复方浙贝颗粒联合阿霉素影响AML-KG-1a移植瘤细胞表面抗原表达研究

复方浙贝颗粒联合阿霉素影响AML-KG-1a移植瘤细胞表面抗原表达研究 复方浙贝颗粒联合阿霉素影响 AML-KG-1a 移植瘤细胞表面抗原表达研究 张宇1，陈信义1,2，侯丽1,3，许亚梅1，杨璐1，褚雨霆1，马薇1，张雅月1 5 (1. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700; 2. 中医内科学北京市重点实验室，北京 100700; 3. 中医内科学教育部重点实验室，北京 100700) 摘要:目的:探索复方浙贝颗粒联合阿霉素对人急性髓系白血病细胞 KG-1a 移植瘤组织细 胞表面标志物表达的影响。方法:将 KG-1a 细胞接种 BALB/c-nu 裸小鼠腋前皮下构建移植 10 瘤动物模型，给予复方浙贝颗粒灌胃联合阿霉素腹腔注射，实验结束后处死小鼠，剥离肿瘤， 将瘤块组织制成单个核细胞悬液，通过流式细胞术 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 复方浙贝颗粒联合阿霉素对 KG-1a 移植瘤组织特异性表面抗原 CD34+CD38-、CD34+CD38-CD123+、CD34+CD38-CD96+、 达 的 影 响 。 结 果 : ? 与 生 理 盐 水 组 比 较 ， CZBG 各 剂 量 组 的 CD34+CD38-CD33+ 表 CD34+CD38-表达比率均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿霉素组比较，CZBG 中、 15 高剂量组均有降低，具有统计学意义(P,0.05)。?与生理盐水组比较，CZBG 各剂量组 的 CD34+CD38-CD123+表达比率均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿霉素组比较， CZBG 高剂量组降低，具有统计学意义(P,0.05)。?与生理盐水组比较，CZBG 各剂量 组的 CD34+CD38-CD96+表达比率均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿霉素组比较， CZBG 中、高剂量组均有降低，具有统计学意义(P,0.05)。?与生理盐水组比较，CZBG 20 各剂量组的 CD34+CD38-CD33+表达比率均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿霉素 组比较，CZBG 高剂量组降低，具有统计学意义(P,0.05)。结论:CZBG 可以协同阿霉 素降低 CD34+CD38-、CD34+CD38-CD123+、CD34+CD38-CD96+、CD34+CD38-CD33+的 表达。 关键词:复方浙贝颗粒;阿霉素;KG-1a 细胞株;特异性表面抗原; 25 中图分类号:请查阅《中国图书馆分类法》 The Effect of Compound Zhe Bei Granule (CZBG) Combined With Doxorubicin on The Expression of Specific Surface Antigen in KG-1a Cell Line Tumor Xenografts in 30 Mice Zhang yu1, Chen Xinyi1,2, Hou Li1,3, Xu Yamei1, Yang Lu1, Chu Yuting1, Ma Wei1, Zhang Yayue1 (1. Dongzhimen Hospital Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700; 2. Key Labortary of Beijing of TCM Internal Medicine,Beijing 100700; 35 3. Key Labortary of Ministry of Eduaction of TCM Internal Medicine,Beijing 100700) Abstract: Objective: To investigate the effect of Compound Zhe Bei granule(CZBG) combined with doxorubicin(ADM) on the expression of specific surface antigen in KG-1a cell line tumor xenografts in mice(Methods: Subcutaneous tumor xenograft model is established by injecting