【doc】巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

【doc】巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 微生物学杂志2004年3月第24卷第2期JOURNALOFMICROBIOLOGYMar.2004Vo1.24No.2 ? 综述? 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 王黎明,王琦,梅汝鸿 (中国农业大学农学与生物技术学院,北京100094) 摘要巴斯德毕赤酵母外泺基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真棱表达系统,与传统的大肠杆菌和 酿酒酵母表达体系相比,其具有的诸多优势使之研究价值及应用价值不断体现.综述了其在生物学特性,表 达栽体,基因整合,外源蛋白的分泌,诱导表达及发酵等方面的基础研究及新近研究进展. 关键词巴斯德毕赤酵母;基因表达系统;外源蛋白 中图分类号Q78文献标识码A文章编号1005—7021(2004)02—0042—04 分子生物技术的发展为外源基因在各种细胞 中的表达提供了广阔的前景.甲醇酵母表达系统 是近十几年发展起来的真核表达体系.巴斯德毕 赤酵母作为甲醇酵母的一种,迄今为止,已有400 多种外源蛋白在此体系中成功表达J.与传统的 大肠杆菌表达系统及第一代酵母表达系统一酿酒 酵母相比,甲醇酵母具有不可比拟的优势.作为 单细胞真核生物,它既具备了原核生物生长快速, 培养基廉价和实验手段简单可行的特点,又具备 典型的真核生物分子生物学特性,可对表达的蛋 白进行加工折叠和翻译后修饰等.此外,它还克 服了原核表达系统的一系列缺陷,如:缺乏真核生 物的蛋白翻译后修饰和加工,表达产物多以包涵 体形式存在,复性困难且效率很低(<2O%),背 景杂蛋白多,不易于纯化等;其次,较酿酒酵母而 言.其具有更强有力的启动子,分泌效率有所提 高,表达质粒更稳定等特性,可以通过高密度发酵 (细胞干重可达120g/L以上)获得大量产物,且 分泌产物无过度糖基化,临床应用较安全. 1生物学特点 巴斯德毕赤酵母是一种可以在以甲醇为唯一 碳源和能源的培养基中生长的酵母菌,它们细胞 的过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径的必需酶. 如醇氧化酶,二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等,其 中醇氧化酶(AOX)是甲醇利用途径中的第一个 酶,它催化甲醇被氧化成甲醛和过氧化氢.有 AOX1和AOX2两个基因编码AOX.AOX1基因 严格受甲醇诱导和调控;AOX2基因与AOX1基 因序列相似,有92%的同源性,其编码蛋白有 97%的同源性.AOX1基因的编码产物在氧化过 程中起主要作用.在甲醇培养的细胞中,该酶可 占总蛋白的3O%以上,而在以葡萄糖,甘油,乙醇 为碳源生长时,则不能检测到AOX的活性.毕赤 酵母表达系统使用的醇氧化酶基因(AOX1)启动 子为强诱导型启动子,可有效地调控外源基因的 高效表达;采用整合型载体,可将外源基因整合到 酵母染色体上,从而获得遗传稳定的菌株;其表达 量高,有许多蛋白的表达水平可达每升数克以上, 如破伤风毒素C片段表达量高达12g/LJ,明胶 表达量达到14.8g/L[3l.Wateram在Pichia pastoris中克隆到3一磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)基 因的启动子,由于该组成型启动子不需要甲醇诱 导,且在葡萄糖培养基组成型表达的活力与 AOX1启动子不相上下,所以在食品工业应用前 景广阔.其局限性是不能控制外源基因的表达, 仅适用于表达产物对菌体不产毒副作用的外源基 因J.Pichiapastoris的FLD1基因编码谷胱甘 肽依赖型的甲醛脱氢酶,其启动子受甲醇或含有 甲胺(无毒)的葡萄糖所诱导.表达水平与受 AOX1启动子调控下表达水平相当J. 2表达载体 由于巴斯德毕赤酵母没有稳定的附加质粒, 所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达载 体.典型的表达载体含有乙醇氧化酶基因5 AOX1启动子和3AOX1终止子,其中含有供外 源基因插入的多克隆位点,以组氨醇脱氢酶基因 HIS4作为互补筛选标志或ZeocinR作为筛选标 志.它还含有pBR322质粒的部分序列和氨苄青 收稿日期:2003—05—08 作者简介:王黎明女,在读硕士研究生.