现代生化技术练习——第三章 -参考答案

《第三章 电泳技术》习题 1、什么是电渗现象？其对电泳过程有何影响 液体在电场中，由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。 如果电渗方向与电泳方向相同，则加快电泳速度；如果电渗方向与电泳方向相反，则降低电泳速度。 2、现有电泳技术按照原理及支持介质的不同，分为哪几类？ 按原理不同可分为：移动界面电泳、区带电泳、等电聚焦电泳和等速电泳 按支持介质形状不同可它为：薄层电泳、板电泳和柱电泳。 3、蛋白质在不连续PAGE中实现分离的基本原理是什么？ 不连续PAGE电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果比连续系统更好。 （1）样品浓缩效应：①凝胶孔径的不连续性：浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。②缓冲体系离子成分及pH值的不连续性： HCl在任何pH溶液中均易解离出(Cl-)，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。在电极缓冲液中，除有Tris 外，还有甘氨酸(glycine)，其pI=6.0，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2 CH2COO-)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加。③电位梯度的不连续性：电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。 （2）分子筛效应：大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。 （3）电荷效应：在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快； 反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。 4、SDS-PAGE测定蛋白分子量的原理是什么？ 由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而主要利用蛋白分子量的差异而将各种蛋白质分开，因此根据未知蛋白和标准系列蛋白的移动距离可测定出未知蛋白的分子量。 5、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA琼脂糖凝胶电泳中，凝胶浓度与被分离分子的大小有何关系？ 聚丙烯酰胺凝胶浓度越大，允许通过的蛋白分子越小；琼脂糖凝胶浓度越大，允许通过的DNA片段短。 6、某同学在进行SDS-PAGE时，发现电压很高而电流却很低，试分析其原因，并提出处理措施。 这种现象主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。 7、琼脂糖凝胶电泳缓冲液中一般需要加入适量的EDTA，其目的是什么？ 目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。 8、琼脂糖凝胶电泳的电泳缓冲液常用的有哪些？各有何特点？ TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也宜用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。  TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。 9、温度梯度凝胶电泳测定DNA点突变的原理是什么？ 一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。一个几百个碱基对的 DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当温度逐渐升高达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链 DNA 完全解链。不同的双链 DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行 DGGE/TGGE 时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦 DNA 片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链时，双链 DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的 DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，同样长度但序列不同的 DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。如果不同 DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，可在 DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段以防止 DNA 片段在胶中完全解链。当加了 GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。 10、什么是IEF-PAGE？ 以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier amphol ytes)，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移 至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric  focusing-PAGE,简释IEF-PAGE)。 11、试通过与高效液相色谱、普通电泳方法的比较，说明毛细管电泳的特点。 CE和高效液相色谱法(HPLC)相比, 其相同处在于都是高效分离技术, 仪器操作均可自动化, 且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间, CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快；对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl级, 流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。 CE和普通电泳相比, 由于其采用高电场, 因此分离速度要快得多；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。 12、综合题：请结合本课程与《生物化学》课程知识，对蛋白质分子量测定方法、含量测定方法、等电点测定方法、纯度鉴定方法作一小结。 （略）