the acute myeloid leukemia cell line KG-1a in the axillary flank of BALB/c-nu nude 40 mice(Drug-combination of CZBG intragastric administration and doxorubicin intraperitoneal injection (i.p.) is given to the BA LB/c-nu nude mice(The tumor xenografts are made into mononuclear cell suspension afte r the dissection, and the expression of specific surface antigen 基金项目:教育部高等学校博士点专项基金(20100013110008);北京市教委共建项目 作者简介:张宇 (1984-)男，2012 级博士研究生，研究方向:中西医结合防治白血病应用研究 通信联系人:陈信义(1954-)男，教授，博士生导师，研究方向:中西医结合血液肿瘤病防治. chenxinyi0729@126.com -1- CD34+CD38-,CD34+CD38-CD123+,CD34+CD38-CD96+ and CD34+CD38-CD33+ in KG-1a 45 cell line tumor xenografts are detected by flow cytometry . Results: ?Compared with saline group and ADM group, the expression of CD34+CD38-in two CZBG groups are both declined(P ,0.5).?Compared with saline group, the expression of CD34+CD38-CD123+ in two CZBG groups are decreased(P,0.05). High-dosage CZBG group is more obvious compared ADM group(P,0.05).?Compared with saline and ADM group ,the expression of CD34+CD38-CD96+ in two CZBG groups are both declined(P,0.05).?Compared with saline and ADM group ,the 50 expression of CD34+CD38-CD33+ in two CZBG groups are both declined(P,0.05). Conclusion: CZBG can collaborate with doxorubicin to reduce the expression of CD34+CD38-,CD34+CD38-CD123+,CD34+CD38-CD96+,CD34+CD38-CD33+. Key words: Compound Zhe Bei granule(CZBG);ADM;KG-1a cell line, specific surface antigen; 现在研究表明，白血病干细胞(leukemia stem cell，LSC)具有无限增殖和 55 自我更新能力，且通常处于静息状态而能够逃逸化疗药物的杀伤，且容易产生多 药耐药，最终导致白血病复发 [1]。因此， LSC 的存在是难治性急性白血病 (Refractory Acute Myeloid Leukemia，RAML)不能获效主要原因之一。为探索 辅助化疗能够提高 RAML 临床疗效的复方浙贝颗粒对 LSC 表面标志物的影响， 寻找能够针对于 LSC 靶向性治疗或辅助治疗药物，我们选取高表达 CD34+的人 60 急性白血病细胞系(KG-1a)为研究对象，通过建立移植瘤模型，并以复方浙 贝颗粒(CZBG)联合阿霉素(ADM)为干预药物，采用流式细胞术检测 LSC 特异性表面抗原 CD34、CD123、CD33、CD96 表达，拟从 LSC 水平探讨 CZBG 逆转白血病多药耐药效应机制。 1 材料 65 1.1 细胞系 人急性髓系白血病细胞 KG-1a 细胞，购于中国医学科学院血液病研究所， 细胞接种于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中，置 37?、5%CO2 和全湿 条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。 