精液的保存和运输

北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56精液的保存和运输冷冻保存精液冷冻保存(Semenfreezing)是利用液氮(－196℃)、干冰(-79℃)或其他冷源，将精液经过适当处理后，保存在超低温下，以达到长期保存精液的目的。(一)精液冷冻保存原理精子在冷冻状态下，它的代谢几乎停止，活动完全消失，生命以相对静止状态保持下来，一旦温度回升，又能复苏活动。所以，从理论上讲，冷冻精液的有效保存时间是无限的。然而在目前的冷冻方法中，精液内只有部分精子能够经受冷冻，升温后可以复活，而另一部分精子由于在冷冻过程中，造成了不可逆转的变化而死亡。例如，牛精子，经过冷冻和解冻后一般有30～50％(因公牛个体而异)的活精子死去。所以解冻后呈直线前进运动的精子通常只有40～50％。如何解释精液在冷冻保存过程中，部分精子发生不可逆性死亡，而另一部分精子又能升温复苏?对此，有关研究工作者作过许多探索与解释，其中比较能为大家公认的当推玻璃态假说，其次是微晶态假说。物质的存在形式，可分为气态、液态和固态。固态又分为结晶态(冰晶态)和玻璃态两种形式。在不同的温度及其他条件下，这种形式可以互相转化。譬如，当气态的物质向绝对零度降温时，越过沸点，就转变为液态；当温度进一步降低而越过熔点时，液态就又转变为固态。这时的固态形式可能有两种情况：如当温度是缓慢下降的，则液态出现结晶化(水分子按有序排列)转变成为结晶态；如果温度是迅速1北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56下降的，则液态来不及形成结晶(水分子保持原来无次序排列)，便转变成为玻璃态(或均匀的细小结晶态)。相反，当缓慢升温时，玻璃态又可循原来的规律依次向相反方向运转，即先变为结晶态，然后再变为液态和气态；但如果是快速升温，则玻璃态可越过结晶态而直接变为液态和气态。根据上述物质形态转变的基本规律和原理，玻璃态假说认为精子复苏的关键，是精液冷冻保存过程中，在冷冻保护剂的作用下，防止精液水分冰晶化(结晶化)，而形成玻璃态。冰晶化是在一定条件下的降温过程中，水分子重新按几何图形排列形成冰晶(结晶体)。在精液冷冻过程中，水分子的冰晶化(即结冰)是造成精子死亡而不能再复苏的主要原因。因为结冰是首先在精子外的水分——精清和稀释液中的水分开始形成冰晶的，从而使尚未结冰的那部分的溶质浓度增高，以致形成高渗溶液。这时由于精子内外两方面的水分的浓度差，以及冰和水的表面蒸气压差的关系，精子内部的水分经过细胞膜而向外渗透(结冰速度越慢，精子内部水分向外渗透性越强)，致使精子本身造成脱水状态，原生质变干，电解质浓度增高，酸碱度失去平衡，因而精子遭受化学淹渍而死亡，这也就是所渭精液的冰晶化导致的化学性伤害。其次是由于精清和稀释液中的大部分水分形成冰晶后，其体积显著增大，以及冰晶块的增大和移动，对精子细胞原生质膜产生机械压力和刺伤，使其失去细胞膜的保护作用，继而发生冰晶渗入精子内部而破坏内部的结构，导致精子死亡，这就是所谓精液的冰晶化造成的对精子的物理性伤害。此外，冰冻过2北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56程中也可能有一部分精子内部的自由水来不及渗透出来，而直接在精子内部形成冰晶，从而如上述更加造成对精子内部结构的破坏。玻璃化是在一定条件下的降温过程中，水分子保持原来无次序的排列，呈现纯粹玻璃样的曲微粒结晶而结实均匀的冻结团块(即玻璃化冻结)。精子在玻璃化冻结状态下，不会出现原生质脱水，结构受到保护，解冻后的精子仍可恢复恬力。上述精液的冰晶化和玻璃化的形成条件各不相同：冰晶化必须在0～－60℃低温区域(冰晶化危险温度区)内，而且只在缓慢降温的条件下才能形成。