western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件

蛋白质免疫印迹技术详解1.一、WesternBlot简介二、WesternBlot一般 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 三、WesternBlot成像系统四、WesternBlot常见问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 分析主要内容2.一、WesternBlot基本原理3.一、WesternBlot优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白4.一、WesternBlot应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白、RNA的互作5.蛋白样品的制备SDS-PAGE电泳转膜（PVDF或NC膜）封闭一抗洗涤酶标二抗反应洗涤显影二、WesternBlot一般流程6.LB：62.5mmol/LTris-HCl（pH6.8at25℃）,2%SDS，10%Glycerol(甘油)，50mmol/LDTT(二硫苏糖醇)；溴酚蓝在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！蛋白样品的制备7.8SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其形状及所带电荷的性质无关。蛋白样品的制备.蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒;（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS;（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的;（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比;9.Bradford法：考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。双缩脲法：Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收Lowly法：第一步就是双缩脲反应，即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。蛋白样品的定量10.不连续的电泳缓冲体系。SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。11聚丙烯酰胺凝胶电泳.不连续电泳系统作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸系统12.聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel，简称PAG):单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)催化剂过硫酸铵三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳13.凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431020-807.536-945.057-21214.15.灌制分离胶隔绝空气ddH2O乙醇16.灌制浓缩胶插入梳子17.StakinggelSeparatinggel上样18.电泳19.转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转4h或过夜。20.膜的选择PVDF膜（polyvinylidenefluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的蛋白选用0.2um的膜。预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。21.湿转系统22.转膜23蛋白x(kDa)转膜液转膜条件x<20甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），用水定容至。250mA恒流转3hrs20<x<120配方同上250mA恒流4hrs120<x<200甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），0.05%SDS，用水定容至。250mA恒流转6hrs200<x配方同上500mA恒流转4hrs不同大小蛋白的转膜条件：23.半干转移系统24.封闭为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合而使非特异性背景提高,需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。脱脂奶粉（5％）、BSA（1％）25.一抗、二抗孵育加入一抗溶液与滤膜温育，37℃2小时或4℃过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次5min。加入用TBST配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温孵育1-2小时。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次5min，最后一次用TBS。26.二抗与底物反应显色化学发光显色法(HRP)ECL中的luminol被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.反应的杂质;27.洗脱抗体一抗洗脱二抗洗脱一抗种属来源不同时，strip二抗即可28.三、显色暗室曝光Tanon5200全自动化学发光图像分析系统29.Tanon5200---性能特点适用于高分辨率和高灵敏度的图像拍摄；可设定连续采样的次数、起始及终止曝光时间，进行动态连续拍摄，拍摄得高质量的图片；30.Tanon5200---软件特点31具有序列图像保存功能，无需单张图片分别存储；具有分析软件，可进行泳道密度扫描、半定量计算，分子量计算；图像叠加分析功能：可对两个图像进行合并显示，并进行分析；.胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入AP和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐四、SDS-PAGE常见问题对策32.•条带比正常的窄？•“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适对策四、SDS-PAGE常见问题33.•凝胶肿胀或卷曲？•条带歪斜或漂移？•单个或多个白点？•转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温对策四、SDS-PAGE常见问题34.1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交叉反应5.抗体浓度过高对策1.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度背景太高原因四、SDS-PAGE常见问题35.Thanks！36.