常规分子生物学实验报告-绝对实用

常规分子生物学实验报告-绝对实用 实验一 总RNA的提取 1.1实验原理 本实验采用试剂公司商品化的总RNA提取试剂盒。该RNA纯化系统采用RNA酶抑制剂,异硫氰酸胍(GTC)和β-巯基乙醇,实验的整个操作都在冰浴条件下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。然后根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法原理, 采用酸性酚-氯仿混合液抽提，再进一步从复合体中纯化RNA。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐。 1.2操作步骤 1.2.1细胞或组织破碎:植物组织破碎(适用的样品量为0.05g组织) (1)将1000ul变性液置于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。 (2)将0.05克新鲜组织用液氮冰冻处理。 (3)在液氮下,研磨冷冻的植物组织块。 (4)待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管(最好是预冷冻)中,匀浆破碎细胞。 1.2.2 RNA的抽提 (1) RNP的分离，向离心管内的组织液中加入1ml的裂解液，15?,30?放置5分钟。 (2) 加入200ul氯仿,剧烈振荡15秒，室温放置3分钟, 转移至无菌离心管离心,4?，12000g,10 分钟。(分三层) (3) 将上层水相吸至无菌离心管中+等体积70%的乙醇,混匀，转移到吸附柱中(洗涤除去其中的 盐类)，4?离心，10000g,30秒，弃去废液。 (4) 加入0.5ml的去蛋白液，再以4?离心，10000g,30秒，弃去废液。 (5) 加入0.7ml的漂洗液，4?离心，10000g,半分钟，弃去废液。 (6) 加0.5ml漂洗液,离心两分钟,弃废液. (7) 将离心柱转移到新的离心管中，加入50ul的DEPC水，静置2分钟，4?离心，10000g,2分 钟，收集离心下来的液体，即为所提取的RNA样品。 1.3 结果 经过电泳图像分析大致共出现三条带，即28S、18S以及mRNA弥散带，结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明RNA提取比较成功。 1.3讨论 RNA的提取过程有五点最为关键，,)样品细胞或组织的有效破碎;,)有效地使核蛋白复合体变性;,)对内源,,,酶的有效抑制;,)有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;5) 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。故应做到: 1、研磨组织块用于RNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70?的冰箱中保存。 2、变性液及相应的离心管需预冷。 3、加入变性液后需用力摇动或上振荡器,摇动或振荡时间0.5-1min。 4、在进行RNA提取的整个过程中要佩戴手套和口罩，防止认为的RNA酶污染，导致RNA的降解。所有要使用的器皿必须经过适当的处理才可使用。 实验二 RT-PCR实验 1.1实验原理 利用RT,PCR技术分离目的基因是目前基因操作中最有效的途径之一。RT,PCR扩增产物经纯化、回收、与载体重组克隆，即可实现基因的分离。RT-PCR可由总RNA或mRNA作为模板，目前已 MMLV、MuLV(莫洛尼鼠反转录酶)，AMV(鸟成经有多种操作方法。本实验采用“两步法”进行。(1) 骨髓细胞性白血病毒反转录酶)/,aq酶系统，在此系统中，先有反转录酶合成cDNA第一条链,随后灭活反转录酶,有Taq•酶合成cDNA第二条链和进行PCR扩增。(2)TthDNA聚合酶/Mn,Mg离子系统，在此系统中，TthDNA•聚合酶在不同离子缓冲液中表现为不同酶性质，在Mn离子缓冲液中，该酶表现为反转录酶性质，而在Mg离子缓冲液中又表现为聚合酶性质。因此操作中，先使系统处于Mn离子状态，有TthDNA酶反转录出cDNA第一条链，随后加入EGTA[乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸]鏊合Mn(因Mn•的存在将抑制TthDNA 酶的聚合酶性质的发挥)，再将系统调整到Mg离子状态，有TthDNA酶合成cDNA第二条链及PCR扩增。 1.2实验操作 ,:总RNA及mRNA的提取(见实验一) ,:cDNA第一条链的合成 (1):变性及退火 mRNA 11ul 特异引物 1ul 补水至 20ul 90? 1min 50? 5min,冰浴 (2)按下表加入各反应成分 5×扩增缓冲液 4μl ,种dNTP混合液 ,μl 50mM MgCl 1ul 2 DTT 1ul RNA酶抑制剂 ,,单位(1ul) - 1 - MMLV 200单位(1ul) 加水至 20μl (3):42?反应,,分钟 (4):于,,? 加热,分钟，灭活反转录酶 3:PCR扩增 按下表加入: ,0×扩增缓冲液 5ul dNTP 1ul 上游寡核苷酸引物 10-50pmol(1ul) 下游寡核苷酸引物 10-50pmol(1ul) Taq聚合酶 2.5u(1ul) 加上至总体积 50μl 加矿物油 50μl 4:在PCR仪上设定参数，进行PCR扩增、分析结果。 1.3讨论 1. RT-PCR能否有效地进行,依赖于模板mRNA的完整性和纯度。在操作中必须具备一个无RNA- 酶的环境,实验过程中应该用消毒的离心管、吸液头,戴手套,用DEPC处理的水。如果要从核 酸酶活性高的样品中分离RNA时,建议使用RNA酶抑制剂。 2. 在使用此RT-PCR系统时,为了获得精确的实验结果,要求作模板的RNA,不管是总RNA、mRNA、 还是合成的RNA,都要是无DNA的样品。系统中TflDNA聚合酶在系统规定的操作条件下,无反 转酶活性,但是如果反应体系中含与模板有同样序列的微量DNA,则该酶会催化扩增出非实验 所需的片断。 3. RT-PCR反应中模板RNA的最小需要量,与模板RNA和引物片断的类型有关,对于系统提供的对 照RNA模板,每一反应所需的最小量为10的3次方分子(2.5Zeptomoles，2.5×10-25mole)。 为了使RT-PCR实验能获得较好的结果,要求,对于总RNA作为模板,这在每一反应中其量应为 10pg-1μg,而对于mRNA做模板则要求量为1pg-100ng。 4. 在RT-PCR实验中,最好进行对照和空白对照反应,在进行对照反应实验时,反应体系中加入试 剂盒提供的对照模板和对照上下游引物;在进行空白对照反应时,则采用灭菌的无DNA水代替 RNA作为模板,用于反应体系。在实验中要特别注意防止各次实验之间样品与前次实验的残留 核酸(DNA或RNA)的交叉污染。每次实验中扩增前的操作步骤应与扩增后的操作步骤最好有相 互分开的工作区和取液器具。操作中最好使用能很好防尘的吸头。操作人员要戴上手套,并经 常更换。实验中应用UNG或其他灭活技术处理以防止残留DNA被带入反应过程。 