酶的固定化技术及应用[1]

!""# $%&! ’()*+, $%&-"# ./*0+ 1)(2*03 ForumandSummary 固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一项生 物工程技术!是使生物酶得到广泛而有效利用的重要手 段" 酶的固定化# Immobilizationofenzymes$是用固体 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 将酶束缚或限制于一定区域内!进行其特有的催化 反应!并可回收及重复利用的技术[1]%与游离酶相比!固 定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的 同时!又克服了游离酶的不足之处!呈现储存稳定性高& 分离回收容易&可多次重复使用&操作连续可控&工艺 简便等优点" 固定化酶的研究不仅在化学生物学&生物 工程医学及生命科学等领域异常活跃!而且因为具有节 省能源与资源&减少污染的生态环境效应而符合可持续 发展的战略要求[2-3]" $ 固定化酶的性质及固定方法 1.1固定化酶的性质 酶在固定化后稳定性得到提高!活性和催化底物均 有所变化" 研究发现[4]!对2%的PGK’ 青霉素G酰化酶$ 溶液在37!于不同的pH值测定游离酶和固定化酶的活 性!得知游离酶最适的pH值为8.0!固定化酶的最适pH 值为8.5"在碱性条件下!固定化酶对pH值的变化不如游 离酶敏感!说明固定化增加了酶对抗不良pH条件的能 力" 对2%的PGK’ 青霉素G酰化酶$溶液!当pH值为8.0 时!在不同温度测定游离酶和固定化酶的活性!发现游 离酶的最适反应温度为40!!而固定化酶的最适反应温 度为45!!在高于45!时!固定化酶活性下降趋势明显 低于游离酶!酶在固定化后温度的适应范围变大!酶的 最高催化活性条件下的pH值保持不变" 1.2酶的固定化方法 1.2.1吸附法 利用形成离子键&物理吸附等方法!将酶固定在纤 维素&琼脂糖等多糖或多孔玻璃&离子交换树脂等载体 上的固定方式" Mojovic等[5]将从Candidarugosa’ Candidasp.为念珠 菌属$中提取的脂肪酶吸附固定在大孔共聚物载体上! 在最优条件下最大吸附量为15.4mg/g! 酶固定效率为 62%" 动力学研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明!脂肪酶是通过局部化学反应选 择固定在载体上" 在卵磷脂’ 异辛烷$存在下!固定酶水 解椰子油!酶活力为游离酶的70%!重复使用15次后!固 定酶活性仍保持其最初活性的56%" Kamata等[6]在恒温 30!&24h条件下的水溶液中!将胰蛋白酶和!-淀粉酶固 定在珠状糖基蛋白上!实验过程无任何化学改性!所获 得的固定化酶相对于固定在阴离子交换剂’ 器$或脱乙 酰几丁质上的酶!有较长的生命周期" 任广智等[7]研究 收稿日期(2006-03-06)修回日期(2006-04-03 作者简介(胡和兵’ 1985-$!男!湖南安乡人!大学本科)何明中*!副教授!通讯作者!主要从事物理化学和生物化学的研究% 酶的固定化技术及应用 胡和兵!王牧野!吴勇民!何明中* ’ 中国地质大学 材料科学与化学工程学院!湖北 武汉 430074$ 摘 要(固定化酶是酶工程的核心!利于实现酶的重复利用及产物与酶的分离% 该文介绍了固定化酶的性质&制备技术以及固 定化酶技术中应用的载体% 并阐述了该技术在工业领域中的应用和存在的问题% 关 键 词(固定化酶)性质)载体)应用 中图分类号(%&’()* 文献标识码(+ 文章编号("!4564"7-’ !""