凝胶迁移阻滞实验（EMSA）转载丁香园大神的帖子！非常详细！EMSA实验技术作为一个经典的DNA/protein,RNA/protein的检测技术，不是很多简单的实验技术可以替代的!EMSA试验技术的独特性和复杂性决定了要想做成功EMSA试验，拿到阳性结果可
总结
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为一句话：把握整体，注意细节！EMSA的整体性包括6大点:探针制备（设计，合成，标记，纯化，退火）;个人实验设计（时间剃度浓度查阅文献等）;核蛋白制备;浓度测定；EMSA操作;实验时竞争设计.这六大点都是会直接影响到EMSA试验的成功与否！简介：EMSA（ElectrophoreticMobilityShiftAssay）凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。发展：从发展史来看，这项实验技术起初是用32P同位素标记人工合成的寡核苷酸形成探针，但是由于同位素的放射性很强而且半衰期为14天，所以从定购到标记再到做完试验必须14天完成,种种制约因素导致现代科技发展非同位素EMSA试验技术，这就出现了地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术在实践中没多久地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术就暴露了一个严重的缺陷，标记的探真纯化后灵敏度弱,导致实验结果的信号不行,最终就出现了现在的生物素标记探真的EMSA实验技术•配合化学发光技术良好的解决了灵敏度的问题，到目前为止，生物素标记探真的EMSA实验技术广为应用!EMSA试验成功的关键因素:1.1•试验设计,主要是你用药品刺激细胞时，设计的药品浓度和时间剃度的问题这个很关键彳艮多同学不注意这一点，最后试验确实是拿不到阳性结果比如我一前一个朋友用药物处理SGC7901细胞,就是因为时间点设计的不好EMSA试验结果是阴性的后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度最终得到阳性结果！所以这个设计很关键给一个个人的实验总结希望能帮助大家一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些，因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程•时间可以长一些，主要根据自己的药物刺激特性确定时间点2•核蛋白样品的制备；制备蛋白样品的关键是：1•注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像2掌握好核蛋白的浓度和纯度尤其是浓度.能入核的蛋白本来就不是很多，所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的！一般要求在1ug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以但是不能太低，否则影响结合反应拿不到结果.这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失同时，一般制备核蛋白的材料为细胞和组织细胞要比组织好做的多，最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多.而组织抽提后杂蛋白相对较多!杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果!！3•探针的制备：又很多站友都在问我生物素标记到3'端还是5'端，其实我觉得最好还是两端都标记，这样才能更好的提高灵敏度，国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以，其制作程序如下：合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链•也是一个比较复杂的过程.EMSA实验技术.这一点主要是操作的细节问题！下面会更细的谈到.技术要点：关于技术要点，我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作，其他的照正常程序就可以了!制胶必须是非变性PAGE凝胶，我们实验室一般用6.5%的非变性胶•制胶很重要，直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.10XTBE1.0ml40%Acrylamide（40%聚丙烯酰胺）3.3ml50%Glycerol（50%甘油）1.0mldH2O（蒸馏水）14.8mlTEMED（四甲基乙二氨）20山脱气10min10%AP（过硫酸氨）120山总量20.0ml一般试剂盒包括的试剂l10XBindingBuffer（10X结合反应液）（-20oC）lPoly(dI:dC)(dI:dC)(聚核苷酸竞争物)(-20oC)_6XLoadingBuffer(loxHr®ii¥^)(4oc)-co-do-igonuc-eotides(-LLLE^astltH?*}或吩®)(—20oc)-Biotin—Labe_edProbe(卅酋洲茹a+s-F)(—20oc)-Sheptavidin—HRP(溝刪沖或洲土RP)(40c)_2XBocl
^i^M1—5匸-或删m(^m或删mMa刮ffl)、^m^l£l]s或^^^^^^>或^対酋油Mffl、油记渊渊ffl§決茁済笹弟紡曲坦一5匸一s-lox1.52po_y(drdc)(drdc)1.0匸一7匸一记渊決*7匸一黑册風番20蛊倂酋洲茹a堡S-4-0.5|1一5ttMffl15匸-黑册風番20蛊曇E(2)sw1£g^su%>習聶：lox1.511一Poly(dI:dC)(dI:dC)1.0卩I细胞核提取物?山未标记的竞争性寡核2.0山双蒸水*?山混匀室温静置20分钟生物素标记的探针0・5山总量15山混匀室温静置20分钟或以上。其中：探针用量:这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是最少50fmol.蛋白样品用量:一般用量在2---20ug(控制在1-5山)蛋白，总体系15ul.细胞核抽屉物浓度都比较低，组织的一般都比较高因为杂蛋白较多.poly(dI:dC)(dI:dC):它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液:每2-3ug核抽提液用1ugpoly(dI:dC)(dI:dC)。未标记的竞争性寡核:做为竞争的探真来说，其实就是没有标记的转炉银子的寡核苷酸用量一般是正常探真的50-100倍.再这里我引申的解释一下其他的对照的含义常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针)；♦阴性对照反应(核蛋白+标记探针)；♦阳性对照(核蛋白+标记探针)♦探针冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记探针）;♦突变探针的冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针）;♦Super-shift反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特异抗体）.预电泳和电泳：0.25XTBE在冰上120V预电泳1小时；务必换掉预电泳的缓冲液用新的0.25XTB低温下150V,电泳约60分钟。注意横压电泳的时候注意电流的数字变化，记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化！电转运在0.5XTBE中390mA电转移40分钟，注意转运膜的选择,有一种离子加强型的转运效果比较好！我当初选择过一般的和离子加强型的，还是离子加强型结合效果好！6•紫夕卜交联:正规的应该是紫外交联仪的使用，但是很多单位没有交联仪，那就用无菌操作台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以了!这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的!条件比较成熟!可以借鉴！7.化学发光反应包括BlockingBuffer30分钟封闭,Streptavidin-HRP标记,WashingBuffer洗涤；EquilibrationSolution平衡，这些按照
规定
关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定
操作即可！没有太多的细节，只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥二是Streptavidin-HRP不能加在膜上而是加在液体中混韵后在将膜放在液体中孵浴.&化学发光图像显示两种方法:化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像操作基本和Western试验操作相当，只是这个膜是一次性的，不能重复使用，一定保存好图片由于跑得是非变性凝胶，蛋白保持天然构想和活性所以代条很可能是一块一块的而不像WB那样很规整的一条细线这个很正常希望大家交流讨论！
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