现研究方向为植物微生态学及 植物病害生物防治学. *通讯作者 2期王黎明等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展43 载体类型载体系列分泌类型选择标记筛选药物特征 诱导型pPICZ 胞内 胞内 胞外 胞内 胞外 HIS4.Kan pPlC9k胞外 pHIL—I32胞内 pHILHIS4 pHIL-S1胞外 pGAPZ胞内 组成型pGAPZ pGAVZ~胞外 pAOSI5 ble HIS4 ZeocinMCS;融和外源蛋白形成His6和mye表原标记 BlasticidinMCS;融和外源蛋白形成His6和myc表原标记 NotI位点插入AOX1基因 AOXlp融合PHO分泌信号肽 Zeocin融和外源蛋白形成His6和myc表原标记 G418体外人工构建多拷贝载体 3基因整合 由于甲醇酵母表达载体不含有酵母复制原 点,所以只有通过同源重组整合到宿主细胞染色 体中,外源基因才能够稳定存在.重组时用DNA 内切酶将载体线性化,使之整合到酵母基因组内 的AOX1基因位置或HiM位点.整合后的外源 基因随酵母的生长可稳定地传代存在.通常有以 下2种整合方式:一种情况是单交换,即插入,外 源基因通过重组插入到酵母染色体上,AOX1基 因仍然保留,这样得到的转化子表型为Mut+; 另一种情况是双交换,即替换,外源基因通过重组 替换了染色体上的AOX1基因,造成AOX1基因 的缺失,这样得到的转化子表型为Muts,同源重 组有时会产生多拷贝的整合,一般占转化子的 1%,10%.但无论是采用单交换还是双交换, 得到的His转化子其中一部分是假阳性,这是因 为当载体的HIS4位点和宿主基因组his4位点发 生同源重组时,不带有任何其他载体的野生型 HIS4基因也可以同样发生重组,此种概率约占 His转化菌落的10%,50%,采用电激转化法 时发生频率最高J.所以只通过在不含组氨酸 的培养基筛选是远远不够的,有必要运用PCR方 法对少量转化子进行复筛.对于大量筛选,则可 采用原位点杂交 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 .此方法的优点是在筛选大 量转化子的同时,可以根据杂交信号的强弱来鉴 定多拷贝转化子(转化子中外源基因的拷贝数越 多,则杂交信号越强). 4外源蛋白的分泌 毕赤酵母的表达产物既可以胞内表达.又可 以外泌到培养基中.由于毕赤酵母自身只是低水 平地分泌少量内生蛋白,而且培养基也没有外加 的蛋白.所以分泌型外源蛋白占培养基蛋白总量 的大部分.这就为后续的纯化工作带来便利.蛋 白的分泌需要在其结构上存在一段信号肽,这样 才能引导其通向正确的分泌通道.尽管已经成功 地运用了几种不同的分泌信号肽序列,包括天然 信号肽序列,但是其成功率还不稳定.从酿酒酵 母中分离的a一因子信号肽是运用最成功的一种. 最近在毕赤酵母中成功运用的信号肽包括以下几 种:?128ku的pGKL放毒蛋白分泌信号肽”; ?Pichiacaciae放毒毒素的前导序列;?来源 于Phaseolusvulgaris的植物凝集素信号序列 (pHA—E)J.以上的信号肽均可以有效指导蛋白 分泌,或者在传统的酿酒酵母a信号肽因子不能 起到理想效果时,这些新的信号肽可以发挥其作 用.但是现在还不能预测究竟那一种信号肽在毕 赤酵母中是最有效的.对于特定的蛋白,需要经 过反复的实验来确定最适合其分泌表达的信号 肽.然而,分泌与否往往受到外源蛋白自身的限 制,它们在自己的天然宿主中分泌,但是在异源宿 {i 呻踏印 44微生物学杂志24卷 主中往往不能分泌或不能有效分泌.即使使用同 样的宿主菌株,表达载体和表达策略,不同的分泌 蛋白的表达水平也从1mg/L到10g/L而不 同[. 5外源基因的诱导表达及发酵 毕赤酵母发酵生产外源蛋白的过程一般包括 3个阶段.?茵体生长阶段: 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 菌株在添加甘 油等碳源的简单培养基中分批培养以积累生物 量;?分批流加的过渡阶段:此阶段中,向培养基 中流加甘油作为生长抑制因子来进一步积累生物 量,为诱导表达作准备;?诱导阶段:向培养基中 缓慢添加甲醇,使酵母在适应甲醇浓度变化的过 程中启动外源蛋白的合成.甲醇的添加速率在预 计的生长速率达到之前都要依据发酵周期作出适 当的调整.一般甲醇的添加量为0.5%,1%. 甘油作为碳源和生长抑制因子在积累茵体生物量 阶段发挥了重要作用,但是过量的甘油又是甲醇 代谢途径及AOX启动子的强烈抑制因素,会导 致表达量的降低.Hellwig等在甲醇浓度保持在 0.48%,0.53%之间的前提下,在分批发酵过 程中改变甘油的添加速率,结果显示,即使是相对 较低的甘油添加速率也会抑制外源单链抗体的合 成...更进一步地讲,甘油的新陈代谢能够引发 乙醇和乙酸盐的积累而抑制AOX启动子,最后 导致外源蛋白表达量的减少或表达的延迟【1. 因此,在混合培养诱导的过程中,应该严格控制甘 油的添加量,以确保外源蛋白的高产量. 毕赤酵母表达体系的显着特点就是表达菌株 很容易从摇瓶水平按比例放大到高细胞密度的发 酵罐培养基中.而且现在发展了一种SCM摇瓶 技术(shakenceramicmembraneflask),这种摇瓶 技术培养条件比普通摇瓶发酵更接近于发酵罐高 密度发酵,可以使外源蛋白的表达比普通摇瓶发 酵提高2.6,10倍,因而对重组转化子的筛选更 为有效【12J.