降温越慢，冰晶越大，其中尤以－15～－25℃(冰晶化最危险温度区)冰晶化对精子的危害最大。玻璃化必须在－60～－250℃的超低温区域(玻璃化温度区)内，而且必须从冰晶化强度区域内开始，就以较快或更快速度降温，迅速超越冰晶化阶段而进入玻璃化阶段，使水分子形成极小的冰晶或来不及形成冰晶就已呈玻璃化冻结。但玻璃化是可逆而不稳定的，当冷冻精液解冻升温时，如果升温缓慢，经过冰晶态温度区域时，玻璃态可循原来规律向相反方向进行，先变成冰晶态而后再变为液态，同样会造成对精子的不可逆性危害。但如果快速升温解冻，玻璃态可越过冰结晶态而直接变为液态。综上所述，在冷冻精液的制作和使用过程中，无论降温或升温都必须采取快速越过对精子产生不可逆性危害的冰晶化温度区，使冰结晶来不及形成便已直接转变为玻璃态或液态。由于目前所采取的降温和升温措施，还达不到完全玻璃化的程度。所以，在精液冷冻技术研究发展过程中，采取在稀释液中添加甘3北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56油等抗冻物质的措施，可以增强精子抗冻能力，对防止冰晶化具有重要作用；是精液冷冻保存技术改革中的一项重大突破，其机理也与玻璃态假说有关。甘油(丙三醇)属多羟基化合物，每个分子有三个羟基(-OH)，羟基与水形成氢键，因此甘油具有很强的亲水性，它可以在水结晶过程中，限制和干扰水分子晶格的排列，阻碍水形成冰晶；又由于甘油可以渗透精子细胞内外，使两者的蒸汽压相近，从而降低精液的冰点，使精液处于过冷状态，从冰晶化危险温度区的上限缩短危险温度区；甘油渗入精子内部，使游离水和一些盐类排出，减轻了电解液浓度增加带来的不良影响；甘油还可保护精子细胞内的谷氨酸——草酰乙酸转氨酶(GOT)免受冻害而逸出，而解冻后精子保留的GOT越多，则精子的活率愈高；此外，甘油又是很好的溶剂，具有杀苗作用。但是甘油浓度过高，对精子也有毒害作用，冷冻和解冻过程会加剧这种不良影响，特别是在常温下危害更大，高浓度的甘油可以损伤精子顶体和颈部，造成尾部弯曲、精子长度和体积缩小，破坏某些酶类，以致影响受胎率。所以，应尽量降低甘油的浓度。但不同畜种的精子对甘油浓度反应是不同的。如牛精液冷冻稀释液中甘油浓度高低，对精子活率及受胎率影响不大，一般牛精液冷冻稀释液中加入甘油浓度为5～7％。猪精液冷冻稀释液中甘油浓度增大时，冷冻精液的活率虽高，但受胎率极不理想，故一般限制甘油浓度为1～3％。至于绵羊一般控制在4～6％为宜。如前已述，除甘油外还有其他一些多羟基化合物(如DMSO、Tris、TES等)乃至糖类，也已成为冷冻保护性成分被广泛应用。4北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56(二)精液的质量要求实验和实践证明，精子的耐冻性个体之间的差异大于品种之间的差异。有人观察到冷冻效果不好的新鲜牛精液，精子顶体就有膨胀、脱落或破裂等异常现象。精子的耐冻性也随着种公畜年龄的增长而有变化。Hahn等(1969)试验表明，解冻后牛精子的活率，通常在3岁时最高；4岁以后表现为三种类型：有的公牛精子活率急剧下降，有的公牛精子活率逐渐降低，有的在10岁以上精子活率还能稳定在一定水平。日本佐佐江等(1977)进一步试验研究表明，2岁左右的公牛精子耐冻性不甚稳定，3岁左右时趋于稳定，超过5岁有逐渐下降的倾向。牛虽属无季节性发情周期动物类型，但在高温夏季也有“夏季不育”现象。根据住吉等(1981)和佐佐江等(1977)的试验研究表明，夏季采精制作的冷冻精液，要比11月份至翌年4月份制作的冷冻精液，解冻后存活时间较短，受胎率较低。同时他们还证明，在夏季精液出现耐冻性下降的时期，要比采出的新鲜精液活率下降时期大约推迟1个月的时间，可见根据精子发生周期原理说明，一旦发育成熟的精子即不易遭受高温潮湿环境的影响。