1.2 实验动物 70 动物清洁级 BALB/c-nu 雌性裸小鼠 32 只，20-22g，购于北京维通利华实验 动物技术有限公司，实验动物生产许可证号:SCXK(京)2012-001，SPF 级动物房 饲养。 1.3 实验用药 复方浙贝颗粒(Compound Zhe-Bei Granule，CZBG)复方由浙贝母、汉防己、 75 川芎组成，北京康仁堂药业有限公司制备并提供;注射用盐酸多柔比星 (doxorubicin 阿霉素,ADM)，深圳万乐药业有限公司，国药准字:H44024359。注 射用环磷酰胺(安道生)，德国 Baxter Oncolgy GmbH 公司，进口药品注册证号: H20110407。 1.4 主要试剂 80 RPMI1640 培养基和胎牛血清(FBS)，为美国 Gibco 公司产品。磷酸缓冲液 -2- (PBS)、Hank's 平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)、人淋巴细 胞分离液均购于中科迈晨(北京)科技有限公司， anti-mouse Fc 封闭性抗体、 鼠抗人 CD34- FITC 抗体、鼠抗人 CD123- PE 抗体、鼠抗人 CD33- PE-Cy5、鼠 85 IgG1K-Isotype-Control-FITC 、鼠 IgG1K-Isotype Control-PE、 鼠 IgG1 K -Isotype Control PE-Cy5 抗体购于美国 eBioscience 公司，0.1% I 型胶原酶、0.05%DNA 酶 购于美国 Worthington Biochemical Corporation 公司。 1.5 仪器设备 超净台由北京昌平长城空气净化设备工程公司生产;倒置相差显微镜:日本 OLYMPUS MIT-2;CO2 培养箱:日本 SANYO L-74-17;酶标仪:Clinicbio 128C。 90 流式细胞仪:美国 BD 公司，台式离心机:德国 Eppendorf 公司 2 方法 2.1 细胞培养 人急性髓细胞性白血病细胞系 KG-1a, 用内含 10%灭活胎牛血清的 RPMI1640 95 培养基培养, 细胞接种密度为 2×106个/mL，置于 37?,5% CO2 温箱中培养, 每 3 天换液一次。 2.2 动物模型建立 给予裸鼠环磷酰胺 2mg/只，腹腔注射，共 2 天，第 3 天收集对数生长期细 胞，1000rpm，离心 5min，无血清 RPMI1640 培养基稀释，制成细胞悬液，细胞 悬液密度 5×109 个/mL，于裸鼠右前腋侧常规消毒后，皮下注射 0.2mL，注射后 100 10-14d 可见到瘤块开始生长增大。 2.3 分组与给药 KG-1a 细胞接种后，30 只荷瘤鼠成瘤，测量肿瘤最大径(a)和最小径(b)，计 算肿瘤体积(V):V=ab2/2，将肿瘤体积过大及过小者排除，共有 24 只荷瘤鼠进入实 验，按随机数字表法分成 4 组，分别为生理盐水对照组，阿霉素对照组，CZBG 105 高剂量组，CZBG 中剂量组，每组各 6 只荷瘤鼠。细胞接种后第 14 天开始给药， 其中，生理盐水对照组以生理盐水 0.2mL/10g，灌胃，每日 1 次。阿霉素对照组 以阿霉素 1mg/kg(按成人 40mg/(m2? d)换算)，腹腔注射，隔日 1 次。CZBG 高剂 量组(8g/kg，临床用药剂量的 14 倍)，灌胃给药，每日 1 次;阿霉素 1mg/kg 腹腔 注射，隔日 1 次。CZBG 中剂量组(4g/kg，临床用药剂量的 7 倍)灌胃给药，每日 1 110 次;阿霉素 1mg/kg 腹腔注射，隔日 1 次。共 10d。 2.4 肿瘤组织单个核细胞制备 制备方法如下:?药物干预完成后，SPF 环境下，脱颈椎处死裸鼠，在无菌 条件下将切除新鲜瘤体组织去除坏死部分与结缔组织，用 RPMI1640 培养液冲洗 干净，移至无菌平皿内用手术剪将肿瘤组织剪碎至 1,2mm3 小块。 ?用 200 目 115 孔径的不锈钢滤网将悬液过滤，以除去肿瘤组织块。经 1500rpm 收集单个细胞， -3- 用 RPMI1640 培养液洗细胞 2 次。?使用含 0.1% I 型胶原酶和 0.05%DNA 酶的 HBSS 消化上述细胞，37?消化 1h。收集细胞，RPMI1640 培养基洗涤 2 遍。?梯度离 心分离肿瘤组织单个核细胞:于无菌离心管内分层放入 100,及 75,的淋巴细胞 120 分离液，其上再沿管壁轻轻加入细胞悬液，经 2000rpm 离心 20min，不带刹车， 收集 75,分离液界面上的细胞为富含单个核细胞的悬液，再用 RPMI1640 将单个 核细胞洗 2 次，以除去细胞分离液。?将洗过 2 次的单个核细胞应用于流式标记。 2.5 肿瘤组织细胞表面标志物检测 检测方法如下:?将前法制备好的细胞用含 5%血清的 PBS(染色液)洗涤 1-2 次，500g，5 min，离心。?