在紫外线的激发下，始可呈现一定颜色的荧光；如应吖啶橙（荧光素）处理细胞后，细胞核内的DNA呈绿～黄绿色荧光，细胞质及核仁内的RNA呈桔黄～桔红色荧光。利用荧光染色法及荧光显微镜可以观察组织、细胞的结构、细胞内某些成分含量的变化，并探讨细胞的功能状态。或用荧光素标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞化学研究。 暗视野显微镜 暗视野显微镜 特点是该显微镜具有暗视野聚光器，使光线不直接进人物镜，故呈暗视野。该显微镜适用于观察细胞内微小颗粒，例如线粒体、细菌运动等。人眼的分辨力为200um,普通光镜为0.2um，而暗视野显微镜的分辨力为其50倍，为004um.共焦激光扫描显微镜 共焦激光扫描显微镜 是80年代初研制成功的一种高光敏度、高分辨率的新型仪器。它的主要特点是：①以激光作为光源。②采用共焦成像系统． ③扫描、显示及记录系统。激光具有发散角小、方向性好的优点，光束通过聚焦后落在样品（如细胞等）的不同深度；在不同方向、不同深度的平面上进行聚焦扫描，从而得到一系列不同层次的清晰图像。平面间隔最小约 600～800nm；利用微机图像合成系统可重建细胞的三维图像，可对细胞进行体视学的定量分析研究； CLSM可以更精确地检测、识别，组织或细胞内的微细结构及其变化。由此， CLSM又有细胞CT之称。 第二节 电子显微镜技术 第二节 电子显微镜技术 目前，电子显微镜技术（electron microscopy)已成为研究机体微细结构的重要手段。常用的有透射电镜（transmission electron microscope，TEM）和扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）。与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。 成像原理 成像原理 透射电镜技术 扫描电镜术 冷冻蚀刻复型术 冷冻割断术透射电镜技术透射电镜技术 透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像， 投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50～100nm）。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。要在机体死亡后的数分钟钓取材，组织块要小(1立方毫米以内），常用戊二醛和锇酸进行双重固定树脂包埋,用特制的超薄切片机（ultramicrotome）切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。 null 电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。称电子密度高（electron dense）。反之，则称为电子密度低（electron lucent）。 扫描电镜术 扫描电镜术 扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。（细胞、组织）表面的立体构像，可摄制成照片。 扫描电镜样品用戊二醛和饿酸等固定，经脱水和临界点干燥后,再于样品表面喷镀薄层金膜，以增加二波电子数。扫描电镜能观察较大的组织表面结构，由于它的景深长，1mm左右的凹凸不平面能清所成像，故放样品图像富有立体感。 冷冻蚀刻复型术 冷冻蚀刻复型术 冷冻蚀刻复型（freeze etch replica ）是电镜样品的一种制备技术，以显示细胞、组织微细结构的立体构像。 其样品制备步骤如下： ①冷冻： 先把组织浸入含有20％～30％的甘油生理盐水的冷冻保护剂中，以防止冰晶形成和提高冷冻速度，然后把组织放入液氮（-196℃) 内快速冻结； ②断裂在低温真空内，把冻结的组织用钢刀劈开，断裂面常为组织、细胞的薄弱部位，如膜的双层类脂质分子的疏水极之间余下部分的表面要观察的部位冷冻蚀刻 ③蚀刻： 在真空内将温度回升到-100℃，使断裂面的冰升华，形成凹凸不平的形态； ④复型: 在断裂面以45°角喷镀一层铂膜，以增加图像的反差和立体感，再喷镀一层碳膜以加固铂膜。然后用次氯酸钠等腐蚀液除去组织，捞取复型膜在透射电镜下观察。 null　 冷冻蚀刻复型技术是研究细胞膜相结构的重要手段。细胞膜的双层类脂质层被劈分开后，其外层的内表面称胞质外面或E面（extracellular face，E-face）；其内层的外表面称胞质面或P面（plasllllc face，P-face）；在P面常可见许多直径6～9nm的膜内粒子，而E面则较少。一般认为腹内粒子是细胞膜和细胞内膜相结构中的镶嵌蛋白质粒子的图像，膜内粒子的数量与分布随膜的功能状态而变化。因此，可应用冷冻蚀刻复型求研究膜结构与功能的关系。 冷冻割断术（ freeze cracking) 冷冻割断术（ freeze cracking) 将固定组织经过处理后。置于特制的冷冻台上，浸于二甲基亚砜中，低温下将组织割断，断面喷镀合金，在扫描电镜下观察组织结构断面的立体图像。 第五章 组织细胞化学 第五章 组织细胞化学 一、组织化学发展简史 组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，它的历史相当悠久。早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应。 