# $"!6"""(6", Technologyofimmobilizedenzymeanditapplication HUHe-bing,WANGMu-ye,WUYong-min,HEMing-zhong* (CollegeofMaterialScienceandChemicalEngineering,ChinaUniversityofGeosciences,Wuhan430074,China) Immobilizedenzymeisthecentralpartofenzymeengineering.Itbenefitsthereuseofenzymeandtheseparationofproductanden- zyme.Thecharacteristicsofimmobilizedenzyme,technologyofpreparationandthevectorusedinimmobilizedenzymewereintroducedin thispaper.Theindustrialapplicationofthistechnologyandtheproblemexistedwereemphasizedinthepaper. immobilizedenzyme;character;vector;application (* * !""# 年 第 ! 期 总第 $"# 期 中 国 酿 造 专论与综述 了磁性壳聚糖微球对脲酶的吸附固定!结果表明!磁性 壳聚糖微球对脲酶的固载量与其粒径交联度及酶溶液 的离子强度成反比! 固定化脲酶的最适反应温度为 80!!比游离酶提高了10!!固定化脲酶的最适pH值变 化不大" 1.2.2共价键合法 先借助于一些方法!在载体上引进一活泼基团!然 后!此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应!形成共 价键的方法[7]" 该方法常用的双功能试剂有戊二醛#己 二胺#顺丁烯二酸酐#双偶氮苯等!其中戊二醛应用最 广泛[8]!有研究认为其反应属于动力学二级反应[9]" 1.2.3包埋法 主要分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法"凝胶包埋法 是将酶或酶菌体包埋在凝胶内部的微孔中!而微胶包埋 法是将酶包埋在高分子半透膜中" Markvicheva等[10]将细 胞或酶包埋固定在大孔复合聚$N-乙烯基己内酰胺%-藻 酸钙$ PVCL-CaAlg%水凝胶上!并研究了固定酶的热稳定 性和储存稳定性以及酶在水$ 有机%介质中的性能!实验 表明!酶在65!~80!仍可使用!而天然酶在50!~55!时 就完全失活" 1.2.4新型固定化技术 有人分别采用辐照聚合法[11]和引发聚合法[12]"以丙 烯胺为单体!NN-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂制备聚丙 烯酰胺凝胶" 在水合肼和Na2B4O7存在制得聚丙烯酰胺 固定酶" $ 酶固定化过程中应用的载体 固定化酶应用的载体主要分为有机高分子载体# 无机载体和复合载体3大类!与无机载体材料相比!有机 载体具有易成型和结合酶量高等优点[13]" 2.1有机高分子载体 主要有天然高分子载体材料和合成的高分子载体 材料"天然高分子载体材料一般无毒性!传质性能好!但 是强度低"常见的有琼脂#海藻酸钠 #壳聚糖等 "Subra- manian等[14]用经CNBr活化和碱处理过的纤维素载体固 定青霉素酰化酶$ PA% !青霉素酰化酶的固定化效率为 80%~85%"当青霉素G的浓度高于80g/L时!未观察到底 物和产物对固定化酶的抑制作用" 在40!时!固定化酶 裂解60g/L的青霉素G钾盐10次以上!没有观察到活性损 失" PA固定后!活性为4.3U/g!在水解反应中!催化活性 可保持10h!随后出现了明显的下降[15]" Guisan等[16]最先 报道了表面富含醛基的琼脂糖对PA的固定化作用!固 定化酶经过NaBH4处理后用于6-APA的生产" 在此基础 上!他们又研制出了乙酰基-SepharoseCL凝胶!固定化 酶的活性和稳定性进一步得到提高"对琼脂糖凝胶固定 PA的机理性研究发现!琼脂糖凝胶中的醛基可使酶以 多点共价结合的方式被固定!结合酶的能力很强!可制 备活性高的固定化PA!固定化酶的活性高达200U/g[17]" 合成的高分子载体材料主要有聚丙烯氰类#聚丙烯酰 胺#凝胶聚丙烯酸类聚合物等" 徐冠珠等[18]对PA在聚丙 烯纤维上的固定化进行了许多的研究"将巨大芽孢杆菌 青霉素酰化酶以共价结合的方式偶联于聚丙烯腈纤维 载体制成固定化PA!应用于水解青霉素G制备6-APA! 活性高达2000!/g!重复使用20次!保留活性的80%" 固 定化酶催化合成头孢氨苄的活性达153U/g!