每 100μl 染色液添加 1-2μl anti-mouse Fc 封闭性抗体。? 125 将上述单个核细胞用 100μl含有封闭性抗体的染色液混悬，4?孵育 30 min。?每 100μl 染色液添加 5μl 的 Anti-Human CD34 FITC、Anti-Human CD123 PE、Anti-Human CD33 PE-Cy5 抗体，室温孵育 30min?抗体的同型对照抗体作为阴性对照与同型对照，室 温暗处孵育 30min。?细胞染色液洗涤两次，500g，5min，离心。?500μl PBS 混悬， 过 200 目筛网，立即进行流式细胞检测。?以 CD34、CD38 设门，圈出门内 130 CD34+CD38-细胞，再对门内细胞分别进行 CD123、CD33、CD96 进行检测。所得的 百 分 比 数 值 分 别 乘 以 之 前 所 测 得 的 CD34+CD38- 细 胞 的 百 分 比 值 即 为 CD34+CD38-CD123+、CD34+CD38-CD96+、CD34+CD38-CD33+的百分比，表达?1% 为阳性。 2.6 数据统计 135 各组所得计量数据采用均数? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差( x , s )表示，用 SPSSl7.0 软件处理数 据，采用单因素的单向分类方差分析(one-way classification ANOVA)进行比较， 并用采用 LSD 法进行多组间两两比较。检验水准α =0.05，当 P,0.05 时，被认 为有统计学意义。 3 结果 140 因药物干预后大部分移植瘤体消失或体积过小，导致无法全部取材以制备单 个核细胞悬液，最终仅能以每组 3 只荷瘤小鼠，每只荷瘤小鼠制备 3 份单个核细胞 悬液。流式细胞术检测 CD34+CD38-、CD34+CD38-CD123+、CD34+CD38-CD96+、 CD34+CD38-CD33+表达阳性见表 1 与图 1-4。 145 表 1. 4 组 KG-1a 移植瘤组织细胞表面标志物表达比率( x , s ，%) 150 分组 CD34+CD38- CD34+CD38-CD123+ CD34+CD38-CD96+ CD34+CD38-CD33+ 生理盐水对照组 30.17?2.33 16.73?0.97 9.76?2.34 14.96?0.73 -4- 阿霉素对照组 20.13?0.90* 9.04?1.74* 5.75?0.97* 8.55?1.16* CZBG 中剂量组 13.20?0.82Δ 9.30?2.24* 2.62?0.43*Δ 4.89?0.70*Δ CZBG 高剂量组 5.81?0.19*Δ 4.50?0.93*Δ 1.11?0.76*Δ 0.70?0.31*Δ Δ *与生理盐水组比较，P,0.05; 与阿霉素组比较，P,0.05 从上表可以看出:?与生理盐水组比较，CZBG 各剂量组的 CD34+CD38-表 达比率均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿霉素组比较，CZBG 中、高剂 量组均有降低，具有统计学意义(P,0.05)。?与生理盐水组比较，CZBG 各剂 155 量组的 CD34+CD38-CD123+表达比率均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿 霉素组比较，CZBG 高剂量组降低，具有统计学意义(P,0.05)。?与生理盐水 组比较，CZBG 各剂量组的 CD34+CD38-CD96+表达比率均降低，具有统计学意义 (P,0.05)，与阿霉素组比较，CZBG 中、高剂量组均有降低，具有统计学意义 (P,0.05)。?与生理盐水组比较，CZBG 各剂量组的 CD34+CD38-CD33+表达比 率均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿霉素组比较，CZBG 高剂量组降低， 160 具有统计学意义(P,0.05)。 图 1. KG-1a 移植瘤组织 CD34+CD38-表达情况 A:生理盐水组;B:阿霉素组;C:低剂量 CZBG 组;D:高剂量 CZBG 组 -5- 165 图 2. KG-1a 移植瘤组织 CD34+CD38-CD123+表达情况 A:生理盐水组;B:阿霉素组;C:低剂量 CZBG 组;D:高剂量 CZBG 组 图 3. KG-1a 移植瘤组织 CD34+CD38-CD96+表达情况 170 A:生理盐水组;B:阿霉素组;C:低剂量 CZBG 组;D:高剂量 CZBG 组 图 3. KG-1a 移植瘤组织 CD34+CD38-CD33+表达情况 A:生理盐水组;B:阿霉素组;C:低剂量 CZBG 组;D:高剂量 CZBG 组 -6- 4 讨论 大量的基础研究表明，因耐药而复发的难治性急性白血病不能治愈的根本原 175 LSC在白血病细胞群中所占比例极少，但自我 因是患者体内存在一群LSC。