5. 镁离子浓度 在RT-PCR反应系统中,由AMV逆转录酶和由TflDNA聚合酶催化的两步反应均需要镁离子, 而这两步反应中所需的镁离子量且由反应体系中的核苷酸、寡聚核苷酸引物及模板的终浓度 决定。反应体系中硫酸镁的使用浓度必须满足模板/引物的综合需求,虽然1-2.5mM的浓度的 硫酸镁能基本满足大多数RT-PCR的要求,但镁离子浓度更进一步精确,将使逆转录和扩增过 程灵敏度更高、专一性更强、质量更好。为了正确确定反应中所需镁离子的浓度,在正式实验 前应先进行一系列平行实验,在这些平行实验中,在50μl反应液中分别加入1,2,3,4,5,6μl 硫酸镁储液(试剂盒所带,25mM),然后比较各实验结果,以确定镁离子浓度。 6. 引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 在操作中必须用特殊的引物来进行第一链的合成。这种引物与模板上一特定序列煺火, 将模板上的某一段mRNA(而非整个样品mRNA)反转成cDNA。对于cDNA和基因组DNA的扩增差 - 2 - 异来讲,前者的引物是与外显子而非内显子互补的。基因组DNA的扩增产物要比RT-PCR的产 物大许多,这种长度上的差异不仅有助于在胶上将两者分开,而且更有助于cDNA的扩增产物 的形成(因PCR在短片断的合成上更具优越性)。引物浓度是RT-PCR中应考虑的另一个引物方 面的问题,我们建议开始时的引物浓度最好用50pmol(这样终浓度可为1μM)。 7. 模板 温度及循环数 RT-PCR反应中并不要求模板变形,如操作人员想加这一步,则应经模板/引物混合物与其 他反应液分开,单独对模板/引物在94?变性2分钟(AMV千万不能参与变性,否则将失活),然 后再将其加入到RT-PCR的其他反应液中,在48?保温。 8. 引物的序列是PCR扩增中各温度设定时首要考虑的因素。常规的扩增过程为变性(94?),煺火 复性(42-60?),延伸(68?),如引物有高的Tm值,则可提高上述的煺火复性(42-60?)和延伸 (68?)温度,煺火温度越高,非特异性扩增越少,特异性扩增越多。另外如上游引物的Tm低, 则应降低煺火复性温度,使引物与模板能很好的煺火。 9. 对于PCR循环数我们建议用40个,如模板RNA为稀有RNA,或量很少,则循环数可相应增加到 45-50个循环。 实验三 PCR片断的回收 1.1实验原理 目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片断。本实验采用的微量柱回收技术特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程,PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出来，成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围内有较高的回收效率。下表为不同长度的DNA片断,在室温条件下,用此纯化系统直接纯化时,各自相应的回收率。 dsDNA长度 bp 200 1500 300 200 75 50 回收率% ? 60 96 99 69 3 2 1.2实验操作 从琼脂糖凝胶介质中纯化PCR扩增的目的DNA片断 1.用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离,该电泳安常规方法进行,缓冲液为 TAE。 2.在凝胶上,找到所需条带,然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近100微升琼脂糖凝胶 (约100 毫克)，放入小离心管中。 3.向加入离心管中加入300ul(凝胶体积的3倍)的溶胶液，50?水浴10分钟，中间混匀两次。 4.为待回收片断准备好一个微量吸附柱。将所得到的混合液转入到此微量吸附柱上。然后再 12000rpm离心30秒，弃去废液。 5.向离心柱中再加入700ul漂洗液，12000rpm离心30秒，弃去废液。 6.向离心柱中再加入500ul漂洗液，12000rpm离心30秒，弃去废液。 7.将吸附柱放入另一个离心管中，再12000rpm离心2分钟，弃去废液。 8.取出柱子，放到另一个离心管中，加入25ul洗脱液，室温静置20分钟后，再12000rpm离心1 - 3 - 分钟，收集离心出的溶液，即为所需的样品。 1.3实验讨论 1对于>3Kb的片断在纯化回收时,洗脱前,如先将水或TE缓冲液预热到65-80?,则将能有效的提 高回收率。待洗脱片断>3Kb时,洗脱液温度应为65-80?;待洗脱片断>20Kb时,洗脱液温度应达 80?。 2应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难 溶复合物，这种复合物使胶难熔解。 3在取用纯化柱树脂中的液体前,应将树脂充分搅匀,如树脂中出现结晶或结块,则应将树脂在 25-37?,温热10分钟,冷却至30?使用。树脂本身不会溶。 4在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起 DNA变异。 5目前待回收的片断主要有酶切片断和各种PCR片断;回收的介质主要有琼脂糖和PAGE;回收的 方法主要有树脂回收、微量柱回收、玻璃奶回收、液氮冻冻融回收及透析袋大量回收等。 实验四 PCR片断的快速克隆 1.1实验原理 T,载体技术对于一些多克隆位点的可选择内切酶种类稀少的表达载体该技术特别适用。该方法具有不需对引物进行特殊酶切位点的修饰，即能直接进行PCR产物的克隆，并具有克隆效率高的特点。T-载体均是通过载体是通过用EcoR?或SmaI等平末端酶将相关载体切割出平端,然后再在其两个3`端加上T而构成的。这些存在于插入位点的突出的3`末端可防止载体的自身环化,并为PCR产物提供碱基配对区(因PCR扩增产物的3`末端为非特异性的A碱基)而有效地提高了PCR扩增片断的克隆效率。 本实验中用pGEMR-T载体为材料，pGEMR-T载体来自于pGEM系统载体，这类载体中含有T7和 该系列侧翼为一多克隆位点区,该区有β-半乳糖苷酶的α-肽端的编码SP6RNA聚合酶的启动子系列, 区。β-半乳糖苷酶的α-肽编码区的插入失活,能使重组子在指示平板上通过颜色反应加以检测。此两个载体的多克隆位点区含有多种内切酶位点,此很容易来构建嵌套缺失位点。pGEMR-T Easy载体系统的多克隆位点两侧都存在EcoR?、BstZ?、Not?,因此该载体可通过这三类酶进行单酶切构而建重组片断; 而pGEMR-T载体系统的多克隆区两侧都有BstZ?酶切序列,因此用此酶进行单酶切操作,即可释放出可插入位点。除了单酶切外,这两类载体都可通过双酶切操作来形成插入位点。pGEMR-T及pGEMR-T Easy载体系统中都有嗜菌体f1的复制起始区,借此可以合成单链DNA。并可用双重反向启动子(T7,SP6)进行体外转录。在 pGEMR-T系列载体系统中,外源片断的克隆将打破载体中的β半乳糖苷酶的编码序列,因此重组子可在指示平板上用颜色反应加以筛选。