PCR各步骤的目的PCR各步骤的目的
(一)预变性:
破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性,减少DNA 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的DNA模板,最好不要吝啬这个步骤。此外,在一些使用热启动Taq酶的反应中,还可激活taq酶,从而使PCR反应得以顺利进行。
(二)变性--退火--延伸循环:
①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板...
PCR各步骤的目的
(一)预变性:
破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性,减少DNA 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的DNA模板,最好不要吝啬这个步骤。此外,在一些使用热启动Taq酶的反应中,还可激活taq酶,从而使PCR反应得以顺利进行。
(二)变性--退火--延伸循环:
①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
(三)用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因:
1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。(当然是在反应体系一定的条件下)例如,使用t aqDNA聚合酶,72度时的碱基掺入率为35-100bp/s,因此延伸速率为1kb/min。
2.根据延伸速率推得,扩增1kb以内的dna片段1min即可,而3-4kb则需要3-4min,依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min,这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。
3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外,还有一个作用是:在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用,可以直接用于TA克隆的进行。
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