重复使用50 批次!保留活性为83.9%" 2.2无机载体 早期采用的无机载体材料有膨润土#氧化铝和玻璃 等"这些材料能与酶吸附结合!但结合酶的能力颇低!1g 载体结合酶的量往往低于1mg"后采用表面功能化的二 氧化硅凝胶和微球[19]#陶瓷#!-三氧化二铝[20]#海藻石和 大孔玻璃[22]等固定PA!但由于受到载体材料的孔径#比 表面积#颗粒粒度等因素的限制[21]!固定化酶的活性难 以得到很大的提高" 近年来!材料科学的迅速发展拓宽 了无机载体固定化PA的研究!特别是以离子型层状材 料和介孔分子筛固定化PA形成了新的亮点" 层状材料 因其在化学结构上的特殊性为固定化酶的研究者提供 了新思路[22]"它一般是由正电性的板层与层间负电性的 阴离子构成的无机材料!阴离子可与其它阴离子交换而 达到调节板层间距的效果!它能够通过控制反应调节层 间可反应性基团含量!使其对酶分子具有良好的亲和 性!有利于酶活性的保持和寿命的延长" 还有一种应用 比较广泛的无机载体是介孔分子筛!M41s系列中孔分 子筛是1992年美国Mobile公司的研究人员首次使用烷 基季铵盐型阳离子表面活性剂为模板剂合成的新型沸 石材料[23]!具有1.3nm~30nm可调的较大孔径#高的比表 面积#较小的扩散阻力[24]#孔道表面富含弱酸性的羟基[25]" 介孔分子筛固定化酶一般是以载体与酶分子之间的氢 键作用或修饰后与酶分子共价结合来实现" 2.3复合载体 利用有机聚合物载体键合蛋白能力强#易成型及无 机聚合物载体刚性的大孔结构特点!可使二者结合成复 合载体"Bahar[26]研究表明!磁性体Fe3O4与聚苯乙烯含醛 化合物一起混合可以制得磁性载体!其固定化葡萄糖氧 化酶保留活性可达70%"Hoffmann等[27]用N-异丙基丙烯 酰胺同丙烯酰胺共聚得到热可塑性凝胶载体!通过载体 上的琥珀酰亚胺酶固定在该载体上!通过温度来调节其 膨胀和聚沉" % 固定化酶的应用 && & !""# $%&! ’()*+, $%&-"# ./*0+ 1)(2*03 ForumandSummary 3.1医药领域 固定化脲酶脲酶!是催化尿素分解的专一性水解 酶"应用于尿素生产控制和产品检验"也广泛用于临床 医学#医学检验等"固定化脲酶在血液透析中有着极佳 的应用前景[28]$ Cellapandian等[29]在壳聚糖上接枝甲基 丙烯酸缩水甘油酯% GMA& "GMA的环氧基团开环与脲 酶的氨基缩合制得固定化脲酶"其活性保留达86.15%’ 4!和25!保存60d后活性仍保留73.0%和58.05%"这种 固定化酶用于血液中尿素的脱除和人工肾透析液的再 生都取得了很好的效果’ 固定化磷酸酯酶!人体中的低密度脂蛋白是主要的 血浆胆固醇载体"由于其在体内代谢缓慢"易形成高血 浆胆固醇"以至引起心血管疾病’ 磷酸酯酶的作用就是 水解低密度脂蛋白上的磷脂"加速体内低密度脂蛋白的 代谢’ Chen[30]等先用碳化二亚胺对磷酸酯酶进行活化" 再用壳聚糖进行固定"同时控制碳化二亚胺与酶的重量 比不大于10"磷酸酯酶与壳聚糖的重量比不小于10-3"所 得固定化酶能使血浆胆固醇降低32.0%’ 固定化葡聚糖酶!葡聚糖酶常用于水解在血液替代 品的制备过程中产生的右旋糖酐’Mohamed等[31]用物理 吸附和共价交联2种方法制备了壳聚糖固定化葡聚糖 酶"发现共价交联法获得的固定化酶的相对酶活性最高 达63.0%"而且固定化酶的最适反应温度也从游离酶的 60!升高到80!"其催化能力比游离酶提高3倍’ 固定化脂肪酶! 布洛芬是一种常用的非甾体类抗 炎药物"有解热#镇痛#消炎和抗风湿作用"它有S% +&型 和R% -&型2种对映体"但只有S% +&型布洛芬有生理作 用"R% -&型的布洛芬不但没有生理活性"而且具有毒副 作用’ 传统的化学方法很难对光学异构体进行拆分"赵 国俊等[33]用自制的高脱乙酰度#高分子量的壳聚糖"通过 成囊装置包埋含有不对称水解布洛芬酯的脂肪酶的丝 孢酵母进行固定化"并且戊二醛交联"制得直径1.0mm 左右的固定化酵母细胞壳聚糖多孔微球"酶活性保持超 过80.0%"操作半衰期超过75d"而且固定化酶的最适反 应温度从未固定化时的35!提高到45!’ 