革兰氏染色法
幽灵
革兰氏染色
一、目的和要求
1(了解革兰氏染色法原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
2(掌握革兰氏染色的基本步骤。
二、原理
G+、G-细菌的细胞壁成分和结构不同。G+的CW主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，CW通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在CW内而不易脱色，因此呈蓝紫色。G-的CW中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，CW的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
三、 菌种:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌
染液:革兰氏染液
四、操作
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具体步骤
制片——固定——初染(结晶紫染液)1-2min——水洗——媒染(碘液)1min——水洗——脱色(95%乙醇至无色——水洗——复染(番红或复红染液)1-2min——水洗——干燥——镜检
革兰氏染色的关键环节
涂片不宜过厚，以免脱色不完全，造成假阳性。
乙醇脱色时间
菌龄:应选择活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色。培养时间过长，或死亡及部分自溶，改变了细菌CW的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。
火焰固定不宜过热
媒染剂的作用
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或吸附力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使之不易脱落。
五、实验报告
简述各菌株的染色结果，并分别绘图示其形态特征。
六、预习
细菌的芽孢染色法
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立 细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌(G+)，后者为革兰氏阴性菌(G—)。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应;弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。 [原理]:革兰氏染色目前有三种观点:等电点学说、化学学说和渗透学说。 1( 等电点学说，革兰氏阳性菌的等电点在PH2-3，比阴性菌(PH4-5)低，加之碘为弱氧
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化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，致使两类菌的等电点差异扩大，因此阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。
2(化学学说，碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合，此结合物不易被丙酮酒精脱掉，呈革兰氏染色阳性。因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被丙酮酒精脱色而呈革兰氏染色阴性。 3(渗透学说，乙醇使阳性菌所含粘肽多糖脱水而致细胞壁间隙缩小，通透性降低，在菌体内保留了染料-碘复合物，呈紫色。阴性菌含粘肽少，细胞壁变化不大，通透性不受影响，菌体内的染料-碘复合物较易透出，失去紫色，被复染成为红色。
[试剂]:Crystal violet(结晶紫)、Gram Iodine(碘液)、Decolourizer(丙酮酒精)、Safranin(稀释沙黄)
[操作]:
1(标本处理:(1).有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。 (2).无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本(最高可达5-7ml),经3000rpm 离心10min.，取沉渣涂片染色。
2(涂片制作:菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布;菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。
3( 染色方法:
(1).加上Crystal violet(结晶紫)后，染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。 (2).加上Gram Iodine(碘液)后染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。 (3).以Decolourizer(丙酮酒精)脱色约5-10秒，并用自来水冲洗之。 (4).加上Safranin(稀释沙黄)后，染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。 (5).吸干或在空气中凉干后，置油镜镜检。
4(结果观察:紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。
[报告方式]:革兰氏染色:检出革兰氏阳性球菌 ;革兰氏阴性球菌
检出革兰氏阳性杆菌 ;革兰氏阴性杆菌
[注意事项]:
1(标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
2(玻片通过火焰温度不能太高。
3(若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不在出现紫色为止。
[临床意义]:通过革兰氏染色，将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，便于临床治疗。 [附]
1 沙黄(番红)Safranine T [C20H19ClN4=350.85] 红棕色粉末;碱基性染料。在水中溶解，在乙醇中易溶。
2 碘液配制:0.01mol/l碘液——称取1.3g碘，置于50mol烧杯中，加入2.5g碘化钾及25毫升蒸馏水，不断搅拌之，使其溶解均匀。再加0.2mol浓盐酸(体积质量1.19g/cm3)，再加蒸馏水稀释到1000mol。溶液应贮藏在棕色试剂瓶中，储于低温暗橱内。有效期为一个月左右
革兰氏阴性菌，以[大肠杆菌]为代
表
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。大肠杆菌为兼气性菌种，一般生存於肠道中及厌氧的还境中。革兰氏阴性菌细胞壁的特徵为有一层out member 与阳性菌种不同。目前对大肠杆菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指标外，很多分子生物学方面的研究皆需要使用到大肠杆菌当作实验宿主。
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