SiRNA说明书

siRNA产品使用说明 (2011-06-15 15:38:23) 转载▼ 标签： 使用方法 细胞实验 sirna 细胞培养 杂谈 分类： siRNA 产品简介 常规化学合成siRNA为21-25nt的双链小分子RNA，即用型。 运输与保存 产品一般以冻干粉的形式常温运输。收到产品后，请于 -20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年以上。使用前请用灭菌的RNase-free H2O或者灭菌的ddH2O，配制成20μM溶液，建议分装保存，避免反复冻融 (尽量不要超过5次)。如需要长期保存，产品请以冻干粉形式保存。 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1 20μM存储液的配置 siRNA(nmol) 0.25 0.5 1 2 5 20 溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行筛选试验，可选择以96孔板密封的冻干粉或液体形式提供的siR-RiboTM siRNA Library 使用方法 产品已经经过纯化、退火等处理，只要用灭菌的ddH2O或RNase-free water溶解即可直接转染细胞或供动物实验使用。为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。   细胞实验 为了降低因细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议： a. 每次转染实验时，每个转染样品至少设置3个复孔； b. 接种细胞时，尽量接种相同或相近数量的细胞于细胞培养板，使细胞在各孔的表面均匀分布。 1. 转染浓度： 最佳转染效率一般设置时间曲线和浓度梯度进行测试，推荐初始的转染时间为6h，转染后检测的时间为24-72h，初始转染浓度是50nM，可视具体情况优化，建议优化转染浓度梯度为100nM，50nM，30nM，20nM，10nM (表2)。 2. 转染步骤：以lipofectamineTM 2000(简称lipo2000) 转染siRNA于24孔细胞培养板为例，其他 规格 视频线规格配置磁共振要求常用水泵型号参数扭矩规格钢结构技术规格书 容器转染请参考表2。 1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%汇合度 (不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过密可能会削弱细胞活力，导致细胞转染效率的降低。 2) 对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA-lipo2000混合液： a. 稀释siRNA：用50μl不含血清培养基Opti-MEM®Ⅰ(v2)稀释25pmol siRNA (加入细胞中的RNA终浓度50nM)，轻轻混匀，室温孵育5min； b. 稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基Opti-MEM®Ⅰ(v2)稀释1μl lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5 min； c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。 注：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA混合。混合试剂请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏试剂中脂质体结构及siRNA-lipo2000混合物的形成。 3) 将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞以及培养液(v1)的培养板各孔中，轻轻混匀； 4) 将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养24-96h (检测时间与研究实验目的有关。培养4~6h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，也可以进行其他必要的特殊处理(如加药处理)。 表2 使用lipo2000(invitrogen)转染siRNA产品用量参考 V1：完全或不完全培养基；v2: Opti-MEM® I (无血清、无抗生素，转染专用)   每孔中总体积(v1+v2+v2) 终浓度 siRNA lipo2000 DNA共转染† 96-well 100μl (50μl+25μl+25μl) 100nM 0.5μl 0.25μl 10-100ng   100μl (50μl+25μl+25μl) 50nM 0.25μl 0.25μl 10-100ng   100μl (50μl+25μl+25μl) 30nM 0.15μl 0.25μl 10-100ng   100μl (50μl+25μl+25μl) 20nM 0.1μl 0.25μl 10-100ng   100μl (50μl+25μl+25μl) 10nM 0.05μl 0.25μl 10-100ng 24-well 500μl (400μl+50μl+50μl) 100nM 2.5μl 1μl 100-200ng * 500μl (400μl+50μl+50μl) 50nM 1.25μl 1μl 100-200ng   500μl (400μl+50μl+50μl) 30nM 0.75μl 1μl 100-200ng   500μl (400μl+50μl+50μl) 20nM 0.5μl 1μl 100-200ng   500μl (400μl+50μl+50μl) 10nM 0.25μl 1μl 100-200ng 12-well 1mL (800μl+100μl+100μl) 100nM 5μl 2μl 200-400ng   1mL (800μl+100μl+100μl) 50nM 2.5μl 2μl 200-400ng   1mL (800μl+100μl+100μl) 30nM 1.5μl 2μl 200-400ng   1mL (800μl+100μl+100μl) 20nM 1μl 2μl 200-400ng   1mL (800μl+100μl+100μl) 10nM 0.5μl 2μl 200-400ng 6-well 2mL (1500μl+250μl+250μl) 100nM 10μl 5μl 500-1000ng   2mL (1500μl+250μl+250μl) 50nM 5μl 5μl 500-1000ng   2mL (1500μl+250μl+250μl) 30nM 3μl 5μl 500-1000ng   2mL (1500μl+250μl+250μl) 20nM 2μl 5μl 500-1000ng   2mL (1500μl+250μl+250μl) 10nM 1μl 5μl 500-1000ng *：实验参考用量示例；当实验涉及DNA共转时参考 3. 