0-细胞生物学实验备考

---来源搜集，文内均可编辑---来源搜集，文内均可编辑PAGE3---来源搜集，文内均可编辑（一）显微镜的使用及保护①显微镜是细胞生物学实验的主要观察工具，使用时必须注意保持外观整洁、防湿、防高温、防药品侵蚀，使用时勿使染液或其它溶液沾污镜头，一旦沾污，及时用擦镜纸蘸上镜头清洗液（无水乙醚：无水乙醇＝7：3）轻轻擦拭干净。②带光源的显微镜待电压稳定后，将电源的光亮度调节器调至最小，再打开显微镜的电源，缓慢调节光亮度适当进行量度观察，观察完毕后，则先将光亮度调节器调至最小，然后再关闭显微镜电源开关。③镜头的清洗：实验完毕后，镜头的清洗很重要。用擦镜纸蘸取少量镜头清洗液，先从镜头的中央开始清洗，轻轻旋转擦至镜头的边缘部分，如此重复2－3次。④载物台必须保持清洁，必要时亦可用擦镜纸蘸少量清洗液擦试载物台。聚光器上的污物的去除亦可采用类似的方法。⑤使用完毕后，玻片一律取下，套上布袋.放回原处。本桌的显微镜一律不准搬离本实验桌。若需使用者，可到该桌使用，使用后务必保持该显微镜的清洁。（二）实验时，实验室内，一律不准高声喧哗整洁，保持室内安静，认真操作，仔细做好各项观察与记录。（三）实验室内的一切仪器、物品必须爱护。节约材料、药品，取用时不要过量。公用物品不得独自占用，用后归还原处。（四）注意安全。使用有毒物品、强酸、强碱等，应严格按照操作规程。易燃物品远离火源。禁止湿手拿取电源开关或接触电源。如发生触电等事故，及时报告。（五）取用各种试剂，要用及时盖上瓶盖。按献宝取出所需之药品或溶液后，不得将原液倒回瓶内。滴管、玻棒、吸管不可混用。（六）实验中如有丢失、损坏仪器设备及用具，及时登记并报告，凡违反操作规程造成不应有的损失者，视其情节轻重，态度好坏，按有关规定处理。（七）实验完毕后，须摆齐药品，洗净器皿，做好本桌清洁。离开前要关好门、窗、水、电。实验一、细胞形态及大小的观测显微侧微尺分为物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺）。目镜测微尺是一个可以放入目镜内的特制园玻片，玻片中央刻的刻度长5mm或10mm，将其分成50或100格（也有刻成十字形的）如下图。物微尺为一载片上贴着一圆形玻片中央带有刻度、长度为1mm，等分为100格，每一格长0.01mm（图一）。当测量细胞的大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。因目微尺测量的是细胞经物镜放大后的像，因而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需先用物微尺标定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测量细胞大小。1、如何测定目镜测微尺每小格所代表的长度？将物微尺刻度向上放在镜台上夹好，以低倍镜调焦能看到物微尺的刻度，换上你用来测量细胞的物镜。调焦至看清刻度，这时镜中同时看清两尺。小心移动物微尺和转动目镜，使两尺平行，起点线重合，如下图：然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间各尺的刻度数（格数），按下式计算。在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：目微尺每格所代表的实际长度（μ）=台微尺格数/目微尺格数*10（μ）2、在制作显微测量的样品时应注意什么问题？3、目镜测微尺每格代表的的实际长度受哪些因素影响？实验二叶绿体的差速离心分离与观察和线粒体的活体染色与观察将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。差速离心是利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无害毒的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。詹纳斯绿B（JanusgreenB）对线粒体具有专一性的染色，是毒性最小的碱性染料。JanusgreenB染色是由于线粒体中的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态，呈蓝绿色，而周围的细胞质被还原成无色的色基。1、分离叶绿体的实验原理是什么？2、两次离心第一次去掉沉淀，第二次去掉上清液，分别去掉的是什么物质？4、线粒体为何在细胞核周围分布较多？5、叶绿体分离与观察实验中，操作过程中应注意哪些问题？6、立刻用詹纳斯绿B染色和放置2h后再染色，两者染色是否有差异，为什么？7、染色完成后，如何区别少量沉积于标本上的染料和线粒体，若何避免此类麻烦？詹纳斯绿活体染色线粒体后，水洗一定充分，以除去非特异性染料的附着，另一方面不能让水直接对着样品冲洗，防止样品丢失。8、制备植物线粒体时应注意什么？