3.2环保领域 固定化酶在环保领域和生命健康领域中有广泛的 应用’D"Annibale等[33]用壳聚糖吸附漆酶后"再以1.0% 的戊二醛进行交联固定"所得固定化漆酶的热稳定性得 到了很大的提高"在75!和80!固定化酶分别保持了 65.0%和50.0%的相对活性 "而游离酶仅有35.0%和 12.0%的相对活性’ 多酚氧化酶也是一种将芳香类和酚 类物质氧化为醌类化合物的酶’ Edwards等[34]用聚砜毛 细管膜复合壳聚糖凝胶吸附多酚氧化酶制备固定化 酶"其活性保持了83.0%"与传统的聚砜毛细管固定的 多酚氧化酶相比"8h内前者可清除1224mg污染物"而后 者只能清除20.3mg污染物’张寒飞[35]等用磁性固定化漆 酶去除苹果汁中的酚类物质发现"以磁性聚苯乙烯为载 体"戊二醛为交联剂制得的磁性固定化漆酶与底物亲和 力显著提高"其热稳定性#贮存稳定性和 pH稳定性较 游离漆酶均有所增强"苹果汁经固定化漆酶在40!处理 2h后"其多酚含量减少20%"而酶活性没有变化’杨雪梅 等[36]选用硅胶#活性炭#大孔树脂3种载体"在一定条件 下用物理吸附法固定蛋白酶"3种载体固定的蛋白酶对 含高浓度蛋白质的淀粉黄浆废水进行水解实验" 发现 大孔树脂对蛋白酶的固定效果良好" 并对含高浓度蛋 白质的废水处理效果最好"其最佳反应的pH值为5.5"反 应进行0.5h"酶的催化效果最好" 氨基酸产生速度达 30.82mg/min"且在3h后该速度仅减少3.74mg/min(6h 对蛋白质的去除率达到39.93%’ 臭氧在潮湿的空气中 容易生成过氧化氢"Akku等[37]以膜状壳聚糖为载体吸 附过氧化氢酶"与过氧化氢电极结合对低浓度臭氧达到 了简便快速检测’ 3.3食品工业 在饮料加工过程中利用漆酶可以氧化酚类物质" 使其聚合"这既可使果汁在加工过程中快速澄清"又解 决了果汁长时间储存所产生的后浑浊问题(且不用聚 乙烯吡咯烷酮#活性炭及吸附剂处理"污染问题少’有报 道显示可将固定化的漆酶用于苹果汁的澄清和儿茶酸 的去除[38]’ 淀粉酶及糖化酶是现在仍在研究的固定化生物催 化剂’ 将糖化型淀粉酶吸附在二乙氨乙基纤维素上"作 为催化剂并悬浮在30%的淀粉溶液中"在55!搅拌水 解"几乎可定量连续地得到葡萄糖溶液’ 淀粉酶及糖化 酶能催化淀粉转化为葡萄糖"是较早研究并仍在研究的 固定化生物催化剂"!-淀粉酶与糖化酶的共固定化实 现了淀粉的液化与糖化2步反应的合二为一# 淀粉一步 水解为葡萄糖且操作半衰期可达920h"而当!-淀粉酶# 糖化酶及葡萄糖异构酶共固定化时又可使淀粉转化果 糖’不仅如此"酶尚可与细胞等其他生物分子构成共固 定系统’2种或多种有联系的酶共固定化构成更为复杂 的生物转化系统"能将复杂的生物反应过程简单化"是 颇具新意的研究思路’ 其次"淀粉及纤维素是地球上贮 量丰富的可再生资源"通过固定化酶催化水解实现其高 附加值转化"符合社会经济可持续发展的时代要求"如 固定化蜗牛酶对纤维素的降解具有良好的酶催化活性’ 固定化酶应用于食品检测!固定化酶技术的发展使 生物传感器应运而生’ 它的问世不仅使食品成分的快 ") ) !""# 年 第 ! 期 总第 $"# 期 中 国 酿 造 专论与综述 速!低成本!高选择性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 测定成为可能"而且生物传 感器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量 控制"降低食品生产成本"并给人们带来安全可靠及高 质量的食品[39]# $ 展望 目前"酶固定化技术已在食品工业!精细化学品工 业!医药"特别是手性化合物等行业得到广泛应用"在 废水处理方面也取得了一定进展$ 随着人类对环保的 日益关注"酶的应用会更受关注"如何充分利用天然高 分子载体"对其改性或利用超临界技术%纳米技术!膜 技术等来固定酶"必定会成为研究的热点$ 同时"开发 新型!高效固定化酶反应器"进一步提高转化率和生产 能力"也是未来研究的重点$ 而固定化酶在各行业的应 用研究也必将推动酶固定化技术的发展$ 参考文献& [1]李彦峰"李军荣"伏莲娣.固定化酶的制备及应用[J].高分子通 报"2001"13-23. 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