如果能在精液性状良好的季节，抓紧尽可能多制作优良冻精，则可弥补精液性状恶化季节的不足。有关试验研究认为，采取间隔3天采精，1天内采精4次，精液量及精子活率均不受影响。精子的耐冻性，常以精子活力的复苏来衡量和比较。(三)精液冷冻保存稀释液冷冻保存精液稀释液的成分从理论而言，一般应含有低温保护剂5北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56(如卵黄、牛奶)、防冻保护剂(甘油等)、维持渗透压物质(糖类、柠檬酸钠等)、抗菌素以及其他添加剂。由此可见，冷冻保存精液稀释掖，一般都是在原有低温保存稀释液的摹础止，再添加一定的防冻物质。各种家畜常用的冷冻保存精液稀释液配方，分别如表5－13、5－14、5－15、5－16。根据配制的要求和稀释的需要，可将冷冻保存稀释液分别配制成如下三种溶液，以便于在生产中应用：基础液——将糖类、盐类等可经高温消毒的药品成份，成批量地配制成溶液，瓶装密封保存；I液－－根据每次采精量，计算所需冷冻稀释液量，在定量基础液中按配方比例加入一定量的卵黄和抗苗素等，由此配制成的第I液，用作精液的第一次稀释液；Ⅱ液－－取需要量的第I液，按配方比例加入经灭菌的甘油，由此制成的第Ⅱ液，用作精液的第二次稀释液。精液冷冻之后，因有半数以上的精子遭受冻害而死亡，故精液稀释液倍数，应按照解冻后需保证每头份精液中要求应含有直线前进运动的有效精子数来确定。为此，实际上应根据原精液呈直线前进运动的有效精子总数和冷冻精液解冻后预测精子活力来决定精液的稀释倍数，其计算公式如下：X=Y·M·V/Z式中：X为冷冻精液稀释倍数Y为每ml原精液中呈直线前进运动总精子数M为冷冻精液解冻后预测精子活力Z为每头份冷冻精液要求最低应含有直线前进运动精子数6北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56V为冷冻精液剂型容量由于细管型冷冻精液的容量为0.25或0.5ml，因此稀释倍数较低。而颗粒型冷冻精液前后需经两次稀释(冷冻稀释和解冻稀释)，每头份剂量为1.5～2.0ml，因此稀释倍数也就较高。例如根据我国牛冷冻精液国家 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 ，细管型冷冻精液容量为0.25ml，直线前进运动精子数不低于1000万个；颗粒型冷冻精液容量为0.1ml，直线前进运动精子数不低于1200万个；解冻后的精子活率均不得低于0.3。因此，如0.25ml细管型冷冻精液的稀释倍数(X)应代入上述公式为：X=直线前进运动精子数/ml*预测精子活率（≥0.3）*0.25ml/1000万(四)冷冻保存精液剂型凡作冷冻保存的精液均需按头份进行分装。目前已有塑料细管、玻璃安瓿、颗粒、塑料薄膜(袋)、载片及胶囊等剂型分装方法，目前通用的是前三种，并以细管型为主将取代其他剂型。但各种剂型分装方法，在标记、冷冻、保存及使用等方面都有各自不同利弊。1.塑料细管型以长125～133毫米，容量为0.25、0.5或1.0ml的各种颜色聚氯乙烯复合塑料细管，通过吸引装置将稀释、降温、平衡后的精液进行分装，用聚乙烯醇粉末、钢球或超声波静电压封口，置液氮蒸汽上冷冻，再浸入液氮中保存。塑料细管型冷冻精液法是本世纪60年代中期才兴起的冷冻精液新 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 。开始时是多用注射器进行手工分装、7北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56手工封口。后来随着大型人工授精中心的建立，冷冻精液生产昔及和生产量加大，国际间冻精进出口贸易的增加，因而促使在细管印字标记、分装、封口乃至冻后精液细管计数、包装等方面，都相继研制出半自动和全自动化仪器设备。