法国植物学家F.V.Raspail（1826）介绍了植物花和果受精过程中的碘淀粉反应； M. Perls（1867）用普鲁士蓝显示出铁；A.N.F. Millon(1844)叙述了蛋白质反应； R. Fürnrohr（1850）论述了纤维素的氯锌碘法； nullKlebs(1868)和H. Stuve1872)用愈创木酯酊同脓作用产生蓝色证明组织中有过氧化物酶的存在； P.Ehrlich(1885) 发现了细胞色素氧化酶；R. Heidenhain(1868) 指出动质（ergastoplasm）—核糖核酸是一种嗜硷性物质，可被醋酸沉淀；F. Miescher(1873)利用甲绿对核染色质的选择性亲和力，分离出核染色质。 null自A. Bencke(1862)将苯氨染料用于组织学领域，许多研究者在组织中应用了染色反应，相继各种蛋白质被染色出来。到19世纪末，胶原蛋白染色，脂肪的苏丹Ⅲ染色以及组织中金属盐类的显色等技术方法得到发展。但是由于化学知识的贫乏和显微镜技术的停滞在一定时期限制了组织化学的发展。 null20世纪30年代，随着生物化学的发展和电子显微镜技术的应用，组织化学迎来了复兴时代。自从E. Takamatsu（高松英雄）和G. Gomori 1939年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的30年间，酶组织化学得到了飞速发展，高松证明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。 null此间，金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法（tetrazolium salts method）以及磷酸化酶组织化学证明法等相继问世。特别是H. Scheldon和D. Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷酸酶，奠定了电镜酶组织化学（electron microscope enzyme histochemistry）基础。后来A. M. Seligman(1967)提出锇黑化法（Osmification method）进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。二、组织化学技术的基本要求二、组织化学技术的基本要求1．尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。为此必须选择适当的固定液和恰当的处理方法，如冷冻干燥、冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。 2．化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不移位，不弥散。 null3．反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。 4．反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。 5．反应物有灵敏性和特异性,以利于对比观察。 6．反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。 一、组织化学的特征一、组织化学的特征 组织化学是应用物理的和化学的方法来查明细胞组织的化学成分；是用组织学、化学、物理学原理研究细胞组织的结构、功能与化学的关系；是对细胞组织成分的勘察、定位、定性、定量的特征来认识细胞组织结构与功能的关系。因此，它具有较强的特征性。 null1.   组织化学的要求 组织化学是建立在组织细胞形态学、生物物理学、生物化学及分子生物学学科基础上的一门边缘学科，因此组织化学研究具有如下要求： （1）要求形态结构真实完整。 （2）要求显色全过程均属于化学反应。 （3）要求化学反应在组织细胞的原位被显示 （4）要求弄清化学成分与形态结构及空间的关系。 null2．研究方法 组织化学的研究方法随着现代物理、化学技术的发展而不断更新，不断增多。总体说来，可分为两大类：一类是分离分析法，另一类是原位分析法。 （1）分离分析法 分离分析法是将组织细胞的微小器官从器官、组织、细胞内原位分离出来，测定其化学成分和分析化学组成与组织细胞的关系。其中包括匀浆超速离心及分层分析法和显微解剖分析，即组织切片的微量化学分析法。 null2）原位分析法 组织细胞在器官原位上不经分离，用化学试剂与组织细胞内的某些物质进行化学反应，最终在局部呈现有色反应，通过显微镜及其他仪器，如分光光度计、荧光显微镜等组织细胞内的化学反应进行定位、定性和定量研究。常用的方法包括：①组织细胞吸收光谱分析法。②荧光分析法。③放射自显影术。 组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。二、组织化学实验的基本条件二、组织化学实验的基本条件 组织中的各种物质可籍特殊的化学反应被勘定。组织化学需要各种化学试剂，许多著名的组织化学研究室均有合成化学试剂的实验室，以保证创建或改进组织化学的技术方法。良好的组织化学方法必须具备下列条件： null1、反应要具有专一性。 2、高度稳定性、重复性。 3、必须保持组织结构的完整性。 4、能够作对照实验。 5、反应产物必须呈现颜色。 6、反应结果必须是不溶性的有色沉积。 7、必须已知化学反应的全过程及影响反应的 理化因素。 8、必须了解制片的过程对组化反应的影响。 null 研究组织细胞的化学及其化学反应机制是为了了解机体器官、组织、细胞生