将外源片断克隆到pGEMR-T载体中,然后再转入感受态细胞,这样在指示平板上蓝白斑的比例将下降,在通常情况小,外源片断的插入将产生白斑,但在某些情况小,含重组子的载体也能形成蓝斑,这主要是插入片断长度(包括3`A突出末端)为3`核苷酸的倍数,且插入位点在lacZ基因的阅读框内,并插入片断不含终止密码子。这样就可能不破坏阅读框而翻译出含β半乳糖苷酶N端多肽片断的融合蛋白,与宿主菌的C端片断发生α-互补而形成蓝斑。 - 4 - 1.2实验步骤 (一)T,载体的构建 1.提纯载体DNA 2.将1ug提纯的PGEM DNA用SmaI1ul进行全酶切(为了切割彻底、甚至能破坏酶切位点周围碱基序 列而防止自连发生，酶可过量使用，并在25?过夜) 3.酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶 4.在上述酶切反应后复溶的含1ugDNA的Eppendof管中加入 10× PCR缓冲液 5 ul 10mM dTTP 10 ul 1mg/ml BSA 10 ul 5U/ul Taq酶 0.5ul 加水至50ul 70?2小时，酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶 (二)PCR产物的T,载体克隆 1.PCR产物的纯化 2.按下述比例进行连接反应 反应体系 10×T4DNA连接酶缓冲液 1 T,载体 1 PCR片断回收产物 7.5 T4DNA连接酶(3u/ul) 0.5 加水至10ul 3.将反应体系轻轻点动混匀后，4?连接过夜。 4:T,载体与外源片断连接后的转化见后面的实验十和十一 1.3讨论 1.在室温下,缩短保温时间,也可能是有效的操作方法,但这有可能降低克隆数。最适的连接条 件为4?过夜，因PCR产物与T,载体间的配对碱基少，高温不利于连接的进行。经验表明 如连接反应高于15?，则兰斑数大大升高，可能T载体中存在没有加上T的载体，高温下 平端自连的比例增加。 2.连接酶最好用相关的经修饰纯化的T4DNA连接酶,因其他连接酶可能具核酸外切酶的活性, 这样如用这种酶就有可能导致对载体3’T产生切割。 3.T4DNA连接酶的10×缓冲液中含ATP,在温度频繁波动时,此成分有可能被降解,因此要避免 仅为了少量使用而对缓冲液反复冻融。如果在融化后的T4DAN连接酶10×缓冲液中出现沉 淀,则应将此缓冲液振荡,以使沉淀复融。 4.重组T载体转化时最好用SOC培养基,LB培养基也能用,但转化数可能低。 5.因含β半乳糖苷酶的菌落生长速度慢于无此酶活的菌落,因此保温过夜后,蓝斑菌落要远小 于白斑菌落,白斑菌落的直径近1毫米。 6.有文献报道当重组的外源DNA片断接近2Kb时,其可能会克隆到阅读框,并产生蓝斑。即使 实验中预设扩增片断并非3`核苷酸倍数,但扩增过程可能会导致核苷酸突变(缺失突变或点 突变),这种片断与 pGEMR-T系列载体重组后,再转化到感受态细胞中后,即有可能产生蓝 - 5 - 斑。这点已有文献报道，因此在筛选重组菌斑时要特别注意。 实验五 染色体DNA的提取 1.1实验原理 通过液氮研磨粉碎植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。 1.2实验操作 (1) 植物材料1g(鲜组织) 在液氮中,研碎 (2) 700ul的裂解液GP1(含1/10体积酚,65?预热，水浴20分钟), (3) 加入等体积氯仿,轻摇,30分钟 (4) 离心(12000-15000rpm, 15min ) (5) 抽取水相的上清液转移到新管中 (6) 加入700ul的GP2溶液，混匀 (7) 将溶液转到CB3柱中，先加入700ulGP2溶液，13000rpm，离心30秒，弃去上清 (8) 再加500ul去蛋白液GD，13000rpm，离心30秒，弃去上清 (9) 再加入700ul的漂洗液GW，13000rpm，离心30秒，弃去上清 (10) 再加入500ul的漂洗液GW，13000rpm，离心30秒 (11) 将柱转到新的空管中，继续13000rpm，离心5分钟,室温放3分钟. (12) 向柱中加入EB溶液50-200ul，静置4分钟,13000rpm离心1分钟,收集得到的样品。 1.3结果鉴定 所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳胶分析，紫外观测仪观测，采用凝胶成像系统拍摄，得到清晰的DNA片断条带，保存图片结果。同时进行当OD260/OD280=1.8 为纯样 1.4讨论 (1) 在DNA提取过程中应做到 A 根据不同研究需要，保证结构的相应完整性; B 尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等); C 保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。 (2) 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解 (3) 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解 (4) 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰. (5) 异丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。 (6) 本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省线的特点， 但所提DNA完整性不强，一般不适用于基因组文库构建 - 6 - (7) 此方法也适合菌类基因组DNA的大量提取. 实验六 质粒DNA提取和纯化 1.1实验原理 (1) 碱解法提取质粒DNA，本方法适合于质粒DNA的微量提取。 (2) 整合外源DNA并将其带入宿主细胞的过程是分子克隆的关键。而在此过程中携带外源基 因的工具为载体。克隆操作是将待克隆片断先克隆到通用大肠杆菌载体的多克隆位点 区，或直接测序或根据需要再克隆到其他载体上。 (3) 大肠杆菌质粒多为一些双链、环状的DNA分子，其大小范围从1Kb-200Kb以上不等，它 们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋于菌体 一些特殊的表型，这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。 1.2操作步骤 (1) 含氨卞(100ug/ml)的LB培养基 培养菌体 37? 200rpm 过夜 (2) 含氨卞的LB培养基 培养菌体 37? 200rpm 3,4小时至OD600到0.4-0.6，吸取1.5ml (3) 离心，,? 