自制免疫增强比浊试剂检测血浆 d- 二聚体的方法学评价

自制免疫增强比浊试剂检测血浆 d- 二聚体的方法学 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 自制免疫增强比浊试剂检测血浆 D- 二聚体的方法学评价 123贺慧娟 唐非 鲁翊 1,2,3 ,华中科技大学同济医学院公共卫生学院环境与健康教育部重点实验室 武汉 430032, 摘要:本文用乳胶增强免疫比浊法对自制试剂检测D-二聚体进行方法学评价～采用的方法为系统研究了自制试剂～运用免疫增强比浊法检测D- 二聚体水平的稀释线形、精密度、校准曲线的稳定性～得到的结果即乳胶增强免疫比浊法检测D-二聚体水平的精密度为1.62%-3.69%～稀释标本的线性良好～回收率范围为95%-102.5%～b值=0.9977,r=0.9998,验证的参考区间为0.006-0.546mg/l.与临床血浆样品的检测结果相一致。初步确定该方法检测血浆D-二聚体具有良好的分析性能～其敏感度～精密度～线性范围和与临床诊断结果的一致性等均符合质量目标要求～推荐的参考区间也适用～可以满足临床检测要求。 关键词: D-二聚体 免疫比浊法 评价 乳胶增强免疫比浊法是利用聚苯乙烯微球偶联抗体，以检测血浆中的待测抗原，该方法可以扩大免疫反应信号，具有较高的检测的灵敏度与精密度。D-二聚体是交联的纤维蛋白在纤溶酶作用下产生的一种特异性降解产物，在正常人体血浆中含量很低，但是当机体发生继发性纤溶亢进或者处于高凝状态时，其含量则成倍增加。因此，检测机体血浆中D-二聚体的水平，可以作为鉴别原发性纤溶和继发性纤溶可靠指标，并可作为判断机体高凝状态以及溶栓治疗效果的观察指标。D-二聚体水平 的检测方法有多种, 乳胶凝集法、酶联免疫吸附法 (ELISA). 但是ELISA检测时间长，人为操作复杂，无法达到临床上快速检测血浆中D-dimer的要求，且在应用中很难实行自动化，所以在临床中的应用受[1]限。而本方法是快速自动定量测量血浆中D-dimer的新方法，与乳胶凝集法相比，乳胶增强免疫比浊法通常由自动化仪器完成检测，具有更 [2]高的检测灵敏度与精密度，避免了人工加样的偶然误差;与ELISA法 [3]相比具有快速、敏感性高的优点。本研究改进了血浆中D-dimer乳胶增强免疫比浊法，配制了优化条件后的乳胶试剂，为评价改进后的乳胶试剂的性能，以D-dimer 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品以及临床血浆为对象，对该乳胶试剂的敏感性、精密度、稀释线性和样品检测结果与临床结果的一致性进行鉴定。 1 材料与方法 1.1 检测对象 所有标本均为门诊和住院患者。健康者为进行体格检查的正常志愿者。 1.2 检测仪器和试剂 CA7000血凝仪由日本 Sysmex 公司生产, D- 二聚体试剂盒由 公司自制, 校准品以及配套复溶缓冲液由 DadeBehring 公司提供。 1.3 实验方法 1.3.1 原理 聚苯乙烯颗粒共价结合 D- 二聚体的单克隆抗体(DD5) 与标本的 D- 二聚体结合且引起浊度改变, 在 575nm 下测定其吸光度值, 并通 过标准曲线计算出 D- 二聚体含量.该抗体主要针对 D- 二聚体交链区, 因此与纤维蛋白及降解产物的交叉反应率相对较低。 1.3.2 标本采集和血浆留取 取静脉血 2ml并 加入含有 0.11mol/L 枸橼酸钠(1/10 体积) 作为抗凝剂的试管中(BD 公司). 将标本离心 3000r/min, 15 分钟取出血清 500μl, - 70?储存待测。 1.3.3 统计学处理 所有数据均用 Microsoft Excel97 和 SPSS10.0 for Window软件进行统计处理。 2 结果 2.1 稀释线性 将D-dimer标准品从原浓度进行一系列倍比稀释，测定结果见表1，线性曲线见图1，将其测定值和预测值比较.r值为0.9998，相关性良好，该四份标本都有较好的稀释线性。 表1乳胶增强免疫比浊法检测D-二聚体水平的稀释线性和回收率 标本 稀释倍数 测定值 预期值 回收率 mg/L mg/L mg/L % 3.20 1:2 1.62 1.60 101.2 1:4 0.76 0.80 95.0 1:8 0.41 0.40 102.5 1:16 0.20 0.20 100.0 3.54 1:2 1.77 1.77 100.0 1:4 0.89 0.885 100.5 1:8 0.44 0.443 99.3 1:16 0.22 0.222 99.1 3.044 1:2 1.522 1.522 100 1:4 0.760 0.761 99.8 1:8 0.381 0.381 100 1:16 0.190 0.191 99.4 5.21 1:2 2.60 2.605 99.8 1:4 1.30 1.303 99.7 1:8 0.65 0.652 99.7 1:16 0.33 0.326 101.2 3 y = 0.9977x + 0.00442.5 2 系列11.5线性 (系列1) 1 0.5 0 00.511.522.53 图1 不同稀释浓度D-二聚体实测值与理论值线性关系图 P>0.05 b=0.9977,r=0.9998，回收率范围为95%-102.5% 结果是线性，相关性良好。 