备植物线粒体随组织破碎，伴随线粒体易膨胀，及内源脂肪酸，酚类物物质可抵制线粒体正常活力，所以制备时注意使用甘露醇，蔗糖维持一定渗透压力，加合剂和化合物可降低和去除酚类毒害作用，牛血清白蛋白（BSA）可以抵抗，降低脂肪酸或其它脂类毒害作用。实验三细胞膜的通透性细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。渗透压相等的两种溶液称为等渗溶液。渗透压不同的两种溶液，把渗透压相对高的溶液叫做高渗溶液，把渗透压相对低的溶液叫做低渗溶液。对同一类型的溶质来说，浓溶液的渗透压比较大，稀溶液的渗透压比较小。因此，在发生渗透作用时，水会从低渗溶液（即稀溶液）进入高渗溶液（即浓溶液），直至两溶液的渗透压达到平衡为止。给伤病员进行大量补液时，常用与血浆等渗的0.154mol/LNaCl溶液（生理盐水），而不能用0.256mol/LNaCl的高渗溶液或0.068mol/LNaCl的低渗溶液。影响细胞膜的通透性的主要因素是跨膜转运物质自身的理化性质，脂溶性大、分子量小、不带电荷或非极性的分子比脂溶性小、分子量大、带有电荷或极性的分子更容易穿膜。一般认为，在简单扩散的跨膜转运中，涉及物质溶解在膜脂中，再从膜脂的一侧扩散到另一侧，最后进入细胞质水相中。所以，其通透性主要取决于分子大小和分子极性。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。由于细胞对各种溶质的渗透性不同，有的溶质可渗入，有的溶质不可以渗入，渗入的红细胞溶质可提高红细胞的渗透压，促使水分进入细胞，引起溶血。由于溶质分子的大小、极性不同，溶质渗入速度不同，因此溶血时间也不同。分子的极性、大小对物质透过细胞的速度有影响。当溶质不能自由透过细胞膜时，溶液的渗透压成为影响水分进出细胞的因素。当溶液渗透压小于细胞渗透压时，则水分进入细胞，使细胞膨胀甚至溶血；反之，细胞失水。五、思考题1、血红细胞的渗透性实验中，是否存在物质跨膜的主动运输现象为什么2、常用的抗凝剂的种类和作用机理是什么？3、细胞膜的通透性观察实验中溶血的原因是什么？NaCl溶液和葡萄糖溶液为什么不能产生溶血蒸馏水：水分子可以自由通过细胞膜，低渗溶液中的水分子迅速进入细胞内，使细胞破裂。乙醇、甘油：可以自由进入细胞，使细胞破裂。乙醇进入的速度慢于甘油。4、已知四种等渗盐溶液分别为0.17mol/L醋酸铵、0.17mol/L硝酸钠、0.17mol/L氯化铵、0.12mol/L草酸铵，试剂瓶上的标签被盖住了。如果用它们进行血红细胞的渗透性实验，你能否根据该实验结果确切判断出每一瓶中所装的是哪一种试剂为什么5、推断下列溶液的溶血反应会如何。0.17mol/L氯化钾、0.17mol／L硝酸钾0.12mol／L氯化镁、0.12mol／L氯化钙、0.10mol／L硫酸钾、0.10mol／L醋酸钾、0.10mol/L柠檬酸钠、0.32mol／L，甘露醇、0.32mol/L蔗糖。6、影响细胞膜通透性的因素有哪些？7、不同等渗溶液中红细胞溶血时间明显差异的原因是什么？实验四DNA显示（Feulgen反应）与细胞有丝分裂相的观察实验原理：DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。DNA经1mol/L盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合即形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。1、简述Feulgen反应的原理及作好本实验的关键？答：（1）DNA经酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。该反应对DNA具有专一性。（2）Feulgen反应成功的关键在于Schiff试剂的质量。Schiff试剂只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。2、用Schiff试剂对DNA进行染色与染料吸附的方法相比有什么优势？3、为什么Feulgen染色法不对RNA染色？4、要得到一张好的Feulgen反应制片，制作过程应注意什么问题：①水解时间一定要合适，不宜过长；②Schiff试剂的质量要好，要注意试剂颜色是否正常，有无二氧化硫气味；③亚硫酸水最好临时配制，以便能保持较大的二氧化硫浓度；④染色结束应充分的漂洗，否则残留在组织中的Schiff试剂，一旦转入蒸馏水中立刻还原变红。5、细胞中的多糖、寡糖也会产生醛基，会不会对实验产生影响，叶绿体和线粒体中的DNA会不会被染色？6、染色后用亚硫酸水溶液漂洗的目的是什么？实验五植物细胞骨架的光学显微镜观察细胞骨架（cytoskeleton）是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达的起到重要作用。