13000rpm,1min (4) 收集菌体沉淀( 充分去除LB培养液) (5) 加入预冷的250ul Solution ?,充分振荡悬浮 (6) 加入250ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min, (7) 加入350ul预冷Solution III混匀, 冰浴5min (8) 离心,13000g,4?,2min (9) 取上清,加入吸附柱中. (10) 再离心，13000rpm，3分钟 (11) 上清，700ul的洗液,室温,5min, 离心,13000rpm,4?,1min 4?,1min (12) 取沉淀，再加500ul洗液，离心13000rpm， (13) 13000rpm,空离4分钟. (14) 悬于50μl,100ul的洗脱液中 (15) 再离心13000rpm，4?,1min，收集质粒DNA样品。 (16) 取10ul样品点样电泳鉴定 (17) 剩余样品，-20?保存备用。 1.3讨论 ,.试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解 ,.试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离子对溶菌酶有抑制作 用。 ,.试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAC能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。 4 .如A,不用酚/氯仿抽提;B,LB培养基残留;C，提取中在溶液II中时间过长，导致共价闭合环 状DNA不可逆变性，则可能影响酶切。 - 7 - 5 .质粒提取方法还有很多，如要进行重组质粒的植物转化或质粒测序则应进行氯化铯梯度离心， 或直接采用试剂盒提取。另试剂盒提取可同时进行许多质粒的提取，能在最短时间内获取高 质量、高浓度的质粒DNA 6.载体因具有通用引物序列、多克隆位点区具极多载体有 1) 在宿主细胞中独立复制能力; 2) 带抗性等选择标记; 3) 有合适的限制性内切酶位点，可插入一定片断长度的外源DNA而不影响自身复制的特 点。 7 .目前经基因操作已构建了一大批适合不同宿主细胞，有不同选择标记的克隆载体或表达载体。 这些载体有以下几类: 1) 宿主为大肠杆菌的质粒、Lamda噬菌体、噬菌粒、噬菌体M13、粘粒和卡粒等; 2) 宿主菌为酵母的以酵母人工染色体克隆系统(YAC)为代表的酵母菌质粒载体及酵 母菌与大肠杆菌穿梭质粒载体; 3) 以枯草杆菌为载体的枯草杆菌质粒载体和芽雹杆菌与大肠杆菌的穿梭质粒载体 4) 宿主为植物细胞的Ti质粒、植物病毒及带有正核启动子的改造质粒; 5) 动物细胞为宿主的动物病毒和以动物病毒为基础改造的穿梭质粒。 8.质粒DNA的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步: 第一 细菌培养和质粒的扩增， 第二 细菌菌体的裂解， 第三 质粒DNA的纯化。菌体裂解方法不同，决定了质粒DNA提取方法的差异，目前菌体 溶菌酶法等。 裂解方法主要有煮沸法，SDS法，碱解法,Triton- 9.质粒DNA的纯化方法主要有梯度离心法、柱层析法等， 10.在质粒DNA提取中，质粒DNA的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响,通过一些实验 发现,下列培养方式能获得较好的结果 (1) 培养应用菌龄不超过4天的平板单菌落作为起始菌 (2) 培养菌应在37?,220rpm下,生长16-18小时 (3) 不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备 (4) 如果要提取大质粒DNA则建议使用溶菌酶裂解细胞，以释放质粒DNA 实验七 DNA片断的酶切 1.1实验原理 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核苷酸序列的测定、基因片段的重组，转化菌中重组子的筛选、探针的制备及各种杂交、测量基因的拷贝数,基因文库构建,等都离不开限制性内切酶的应用。另外以限制性内切酶为基础的各种限制性内切酶片段长度多态性分析，促进了分子遗传学、分类学等相关学科的应用和发展。 本部分实验主要学习掌握通过EcoR?，Hind III两种限制性内切酶对λDNA的单酶切、双酶切及部分酶切的操作 - 8 - 1.2实验操作 EcoR ?、Hind III双酶切λ,DNA、染色体DNA和质粒DNA 1. 取3支干净、灭菌新Eppendof管，按下表加入(ul) λ,DNA 染色体DNA 质粒DNA 灭菌水 14 12/10* 12 缓冲液 2 2 2 模板DNA) 2 4/6 4 EcoR ? 1 1 1 HindIII 1 1 1 总体积 20 20 20 (注*:根据所提取的染色体DNA量而定) 2. 37?保温2,3小时 3.保温结束后65-70?10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提) 4.取4μl左右的反应液加入4μl溴酚蓝混合均匀，点样，电泳分析酶切结果。 1.3讨论 ,.样品加入次序为水、缓冲液、模板DNA最后为酶，不应颠倒， ,.加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀 ,.反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2-1ug模板DNA时， 应将体积控制在20,30ul内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10,因为限制性 内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10,则反应液中甘油浓度将大 于,,，而此浓度将抑制内切酶活性。 4 .为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓 度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积;而一般 为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA 溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低 则应进行浓缩。 5.本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所以，可在同一反应体系中完成 双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时 加入同一体系，进行反应，此时可采取下列处理办法 a:先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量的NaCl及第二 种酶，继续保温。 b:使用所有限制酶均可作用的单种缓冲液(谷氨酸钾缓冲液)。 c:一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第二种酶切。 在上述3种方法中遇到最多的可能为C 6.在水解结束灭活酶时可采用65?加热10分钟或加EDTA至终浓度10mM，二者各有利弊， 加热简单但对有些酶灭活不彻底。EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反应变 得极为困难，因此在连接前要求重新用有机溶剂抽提，这将增加操作难度和导致DNA的 损失。 - 9 - 实验八 DNA酶切片断的脱磷 1.1实验原理 在对DNA片段的修饰中，脱磷酸化反应是一个重要内容,该反应有碱性磷酸化酶催化，该酶可使线状DNA上去除5'磷酸基团，而DNA的脱5'磷酸基团一方面是基因重组、载体构建中防止载体DNA自身联接、环化的重要途径，载体经单酶切线性化后,3’端为羟基、5’端为磷酸基，在连接酶作用下将以极大比例发生载体自连,而5’脱磷后,载体在5’与3’位均为羟基不能自连只有与带5’磷酸基的外源片断连接,载体与外源片断间形成一个磷酸二脂键和一个缺口,缺口在转移进细胞后修复.另外脱磷作用还可发生在RNA、DNA、三磷酸腺苷、脱氧三磷酸腺苷的5’端，这个反应是进行探针标记操作中的重要环节。 1.2实验操作 ,.在前实验所得DNA限制性内切酶片段中加入 酶切片断DNA样品 16ul 10×碱性磷酸酶缓冲液 10ul 碱性磷酸酶(0.01u/pmol ends) 1ul ddH2O 73ul 总体积 100ul 对于5’突出则37?下温浴30分钟,再加入1ulCIAP(0.01u/pmol ends), 37?下温浴 30分钟. 对于平末端或3’突出末端,则37?下温浴15分钟,56?下温浴15分钟, 再加入1ul CIAP(0.01u/pmol ends), 37?下温浴15分钟. 56?下温浴15分钟 ,.温浴结束后加入EDTA(pH 8.0)至终浓度分别为10mM，70?加热20min，以灭活碱性磷酸酶 ,.补加水100ul，加入氯仿抽提上清，10000rpm，离心5分钟，取上清 ,.加入1/10体积NaAC，充分混匀，再加入,体积的乙醇，,70?放置30分钟，再离心,?， 12000g离心10分钟，取沉淀DNA。 ,.冷70%乙醇和1/10体积NaAC洗沉淀一次 ,.TE溶解(终浓度为100μg/μl)，-20?保存 ,.沉淀或用电泳缓冲液溶解，上样电泳分析。 1.3结果鉴定 将脱磷片断中加入连接酶,以加入连接酶的非脱磷片断作为对照,,连接反应后,Agarose电泳分析,脱磷片断不能连接,而非脱磷对照片断能连. 1.4讨论 1. pmol ends=3.04×ugDNA/DNA的碱基数 2.在上述几个实验中，有机溶剂沉淀时所用NaAC的pH最好为7.2或用7.5M的NHAC，如用pH5.24 - 10 - 的溶液则有可能导致EDTA沉淀量增加，影响以后的连接反应。 3. 碱性磷酸酶有两类BAP(细菌碱性磷酸酶)和CIP(小牛肠道碱性磷酸酶)，因BAP耐热，灭 活时必须采用有机溶剂抽提法，而CIP在68?10,SDS条件下即可灭活，因此实验中一般 都采用CIP。 4 .条件的摸索需要预试验。 实验九 DNA片断的连接 1.1实验原理 DNA酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术，该技术是基因重组，基因改造的重要中间环节。两DNA片段相邻的5'磷酸和3'羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA联接酶和TDNA连接酶催化，但分子生物学实验中主要采用TDNA连接酶，44因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。在基因重组克隆中外源DNA与载体的连接是承上启下的一步操作。 1.2实验操作 1.取干净、灭菌Ephondof管，安下表加入各试液 T4DNA联接酶缓冲液 1ul 载体DNA片断 1ng (3ul) 插入目的片断 1ul 连接酶 1u(平末端,如为粘端连接,则酶量可小于1u) 加无菌水 4ul X=目的片断与载体片断的分子比例×载体ng数×目的片断的碱基数/载体ng数 (目的片断/载体片断的分子比例一般为3/1) 2.连接反应 22?保温3小时或4?过夜(Promega连接酶,粘端连接) 或22-26?1hr(BRL连接酶,粘端连接) 或22?4-16hr(Promega连接酶,平端连接) 或14?16-24hr(BRL连接酶) 1.3讨论 1.粘端连接时模板DNA用量控制在0.1-0.5ug间，而平连时模板量应>0.5ug。粘连时温度可在4 ? 过夜，而平连时最好在12,16?过夜 2. 用于转化的连接片断最好不要冰冻 3 .胶内连接时，应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多 聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解，将抑制连接酶。 4.在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引 起DNA变异。 5. 在分子生物学实验中连接酶主要用于1)基因重组中载体与外源基因的连接;2) 接头与DNA片 - 11 - 断的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的AFLP及差异表达的研究等中。 6.根据连接片断末端类型不同，连接方式有粘端连接、平端连接等和平粘端连接及单碱基配对的 T,载体连接。其中粘端连接的效率最高，粘端连接与平粘连接中外源DNA片断在载体中的插 入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例较高，因此在克隆操作中为了克 服平连的弊端，通常可通过1)TdT酶在载体和外源DNA片断上转移一互补序列(核苷酸投影 法);2)在载体和外源DNA片断上加上人工接头，变平连为粘连。 7. Buffer 中含有ATP， 故应分装防止ATP失活。 实验十 感受态细胞的制备 1.1实验原理 当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一重要的技术关节。目前制备感受态细胞常用方法多为钙盐法或PEG法或电击法。 1.2实验操作 ,.大肠杆菌在LB平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB培养基中摇瓶培养大肠杆菌到 对数期(37? 200RPM 3-4小时，如从冰箱中保存平板中挑取的菌落，则到对数期时间可能 要到6-7小时) ,.取1ml培养物10000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置 ,.用预冷的600ul氯化钙悬浮菌体，10000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置 ,.用预冷的1000ul氯化钙悬浮菌体，冰浴15min，10000rpm,离心2min(可见一条线状条带).收集菌体，冰浴放置 ,.加入200μl预冷氯化钙，放置于冰浴，即得感受态细胞,此细胞可现用(冰箱中放置12小时 效率高),也可在4?保存1周，或分装于无菌离心管中,投入液氮,快速冷冻然后储于-70? 