2.2 参考区间 对90例健康体检者血浆D-二聚体检测结果: =0.276mg/l,s=0.135mg/l,比率R=95%，其95%区间为x (0.006-0.546)mg/l.和常见厂家生产的试剂盒参考范围(STA厂家的为<0.5mg/l)相比较，其参考范围比较接近。 2.3精密度 用配套高、低水平 2 个质控物, 每天测定 2 次(2 次测定时间不少于 2 小时), 每次均作双份测定, 共测定 10 天。结果见表 2。 表 2 乳胶增强免疫比浊法检测 D- 二聚体的精密度 质控物 均数mg/l 批内CV% 批间CV % 日间CV % 总CV% 1.89 1.62 2.22 2.67 3.06 高值 0.36 1.78 2.6 2.98 3.29 低值 2.4 临床血浆样品检测结果 为了评价EDAC偶联方法在最佳条件下配制的乳胶试剂在临床实际应用中检测的准确度，本研究从医院收集了130例血浆样品，其中包括临床上已经确诊的具有高凝状态的患者的血浆样品40例及临床上确诊为未发现具有高凝状态的对照血浆样品90例，用本研究配制的乳胶试剂对130例血浆样本进行检测并 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 其吸光度值，对照标准曲线得出血浆样品中D-dimer的浓度，并与临床上的诊断相比较，从结果可以得知，本研究所用的乳胶试剂对临床上确诊的40例有高凝状态的患者的血浆D-dimer检测结果为阳性(,0.5mg/L)，对90例临床上未发现高凝状态的对照血浆D-dimer检测结果为阴性，即检测结果与临床上的阳性诊断 结果一致。 3 讨论 现阶段，越来越多的D-dimer检测的应用研究，已证实其在冠心病、弥散性血管内凝血(DlC)、急性心肌梗死、脑梗死、主动脉夹层，肝脏疾病、恶性肿瘤以及溶栓治疗监测及评价等领域的重要价值。 过去一直认为肺栓塞病较少见, 其临床症状不明显, 与冠心病、心绞痛、肺炎、支气管炎和胸膜炎症状相似, 容易造成误诊和漏诊。而众多临床研究表明[4,5] : D- 二聚体水平检测作为肺栓塞的第一步筛选诊断试验已得到公认, 而且 D- 二聚体还是DIC 与恶性肿瘤患者凝血功能的可靠监测指标, 又是复发性急性冠脉综合症的优良预测因子。因此,快速、定量、稳定检测 D- 二聚体水平, 是具有重要的临床意义的。 以往国内外实验室多用乳胶凝集法和酶联免疫吸附法检测患者 D- 二聚体水平, 这两种方法虽然具有快速、经济和适合个体检测的优点, 但敏感度低、半定量和操作时间长是主要缺点。乳胶增强免疫比浊法是检测血浆中D-dimer的新方法，具有准确、快速、自动的优点，与胶乳凝集法相比，由于该方法是由自动化仪器完成，所以检测的灵敏度与精密度较高，可以避免人工加样的偶然误差。 本次研究，两个水平的定值质控血浆批内和批间精密度验证结果的CV分别为1.62,1.78和2.22,2.6，说明该仪器具有良好的重复性和稳定性。其线性实测值和理论值在0.22-5.21mg/l的范围内有良好的线性关系，且在实际工作中，当遇到高于检测范围的样本时，仪器可以自动增加样本稀释倍数，获得更宽的检测范围，满足临床需要。本研究收集 了临床确诊为高凝状态的40例患者的血浆以及90例临床上未发现高凝 状态的对照血浆，用EDAC偶联方法最佳条件下配制的乳胶试剂进行检 测，通过与标准曲线对比，可以读出血浆样品中的D-dimer的浓度水平， 发现临床上确诊的具有高凝状态的40例患者血浆中D-dimer的检测结 果均为阳性(,0.5mg/L)，而90例对照血浆样品检测结果为阴性，与 临床上诊断一致，可见本研究研发的乳胶试剂检测的正确率较高，可满 足在实际临床上的应用。 对90例健康体检者血浆D-二聚体检测结果: 其95%区间为 (0.006-0.546)mg/l,与其他测量方法得到的参考区间差别不大. 通过对EDAC偶联方法在最佳条件下配制的乳胶试剂测性能评价， 初步确定该方法检测血浆D-二聚体具有良好的分析性能，其敏感度，精 密度，线性范围和与临床诊断结果的一致性等均符合质量目标要求，推 荐的参考区间也适用，可以满足临床检测要求。 参考文献 [1] Adam S S, Key N S, Greenberg C S. D-dimer antigen: current concepts and future prospects[J]. Blood, 2009,113(13):2878-2887. [2] 夏汛生, 唐宁, 张碧玉, 等. D二聚体两种定量检测方法的评价 [J]. 血栓与止血学, 2007(2):82-85. [3]李丹丹, 马聪. D二聚体检测的临床应用进展[J]. 血栓与止血学, 2011,17(3):138-141, 144. [4] Gouin- Thibault I, Samama MM. Laboratory diagnosis of the throm-bophilic state in cancer patients [J]. Semin Thromb Hemost, 1999,25(2):167,72. [5] Moss AJ, Goldstein RE, Marder VJ, et al. Thrombogenic factors and recurrent coronaryevents [J]. Circulation, 1999,99:2517,2522.