细胞骨架在通常固定条件下不稳定，如低温、高压、酸处理等。当采用适当的手段，如M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛在室温下固定能较好的保存细胞骨架的成分，另外，TritonX-100处理能抽取掉一部分杂蛋白，可使骨架成分显现的更加清晰。目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。微丝是球形肌动蛋白单体构成的纤维结构，单根微丝直径7nm，在光学显微镜下看不到该细胞骨架的结构，本实验观察的是植物细胞中由微丝平行排列形成的微丝束。常用的观察微丝的方法主要是考马斯亮蓝R-250染色法。当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构，这就是细胞骨架。、思考题1.细胞骨架主要有哪几类主要成分是什么2.为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？3、戊二醛、考马斯亮兰R250、TritonX-100是什么在本实验中各起什么作用PBS（磷酸缓冲液）作用：PH保证、与细胞渗透压相近。戊二醛作用：固定蛋白，保证细胞形状。考马斯亮蓝R250作用:与蛋白特异性结合。TritonX-100（聚乙二醇辛基苯醚）：把骨架蛋白以外细胞膜细胞质蛋白剥离掉。4、为什么用TritonX-100不用SDS：因为TritonX-100为非离子去污剂，把骨架蛋白以外细胞膜细胞质蛋白剥离掉，无离子性。SDS有离子性，去污性强容易破坏细胞膜。5、什么是细胞骨架它有何主要功能6、列举你所知道的动、植物细胞中由微丝组成的结构。7、细胞松弛素对细胞中装配好的微丝及正在装配的微丝有什么不同作用？8、M-缓冲液和戊二醛的作用：9、.微丝观察实验中，1%TritonX-100处理细胞的作用是什么此实验能否看到微管和中间纤维作出理由。答：（1）1%TritonX-100作用是为了抽提细胞骨架以外的蛋白质，从而使骨架图像更加清晰。（2）不能看到微管和中间纤维。因为微管、微丝和中间纤维是由不同的的蛋白质组成的，微管、中间纤维的组装蛋白都被1%的TritonX-100抽提出去，且没有加入促进微管、中间纤维组装的试剂，所以看不到它们。1.镜检标本时，为什么要先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察为什么使用油镜时，为什么必须用香柏油答：因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。而高倍镜和油镜的视野范围小，用高倍镜或油镜直接观察，则难以找到目标。因香柏油的折射率与玻璃相同，当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发上折射。2.简述线粒体詹纳斯绿B活体染色原理？答：线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。1．对显微镜来说，最重要的功能参数是它的（）；显微镜物镜镜头上多刻有一些数字，如：40/0.65，其中40代表（），0.65代表（）1．分辨率；放大倍数，镜口率（数值孔径）。3．分离细胞器的常用方法是组织匀浆后进行（）离心和（）离心；植物细胞匀浆后离心时，最先沉淀的是（），其次是（）。3．差速、密度梯度；细胞核，叶绿体。5．鸡血红细胞保存溶液中的抗凝剂是（）。5．柠檬酸钠。7．常用于分离和研究膜蛋白的离子型去垢剂是（）；你在实验中曾用过的非离子型去垢剂是（）；7．SDS；TritonX-100；7．考马斯亮兰R250是一种特异性显示细胞内微管的染料。（错）11．你在实验中用过的固定液有：（）；（）等11．戊二醛；甲醇：冰醋酸（3：1）。5．怎样根据细胞膜渗透性实验结果分析确定物质进入细胞的速度物质进入细胞的快慢有什么规律（10分）5．⑴测量溶血时间（2分）；⑵主要取决于分子的大小和极性（4分）；小分子比大分子容易穿膜，非极性分子比极性分子易穿膜，而带电荷的离子跨膜运动则通常需要转运蛋白的协助（4分细胞化学：孚尔根（Feulgen）DNA染色法理解运用实验原理。固定液有什么作用？热盐酸处理的作用？Schiff试剂的有效成分是什么？漂洗液的有效成分是什么，有什么作用？显示DNA时，根材料的哪部分最好？显微镜下怎样分辨细胞的间、前、中、后、末五个时期？一个良好的压片至少具备哪些特征（列举3个）实验成功的关键是什么？细胞生理：细胞膜的通透性理解运用实验原理。能够从实验数据推理，得出结论。（例：从下表中数据和描述，你能得出什么结论）细胞分离技术：叶绿体的分离及荧光观察掌握细胞分离的一般原理。取样原则保护方法细胞裂解方法及选择差速离心。实验结果异常分析，叶绿体破裂原因分析。细胞的形态结构：液泡系和线粒体的活体染色理解运用詹纳斯线粒体绿体原理？中性红染液泡原理？Ringer液的作用?实验失败原因分析