保存 1.3讨论 在本操作流程的前几步中，每次离心后，应尽量将上清液去除干净，以防LB培养基的污染 实验十一 重组体的转化 1.1实验原理 转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒导入受体细胞，使重组质粒在受体细胞中稳定的复制和表达。要成功地进行 - 12 - 转化实验，必须满足三个要求即,，有一好的感受态细胞;,，良好的转化环境;,，待转化DNA应与受体细胞DNA有好的同源性。 1.2实验操作 1.现制感受态细胞可直接使用;冻存感受态细胞在手心缓慢融化. 2. 加入待转化外源DNA(40ng左右)，冰浴30min。 3. 42?热冲击1分30秒 4.冰浴5min 5.加入1mlLB液体培养基，,,?保温45分钟,1小时。 6.取20,200ul菌悬浮液，涂布于有选择压力的LB培养基上(本实验中为100ug/ml的安卞青霉 素培养基)，,,?保温过夜。 7.计数，计算转化率。 1.3讨论 1.对于有些宿主菌,在上述步骤中用SOC培养基代替LB培养基可能有更好的转化率. 2.选择压力培养基有待转化DNA所带抗性标记决定。 3.重组片断的筛选也可用培养基进行。 4.转化率:每ng DNA 转化后产生的菌落。 实验十二 重组体的筛选 1.1 实验操作 在LB培养基上滴加100ul转化后菌体，再在菌液上滴加4ulIPTG(200ug/ml)和40ulX-gal(20ug/ml溶于二甲基甲酰胺)，涂布均匀，,,?保温过夜后，培养基中的白班菌落即为重组克隆。 实验十三 RAPD技术 1.1实验原理 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA,随机扩增的多态性DNA)是建立于PCR实验基础上的检测基因组DNA多态性的实验技术。 该技术利用大量的、各不相同的、碱基顺序随机排列的寡聚单核苷酸链为引物，以待研究的基因组DNA片段为模板，进行PCR扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳等分离，经染色后，即可对此基因组DNA进行多态性分析。 - 13 - 1.2实验操作 1:基因组DNA提取(见前面的实验) 2:取0.5mlEppondef管,加入 基因组模板DNA 40ng PCR扩增参数(94? 预扩增5min) 10×PCR缓冲液 2ul 94? 变性 30秒 10μM的dNTP 0.4ul 36? 褪火 90秒 10mer随机引物 0.8ul 72? 延伸 60秒 Taq酶(5u/ul) 0.2ul 40个循环，结束后，72?延时10分钟 Mg离子溶液25mmol) 1.2ul 加水至 20μl 混匀后离心 ,:扩增产物与电泳上样液等量均匀混和，1.5% Agrose胶电泳分析结果。 实验十四 AFLP技术 1.1实验原理 AFLP是又一种建立在PCR基础上的限制性片断长度多态性分析，是一种重要而有效的分子标记技术。 1.2实验操作 1(总DNA提取(见前面的实验) 2(DNA酶切连接 DNA模板(200ng/ul) 5ul Mse I 0.5ul(3U) Pst I 0.5ul(3U) 10×T4 Buffer 2.5ul 酶切液 2.5ul PstI 接头( 5pmol/ul) 1.0ul MseI 接头(50pmol/ul) 1.0ul 10×连接酶Buffer 2.5ul TDNA连接酶(3u/ul) 0.4ul 4 加ddHO 25ul 2 37?酶切,连接过夜或5小时 3:DNA样品的预扩增 连接后模板样品 2.5ul MseI 引物(MOO 50ng/ul) 0.5ul SseI 引物(POO 50ng/ul) 0.5ul 2+ Mg(25mM) 1.2ul 10×PCR缓冲液 2.5ul - 14 - 25Mm dNTP 0.5ul Taq酶(5u/ul) 0.65ul 加ddHO至 25ul 2 混匀、离心 PCR扩增 PCR参数为 94? 30’ 56? 30’ 30个循环 72? 60’ 预扩增结束后，样品用0.1M的TE稀释20倍，,20?保存或用于扩增 4:DNA样品扩增 预扩增样品取1ul稀释到20ul取 1ul MseI 引物(MOO 50ng/ul) 0.5ul SseI 引物(POO 50ng/ul) 0.5ul 10×PCR缓冲液 2ul 25mM dNTP 0.4ul Taq酶(5u/ul) 0.5ul 加水至 20ul 匀、离心 PCR扩增 PCR参数为 混 94? 30’ 65? 30’ 12个循环 72? 60’ 复性温度每循环降低0.7? 94? 30’ 56? 30’ 23个循环 72? 60’ 6:扩增产物的检测 测序胶及银染操作 7:差异片断的纯化、回收、最扩增、最纯化回收的操作 1.3讨论 T载体方便，可以直接插入外源表达，当外源片断背景不清晰时，用T载体，但PCR对酶有要求， Taq 酶是非高保真酶，扩增片断两端加碱基，优先为A，形成粘端，因此Taq 酶模板需要比例适当，否则已造成高错配平。 实验十五 cDNA文库构建 1.1实验原理 构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组,基因克隆的重要方法,而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA，在逆转录酶作用下，以Oligo(dT)或寡聚,核苷酸(随机)为引物，进行cDNA第一链的合成。而第二链的合成有自身引物合成,外加引物合成及置换合成,本实验采用置换合成法进行,即在RNaseH作用下，部分降解RNA，再用DNA多聚酶?产生的DNA片段取代，以合成第二条链。 - 15 - 1.2实验操作 1.2.1 第一链的合成: a.在灭菌的DEPC处理Eppondef管中,分别加入: 模板 样品mRNA 1μg 引物 (0.5μg/μl) 1μl (6碱基随机引物 或oligdt) 加水至 10μl b.70?5-10分钟,冰浴冷却5分钟(避免出现二级结构) c.在上管中，根据下表依次序分别加入 水 2μl 5×第一链缓冲液 4μl 40mM焦磷酸钠 2μl 核酶抑制剂 1μl AMV反转录酶 1ul d.敲打混合,离心后放于37?或42?60分钟。 e.反应完毕后,将反应管置于冰浴。用于第二链合成。 1.2.2第二链的合成 a.第一链合成完毕后，直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入 2.5×第二链缓冲液 40μl， DNA聚合酶? 0.5μl RNase H 0.5μl 加水至 100μl b. 14-,,?下放置2小时。(>3Kb时反应时间延长至3-4小时) c.在样品管中加入T4DNA聚合酶(2μ/μgRNA)37?放置,0分钟。 d.加入 4μl 500mM的EDTA到该样品管中,然后置于冰浴上. e. 等体积加入TE饱和酚\氯仿\异戊醇抽上清,用氯仿\异戊醇和氯仿各抽上清一 次,12000g,3min f.上清液转移至一干净试管,加2V乙醇,1/10V乙酸钠-70?30min沉淀,12000g,15min 收集沉 ， 70%乙醇洗沉淀,干燥,TE复溶。 