效果检测： 转染完成后24~72小时均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与使用的细胞类型有关，可通过分时检测来优化。 1) mRNA 水平的检测：mRNA是检测siRNA沉默效率的最好指标，一般来说siRNA转染后24~72h即可以检测到靶mRNA水平明显降低，检测方法一般采用Real-time PCR定量检测(引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 质量很重要)。 2) 蛋白水平的检测：蛋白水平的检测通常需要借助抗体或报告基因系统检测。检测手段有Western-blot、免疫组化等。检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响，一般为48~96h，甚至更长时间之后多点采样。 3）功能筛选：应用EdU细胞增殖、EdUTP细胞凋亡等检测试剂盒进行siRNA对细胞功能的直接筛选。 动物实验 动物模型：根据实验需要选择合适的动物模型，以小鼠最为常用，用量较小(表3)。 修饰方式：由于动物实验对siRNA稳定性的 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 较高，尽管未修饰的siRNA也可以进行动物实验，但是以Chol，OMe，PS修饰的siRNA最为常用，效果较好。 给药方式：静脉给药：适合心、肝、肾、肺、原位瘤等血流丰富的组织器官；呼吸道给药：适合呼吸系统；腹腔给药：适合腹腔和盆腔内脏器，胰、脾、肾、卵巢等；颅内给药：脑部，适合中枢神研究；局部给药：眼、皮肤、子宫腔、阴道、移植瘤等。 效果检测 ：锐博生物提供标记有Cy3、Cy5的siRNA可以进行实时观测药物分布，其他效果检测应根据实验目的进行设置。 表3 动物siRNA实验使用方法参考 *: 更多信息请点击www.siRNA.cn/siRNA/invivo.aspx   Reference Animals Tissue Gene Modification Doses Dosing Frequency   Mice Tumor   -Chol,-OMe,-PS 1 nmol Twice/week，4 weeks Höbel S ,et al. J Gene Med 2010 Mice VEGF -F,-OMe,-PS 1.3 μg Day 0 M. DiFiglia, et al. PNAS. 2007 Mice Brain Htt -Chol,-OMe,-PS 1 nmol Day 0 Wang H,et al.J Biol Chem. 2008 Mice SOD1 -F,-HS 4 µg Continuous 28 days Lewis J, et al. Mol Neurodegener. 2008 Mice SNCA -OMe,-PS 180 nmol Continuous 15 days Xiong SQ, et al. Ophthalmologica. 2009 Mice Eye EPO None 5 µg Day 0 Kleinman ME，et al. Nature. 2008 Mice VEGF -Chol,-OMe 1 μg Day 0 LI Xi, et al. Chinese Journal of Pathophysiology.2008 Rat Liver Fas None 40 nmol Day 0 Soutschek J,et al. Nature. 2004 Mice apoB -Chol,-OMe,-PS 1.25 mg Continuous 3 days Zimmermann TS, et al. Nature. 2006 Monkey apoB -OMe,-PS ~15mg Day 0 Tompkins SM,et al. PNAS. 2004 Mice Breath Influenza None 20 µg Day 0 Rosas-T,et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009 Mice XCL1 None 10-15 µg Day 0 Yuan H,et al. Am J Physiol Renal Physiol. 2008 Mice Kidney Alox15 -Chol,-OMe,-PS 400 µg Continuous 7 weeks Gonzalez-Gonzalez E,et al. Gene Ther. 2009 Mice Skin CBL None 60 µg Continuous 12 days Yichao Wu, et al. Cell Host Microbe. 2009 Mice HSV-2 -Chol, -PS 2 nmol Day 0   为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 1.纯化siRNA 在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个 步骤不受RNA酶污染非常重要。 3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时 间明显下降。 4.避免使用抗生素 Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。 5.选择合适的转染试剂 针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。 6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或 mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。 7.通过标记siRNA来优化实验 荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中 导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起