原位杂交探针大体可分为三类：寡核苜酸探针，cDNA探针，RNA探针。寡核苜酸探针由25bp左右的核苜酸组成，通常可以由公司合成，由丁其序歹U较短，因此特异性较强，原位杂交时可以区分家族基因，同一基因的不同剪切体，cDNA探针长约500bp左右，可以通过非对称PCR扩增合成，由丁探针式DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的结合不如RNA与RNA结合强，通常不采用，RNA探针长约500bp左右，通过体外转录合成，如果
设计
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合理，其特异性是可以得到保证的，其主要缺点是容易被RNAse酶降解。查看原位杂交相关的文献发现，2000年以前的原位杂交常使用放射性标记的寡核苜酸探针，通过胶片曝光来显色，2000年以后的文献常使用RNA探针。许多肾脏发育的文献虽然有很多原位杂交数据，但却没有附带上探针序列或者用丁探针
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克隆的引物，通过了解厦门黄老师斑马鱼和昆明毛炳宇爪蟾中原位杂交探针设计
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，我们可以采用RNA探针。文献中很难找到关丁RNA探针设计的原则，有的文献报道直接用cDNA合成RNA探针。借鉴爪蟾中原位杂交探针设计流程，以小鼠FGF10的探针设计为例进行介绍。1.在NCBI数据库中下载该FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全长在NCBI中进行BLAST比对分析，比对数据库选择mousegenome+transcript，比对程序选择somewhatsimilarsequence。ZebrafishseqRNAsChooseDacabaseOHumangenomic4transcript©Mchjeqgenomic■+trari'scnptOOthars(nretc.):■MousegenomicplustranscriptMcussG+TPrcarainSelectionOpiimirefor0Highlysimilarsequencesimegablast)0Moredissimilarsequences[discontiguousmegablaut)®Somev/hatsimilarsequencesiblastn)ChooseaBLASTalgorithm■&得出的比对结果中有一幅图谱，显示比对序列与数据库中序列的相似性，探针应设计在与其它基因不存在明显相似性的区段，在比对结果的图谱中选择可变区。如下图黑色框区域。2.估计黑色框碱基在FGF10mRNA中的大致范围，在这个范围内选择长约500bp的序列设计探针。根据上图信息，我们选择FGF103000-3800的范围进行探针设计。agcacagaggcacaatgctttggtttatgggtataggttgcattt3301tgtggtgttctttcaacttgttttctgacaaatgggatttttaaaatgtatacttcttgt3361ggttggattctgtatgttagagtttaattggtaactgagtctaaaggctctaatgtaatg3421aatctctagaagaactaggtatctttttttacttttattttaaaataataattatacctg3481acacatgaccatggaccacccacaaccaaaattaaatgtttggggagacaaactatagta3541ttcagtgacaagggtaacagcaaatagtgcagacgttggattcttatttcactttgccat3601ttagattactaaagagactatgtgtaaacagtcatcattatagtactcaagacattaaac3661agcttctagcaaaatgtatcaaagcttgcagagtccaaaaatagaaaacatctttccccc3721tctcccaccctacatttccccctgtatgcatcctaacagagat底纹标注的为弓I物序列3.将设计好的探针序歹U在UCSC上再次比对分析，genome选择mouse,querytype选择translatedRNA,点击submit,保证搜索出的条目只有目标基因，如果存在其它非目标匹配项（既不是来自FGF基因的序列），则需要重新选择一段探针序列。BLATSearchGenomeGenatne-AssemblyQuery七T：£ortairtyiit-OiTtpjttype:July2007(HCBI37rrim9jvqjgrjLccorswhypcirlirkkk邙“邙■csuggorc电匚包二Gem;匚匚^3G1^gzggtgtte3361ggiEQija匚匚二3421m吕二34213dca已g@u;3541^CcQ^-asca56013d(jQt-tUU；3661agcttstags3721tG^CQSiSlCQGTtHMWE丁51;&W二gg禄g袖s^ggaccacsgdggU33*3X3trtc*tjsfZAagt^taa^Lgcaaata^actg^gtaaccaaaacict^gcacctgta^gQar：：argcg-atttQLaactgaQt>r€t.&aeacgttcaig^ccaasatQw^aawa^rac^aasQgci：c曰At刀WQ9g砂gttestae-tctag^actcaagtag&asacagatWac^t;ettfftBaiqg/Lq/ittatacctcfac^ctcc^atgaca-ticaDi€e；ifL千F-TLLLVwVwV—w*VwI=.i?-iriImfeelingluckyclear你可以点击browser浏览一下所设计的探针序列是否是FGF10的序列以及所在位置。i|-»C1I*•.=-■voursequencgfrom|latsearchVourSeci■UCSCQ$n@3Bss^donRefSe^,uniProf,G^nEank,CCDSand3哗5捉RefSeqGenes在选择探针序列时，尽量选择3'端的区域，避开可能的选择性剪切，同时也要避免mRNA的末端序列，因为可能存在翻译终止序列，影响以后的体外转录效率。经过上述分析后，探针序列可以较好的避免家族基因的保守序列，确保特异性。我们可以针对每个基因设计两个探针，后面比较一下哪个探针杂交效果最
浙公网安备 33021202002483