合成后的cDNA链既可经与一定的通用接头连接后,生成末端序列,也可通过一定的内切酶处理, 然后(1)与未端有互补序列的λ臂-DNA连接，形成重组λ-DNA,再经体形成一定序列的末端片断, 外包装形成完整λ噬菌体，经转染后,生成噬菌体cDNA文库.(2)与未端有互补序列的质粒载体连接，形成重组质粒DNA, 生成质粒cDNA文库。目前经常使用的一些载体已经商品化,商品化的λ载体主要有噬菌体左右臂、复制原点及启动序列构成,其在连接酶作用下,可直接于具相同末端序列的cDNA互补连接。cDNA末端序列的产生可通过1)可添加核苷酸后酶切;2)直接加商品接头而形成与相应噬菌体左右臂相互补的序列。 1.3讨论 a) 在这个逆转录过程中，模板mRNA及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mRNA来讲， 一是丰度，二是纯度，丰度愈高，纯度越好，合成效率越好 b) 引物可为特异引物(构建特异文库)、olig0(dt)15引物或6核苷酸随机引物，但不同引物 RT时温度不同，前两种在42?下进行，而随机引物则在37?下进行。 - 16 - c) 不同载体有不同的末端序列,有不同的宿主菌,有不同的筛选方式,因此在进行文库包装时, 一定要搞清楚这些情况,以有的放矢的进行工作. 实验十六 SSR实验 1.1实验原理 SSR(simple sequence repeat )技术是另一种非常有用的分子标记技术，在生物体基因组内存在许多重复的简单序列小片断，在不同种内小片断的重复数不同，这种不同的重复数，是由其遗传基因所决定，有种属特异性，这种差异经PCR扩增后，被放大到可检测程度。因此SSR构成了另一种标记系统。 1.2实验操作 1(总DNA提取(见前面的实验) 2:PCR扩增 模板DNA 2ul 第一轮扩增参数 第二轮扩增参数 10×PCR缓冲液 1ul 95? 1min 95? 1min 25mM氯化镁 1.5ul 65? 1min 55? 1min 10mM dNTP 0.5ul 72? 1min 72? 1min SSR上下游引物各 2ul 第一轮13cycle,复性温度从第三循 5u/ulTaq酶 0.25ul 环开始每一循环降低1?直到55?, 加水至 10ul 第二轮30 cycle 3:电泳检测 测序胶电泳，EB或龈染 操作同前面实验。 实验十七 Southern 杂交实验 1.1实验原理 Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。它可用于基因组特定DNA序列的定位，可以测定相关片段的同源性、可以从cDNA库、基因组文库中筛选完整基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。 1.2实验操作 (一)转膜 1 电泳 2 切胶 在紫外下，切取凝胶有条带部分 - 17 - 3 脱嘌啉 0.25NHCL浸泡凝胶10分钟，蒸馏水洗胶(大于15kb的DNA片段转移时做此步骤) 4 4 变性，变性液(0.5MNaOH、1.5MNaCL)浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶 5 中和,中和液(0.5Mtris-HCL,pH7.0、3MnaCL)浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶 6 平衡，凝胶在20×SSC中室温平衡10分钟 7 转膜,取一塑料盒,将一干净玻璃板横架于盒上，盒中倒入10×SSC，作为转移缓冲液，将3张 大小合适的滤纸用10×SSC溶液浸湿，放置于玻璃板上，作为滤纸桥 将处理好的凝胶切去多余部分并切下一角作标记，胶面反转放置于滤纸桥上，四周用Parafilm 膜封闭，以防短路 剪取一块面积稍大于凝胶的硝酸纤维素膜(NC膜)，以2×SSC溶液浸湿后置于凝胶上 剪取2块相应大小的滤纸，以2×SSC溶液浸湿后置于NC膜上 (滤纸、凝胶、NC膜、滤纸间都不能有气泡) 滤纸上面放一叠吸水纸，上面压一块玻璃板，再压上500g左右的重物，转移过夜 8 烤膜，转移结束后，NC膜在与凝胶切角相对处，用铅笔做记号，用6×SSC溶液室温漂洗5 分钟，以充分洗去沾上的凝胶成分，吸水纸吸干残余液体，室温晾干，NC膜用滤纸夹裹好， 80?烤膜2小时 9 烤干的NC膜用,×SSC浸润。 (二)杂交 20.2ml/cm膜)，使膜与预杂交液充1 预杂交，将上部浸润的NC膜装入杂交袋，加入预杂交液( 分混匀，赶走汽泡，封口。65?,,,小时。 2 杂交，倾出预杂交液，加入杂交液(预杂交液，临用前变性的标记好探针，终浓度为1-2ng/ml) 20.2ml/cm膜)，65?过夜。 ( 3 洗膜，用洗涤液,，,分别洗膜两次，每次洗膜液体积不少于250ml。 4 封闭，将杂交好的NC膜用滤纸吸干，放入一新杂交袋中，用封闭液,,?封闭,,,小时(封 2闭液用量为,ml/50cm膜)。 5 反应，弃去封闭液，加入亲和素,碱性磷酸酶溶液，室温避光反应,,分钟，轻轻震荡。取 出膜，用洗涤液,，,分别洗涤三次，每次洗涤体积不应少于300ml，每次5分钟，振荡。 26 显色，将膜转入新袋中，加入底物溶液(用量为,ml/50cm膜)。封袋，避光放置，显色数分 钟至数小时，以杂交带清晰，背景低为好。 1.3讨论 1.在转膜(,)操作中每层间应确保无气泡存在。 2.操作中吸水纸的大小应小于顶层滤纸，且不能于滤纸下的任何一层接触。 3.烤片的作用在于使已转移条带更牢固地结合于NC膜上。 实验十八 DNA的测序技术 1.1实验原理 DNA序列测定技术是在DNA内切酶、合成酶的应用，基因克隆及亚克隆技术，高分辨率聚丙烯酰胺变性胶电泳技术等基础上建立起来的。它首先通过各种酶和克隆技术获得一组有相同起点端，而终点端在长度上相差一个核苷酸的DNA片断;然后通过凝胶电泳将相差一个核苷酸的DNA片断 - 18 - 群分开。最后通过放射自显影或化学方法显色DNA条带。 1.2实验操作 1.2.1 PCR (1)标记4个离心管，每管加入2ul的dNTP(含有ddNTP)。 (2)准备一个离心管加入5倍体积的缓冲液5ul、模板DNA(质粒)4ul、引物3.6ul再加水 3.4ul以及Taq酶1ul，混匀。 (3)从中分别吸取4ul，加入到4个离心管中，混匀。 (4)PCR反应:94?，5分钟、94?，45秒、67?，1分钟，60个循环 1.2.2 测序胶的制备 1.2.2.1 玻璃板的处理 (1)将长板用2M的NaOH浸泡1小时左右，然后与短板都用自来水冲洗，软布蘸取洗涤 剂将板清洗干净，自来水冲洗掉全部洗涤剂，再用无离子水冲洗三遍，自然室温晾干。 (2)用薄绵纸浸透反硅化液(1ml酒精、5ul冰醋酸、5ul粘合硅烷)。单向擦拭长板。 (3)用薄绵纸浸透硅化液，单向擦拭短板。 1.2.2.2 将两块玻璃板及夹条安装好，梳子反插。 1.2.2.3 制胶:6%变性胶20ml Acr:Bis 19:1 尿素 6.8M 1×TBE 4ml AP 160ul TEMED 20ul 1.3 电泳 (1) 向安装好的玻璃板之间倒灌胶，同时插入梳子。 (2) 待胶凝固后，将梳子拔下，注意拔梳子时不要挫坏胶面。 (3) 点样前将制备好的样品在90?