如法国凯苏公司生产的细管精液分装机，每小时分装细管精液可达4000～12000支，配套每批次可冻制数百支细管精液。目前大多采用0.25ml的微型细管，提高了精液的利用率。2.颗粒型一般是将精液滴冻在经液氮预先冷却的塑料板或金属板(网)上，制作为约0.1ml的颗粒，也可将精液直接滴入于冰洞穴中。颗粒冷冻法最初用于牛精液，以后扩展应用在马、绵羊、山羊、鸡、狗、猫、鹿、狼以及其他野生动物和人的冷冻精液制作，效果比较好。3.安瓿型最早采用是从50年代开始，是用硅酸盐硬质玻璃制成的安瓿盛装精液，剂量多为1.0ml，也有0.5ml的。其优点是：剂量标准；标记明显，密封而不受污染;不必再用解冻液解冻，使用方便；精子苏复率较高。其缺点是：制作工艺(特别是封口)繁杂，生产成本较高；破裂及封口不严的安瓿，解冻时易破碎；解冻后还需吸入输精器内使用；体积大，占用贮精罐空间大。故目前已很少采用。(五)精液冷冻保存冷源冷冻精液在制作和贮存期间，都要求保持在一定的超低温冷源条件下。过去曾以干冰(固体CO2)作为冷源(－79℃)，目前已普遍转为8北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56使用液氮作为冷源(－196℃)。至于液态空气(－192℃)、液态氧(－183℃)和液态氦(－269℃)等都曾进行试用研究，然而也由于有各自的缺点而被淘汰。如液氧易爆不安全；氦在空气中含量很少，制作液氦成本高。液氮是一种无色、无味、无臭、无毒的超低温液体，标准温度为－195.8℃。在气化时，每升可以从周围夺取200千焦(48千卡)热量，气化后温度上升至18℃时，体积膨胀680倍。此外，液氮为不活泼气体，其渗透性很弱，本身无杀菌能力，故精子、细菌、微生物等仍能在其中生存，只是－196℃的超低温可使多数细菌、病毒停止繁殖。由于液氮是超低温－196℃，距精液冰晶化危险温度区的温差很大，所以冷冻和贮存精液效果安全可靠。同时液氮的温度可以对流平衡，故在液氮容器中温度稳定，可以长期有效保存冻精，而活率下降极为缓慢。整个使用操作都十分方便。干冰是由二氧化碳气压缩而成的固态二氧化碳。当大气压低于三相点时(即压力低于534996，自5.28大气压时)，纯净的固态二氧化碳不经过液态而直接升华变为气体后不留水分和残渣，并吸收大量的热而使温度下降至－78～－79℃，二氧化碳气体为无色、无臭、无味、活性不强的气体，因此干冰也是一种良好的超低温冷却剂。(六)液氮容器液氮的容器，包括冷冻精液贮存容器和液氮贮运器两种。前者为贮存精液用，一般多为容积不等的液氮罐，大的有达数百立升，小的不到1立升。液氮贮运器为贮存和运输液氮用，有大容器的液氮槽、9北京博益伟业仪器有限公司http://www.bio-one.cn联系电话：010-64842355/56液氮车，也有小容器的运输液氮罐。目前冷冻精液使用的液氮罐，型号很多，但其基本结构相同(如图5－12)。1.内外壳体液氮罐由内外两层壳体构成，一般采用铝合金制造。2.内槽指液氮罐内胆中的空间。内槽底部有底座，供固定提筒用，液氨、提筒和冻精都置于内槽中。3.夹层指罐内外壳体间的空隙。是抽成高真空状态，为增进罐体的高绝热性能，夹层中还装有活性碳、硅胶等绝热 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和吸附剂。4.颈管是以绝热粘剂将罐内外壳体连接而成的长管。5.罐盖塞由绝热性能良好的塑料制成，具有减少容器蒸发和固定贮精提筒手柄的双重功能。6.提筒置于罐体内，其底部有多个小眼，以便液氮可以渗入其中。提筒用以贮存细管、安瓿及颗粒等各种剂型冻精。如上所述，液氮罐是比较精密的容器，它主要靠保持真空和减少导热而维持其正常超低温冷藏功能，为了发挥正常功能和保证安全，应注意正确使用和保养10