由于表达菌株的高细胞密度发酵技 术的最优化水平已取得一定成就,所以多种补料 分批培养和连续培养的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 都是可行的.甲醇酵 母表达菌株的高密度发酵的特性对分泌型蛋白尤 其有利,因为它们在培养基中富集的程度是随着 细胞密度的增加而增加的.不过其他的胞内物质 如蛋白酶也是如此,这是不利的方面.3种方法 可以有效地降低外泌蛋白的水解作用.首先,可 以添加富含氨基酸的添加物,如蛋白胨或酪蛋白 水解物,这样可以提供过量的物质以备蛋白酶水 解,从而减少目标产物的降解H3l.其次就是改变 培养基的pH值.毕赤酵母在pH3.0,7.0的条 件下均可生长,所以可以在此pH范围内适当调 节发酵液的pH值,降低蛋白酶对目标蛋白的影 响【13l.还有可以使用蛋白酶缺陷的菌株…1,如 SMD1168,S1165和SMD1163等作为蛋白表 达宿主.另外,也有一些对传统发酵过程进行调 整的报道.potter等在肉毒杆菌神经毒素重链C 片断的实验中发现:将原始的10,12h的诱导期 缩短到9h,可以提高重组蛋白的产量【1.在可 溶性重组青鱼防冻蛋白实验中将原始的30?培 养温度降低至23?,可以提高蛋白产量并且减 少了错误折叠的蛋白聚合体的数量【15J. 6应用前景及局限性 巴斯德毕赤酵母表达系统的诸多优势使之越 来越受到关注,其研究和商业价值亦不断体现. 在载体构建和新型菌株的开发方面,已经取得卓 有成效的研究成果,例如Invitrogen公司不断开 发的新产品使此表达体系的前期研究愈加完善, 其开发出的快速筛选表达试剂盒(包括质粒 pPICZ和pPICZa及其它必需材料),多拷贝表达 试剂盒(包括质粒pPIC3.5k,pPIC9k及pAO815 及其它必需材料)以及经典表达试剂盒(包括质粒 pPIC9,pPIC3.5,pHIL—D2及pHIL.S1及其它必 需材料)大大方便了科研工作者的实验工作.而 对后期发酵过程和培养基配方等尚有待于进一步 开展开创性的探索研究,突破传统培养发酵模式, 优化培养基配方,为提高外源蛋白的表达量作出 有益的探索.但是作为一种新的表达系统,毕赤 酵母也存在一些不足之处,如发酵周期较长,易污 染,且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达;利用 易燃的甲醇做原料,表达产物的卫生安全性需要 考虑;筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限; 低表达或不表达的例子也在增多.由此可见,还 需要对此表达系统做更深入的研究,相信随着甲 醇酵母表达机制的进一步阐明,在不久的将来它 必将在分子生物学以及工业应用的各个领域发挥 更大的作用. 2期王黎明等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展45 参考文献 Cereghino,JL.andcregg,J.M.Heterologousproteinex- pressioninthemethylotrophicyeastPichiap?幻…[J]. 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(上接20页) StudiesontheCharacteristicsofFeedXylanasebytheBreedingofthe StrainofTrichodermakoningiiTN-27withhigh-yieldingenzyme FEIDibo,FENGGuanquan,YUANChao (InstituteofPlantProtectionandMicrobiology,ZhejiangAcademyofAgnd~a1.Sciences,Hangzhou,310021) AbstractAmutantwithhighyiddingxylanasefromTrichodermakoningiiwasobtainedthroughtreatmentofNTGand 7-rayofCo.Undertheoptimizedsolid?statefermentation,Theenzymeactivityis3716U/g.Itcouldbeapp~edasidealfeed enzymebyme~lsofthedeterminationofsomecharacteristicsandassayofvariousenzymeproducedbythestrain.Theresults showedthattheKmwas4.76g/L.theoptimaltemperaturewas50? andplq_5.2respectively. Keywordsxylanase,Trichodermakoningii,mutationbreeding,feedenzyme. ……