尽管 更新、无限增殖与天然对抗癌药物和放射耐药能力，赋予了LSC很强的生存优势。 当患者外周和骨髓中白血病细胞被抗癌药物杀伤后，LSC便重新进入细胞分裂周 期，继续分化出新的白血病细胞而导致白血病复发[2]。临床观察也发现，耐药难 治的急性白血病患者化疗后，外周血白血病细胞明显下降，并伴有严重的骨髓抑 180 制，但停药后外周血或骨髓很快出现大量的白血病细胞。为耐药难治的急性白血 病化疗无效原由与LSC快速增殖提供了相关证据[3]。 LSC保持了与正常造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)相同的生物 学特征，如在细胞表面有分子标志物CD34+ 、CD38-、HLA-DR-、CD71-、CD133 ， 高表达。但又不同于增生能力有限的原始白血病细胞，其自身有特异性细胞表 185 型CD123+、CD33+、CD90- (Thy-1)、CD117- (c-kit)、CD96+、C型外源凝集索 样分子1(CLL-1)等高表达。这种特异性细胞表面分子标志物高表达为研究LSC 生物学特征以及靶向治疗提供了重要靶点。其中，具有急性髓性白血病LSC特异 性分子标志物为CD123+、CD33+;CD96+是与AML耐药密切相关的重要标志物 [4-9] 190 。基于上述可以看出，以CD123+、CD33+、CD96+作为LSC的研究靶点，既是 清除AML克隆细胞有效的治疗策略，也是观察抗癌或辅助抗癌药物是否针对LSC 发挥杀伤效应的关键性观察指标。 KG-1a 细胞系是高度表达 CD34 的人 AML 细胞株 KG-1 的变异体，研究表 明，KG-1a 细胞株中具有一群 CD34+CD38-的 LSC 样细胞，这群细胞可以在体外 培养中向 CD34+CD38+细胞分化，并具有自我更新能力[10]。同时，KG-1a 细胞系 195 存在小部分具有形态原始、,,,含量低与静止的周期的 CD34+CD38-的 LSC 样 细胞外，还存在着侧群样细胞(Side population, SP)。这两种细胞类型所代表的 细胞群体不尽相同，SP 细胞可能代表了更为早期的,,,，各自反映了不同发 育阶段的肿瘤干细胞样亚群细胞[11]。因此，可以利用 KG-1a 作为研究对象，并 通过建立动物模型，测定移植瘤组织细胞表面标志物表达来既往能够提高 RAML 200 临床疗效的 CZBG 逆转多药耐药的效应靶点[12]。 研究结果显示:?与生理盐水组比较，CZBG 各剂量组的 CD34+CD38-表达 比率均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿霉素组比较，CZBG 中、高剂量 组均有降低，具有统计学意义(P,0.05)。?与生理盐水组比较，CZBG 各剂量 组的 CD34+CD38-CD123+表达比率均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿霉 205 素组比较，CZBG 高剂量组降低，具有统计学意义(P,0.05)。?与生理盐水组 比较，CZBG 各剂量组的 CD34+CD38-CD96+表达比率均降低，具有统计学意义(P ,0.05)，与阿霉素组比较，CZBG 中、高剂量组均有降低，具有统计学意义(P -7- ,0.05)。?与生理盐水组比较，CZBG 各剂量组的 CD34+CD38-CD33+表达比率 210 均降低，具有统计学意义(P,0.05)，与阿霉素组比较，CZBG 高剂量组降低， 具有统计学意义(P,0.05)。基于上述，结论认为，CZBG 辅助化疗提高 RAML 疗效机制之一是通过影响 LSC 表面标志物 CD34+CD38-、CD34+CD38-CD123+、 CD34+CD38-CD96+、CD34+CD38-CD33+表达而发挥作用。 [参考文献] (References) [1] 王燕，韩正祥，张敬川，等.白血病干细胞耐药机制及靶向治疗[J].现代肿瘤学，2011,19(7):1457-1460. 215 [2] 刘春霞，姚小健，易娟.三氧化二砷联合 FLAG 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 治疗复发急性髓性白血病及白血病干细胞的影响[J]. 中国肿瘤临床，2011,38(5):915-917. 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