下加热2分钟，并把样品点样孔冲洗一下。 (4) 加样、电泳，40V 3小时，直至指示剂跑到胶下面。 1.4 银染，照相保存结果。 1.3讨论 由于在硅化、反硅化处理后，长短板安装过程中短板接触反硅化液，年半均黏胶，胶片很难取下。本试验操作过程中必须佩戴一次性手套操作。 实验十九 外源基因的诱导表达 1.1实验原理 蛋白质是基因产物，在进行基因功能研究、转基因表达产物鉴定及利用工程菌株生产功能蛋白时都牵涉到外源基因产物的表达。目前基因产物的表达主要是将待表达基因构建到表达载体的特定 - 19 - 启动子下游的多克隆位点，然后将重组载体转化或转染受体材料，人工培养并诱导激活启动子，使外源基因产物得以表达。 本实验即通过非融合原核表达载体的利用，学习基因的诱导表达技术。 1.2实验材料 载体为Pet-5a(如图21,1)，菌株为BL21(DE3)，诱导剂为IPTG Amp EcroRIBamHINheImultiple cloning siteNdeIpET-5aT7 4134 bp 图21,1原核表达载体pET-5a 1.3实验步骤 1:重组载体构建同前面实验 2:诱导表达:提取带重组片断的质粒DNA转化BL21(DE3)受体菌(约3ml)37?活化过夜，转入新鲜培养基摇菌至对数生长期(约2,3小时)，加入IPTG至终浓度0.4mM(约5ul)，继续培养6小时 3:表达产物提取及鉴定 实验二十 表达产物的SDS,PAGE分离 1.1实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。调节单体的浓度比，形成 不同程度交链结构，其胶连度可在一个较广的范围内变化，适应不同大小分子的物质分离。在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和加速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递使丙酰 胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。此为化学催化，除此尚有发光催化，即利用核黄素与硫酸亚铁体系，在强光照下，诱发胶连。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率仅取决于分子量大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。十二烷基硫酸钠(SDS)具有这种电荷屏闭作用，蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。蛋白质的SDS-PAGE技术可以用来进行蛋白质的分离纯化、蛋白质纯度测定及分子量测定等方面的工作。 - 20 - 1.2实验操作 1.用样品缓冲液提取蛋白 2.制胶 a:装模具 b:制下层胶 胶浓度10% 12ml胶母液、16.6ml分离胶缓冲液、无离子水10.4 ml抽气后加入 10%SDS0.4ml、加入10,过硫酸胺400μl、20μlTEMED, 总体积40ml混合,倒入模具(高 度约为模具的,/,),上覆一层水或浓缩胶缓冲液. c:胶聚合后,弃胶上层未聚合液。配制浓缩胶，2.5ml胶母液，1,ml水，2.,ml浓缩胶缓 冲液，0.3 mlSDS,500μl过硫酸胺,2,μl TEMED,混合,倒于分离胶上面，并插入梳子。 3:电泳 a:将凝胶与电泳系统相连，用电极缓冲液清洗样品孔 b:点样,走电泳，直至溴酚蓝走至胶下沿。 4:停止电泳，卸板、切胶,一半胶(含柱样品)染色,脱色,制干胶,以研究纯度,分子量及菌体蛋白 组成。 另一半用于电转移及杂交实验。 1.3讨论 1. 但胶浓度过大过小，均不利于操作，浓度20,以上，胶柔性低，易裂;胶浓度过低，如低于7,， 则机械强度不过，此时可通过添加琼脂糖或采用薄胶(如测序胶、IEF等)等方法加以克服。 2. PAGE类型很多，从电泳槽种类分有垂直、水平及圆盘电泳等;从胶浓度来分有连续胶、不连 续胶、梯度胶等;从胶组成成分来分有SDS,PAGE、IEF等。 3. 当蛋白质中存在二硫键时，因局部高级结构存在，将影响蛋白质与SDS的结合及结合后的结构， 因此测定分子量不真实，为表观分子量。鉴于此在进行蛋白质分子量测定时，一定要在样品缓 冲液中加入巯基乙醇，除非实验目的是要通过对角线电泳研究蛋白质中的二硫键问题时，不加 巯基乙醇。 实验二十一 蛋白质的电转 1.1实验原理 硝酸纤维素膜(NC膜)作为蛋白质电转移的固相支持物，与蛋白质以非共价的疏水作用形式结合，结合能力约为,,μg/cm。NC膜具有不要预先活化，对转移物质生物活性影响不大，能应用多种染2 料染色，非特异性显色浅的特点，但对于转移的小分子蛋白质在洗涤过程中，易于丢失。 1.2实验操作 1.剪,块,MM滤纸和一块NC膜 2. 将剪好的,MM滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡3-5分钟 - 21 - 3. 按下列过程安装转移装置,将塑料支架平放在含转移缓冲液的托盘中,在塑料支架上放一块海 绵. 4.将3块,MM滤纸对齐放在海绵上,然后依次将NC膜、凝胶、及另,块虑纸和海绵放上。 5.用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，NC膜一侧向正极，凝胶一面向负极。 6. 接通电源电压120mA，转移6小时以上或过夜。 7.转移结束后，取出塑料支架,依次取掉各层,用铅笔在膜的上沿作好标记，切下其中一个孔所对 应膜的一半,用氨基黑或考马士亮兰染色,检查转移效果。 8. 将其余的NC膜放在一张干净的,MM滤纸上，室温干燥30-60分钟(可不做)。 1.3讨论 1. 滤纸及膜的大小不应大于待转移胶的大小，否则在转移过程中会发生短路，影响转移效果 2. 操作中应戴手套，切不可用手直接触摸，因手上的汗和分泌物将直接影响到蛋白从胶向膜 的转移。 3. 放置NC膜和滤纸时，每层之间不应有气泡，否则将影响转移效果4，待转移蛋白分子量决 定转移时间，分子量大，转移时间长，反之则小。5，干燥虽然可使蛋白质更牢固地结合到 膜上，但也可能加剧蛋白的质变性，影响其免疫反应活性。 实验二十二 Western-Blot检测 1.1实验原理 转移到NC等膜上的蛋白带用其它蛋白作为封闭液，将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭。加入与待检测目标靶蛋白有特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗将与目标蛋白结合，再经用洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，所以通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白,一抗,二抗的位置即将呈现一定的颜色。 1.2实验材料 封闭液(TBST，3,BSA) TBST(10mMTris-HCL,pH8.0,0.15mMNaCL, 0.05%Tween-20) 漂洗液 PBS (0.8%NaCL,0.02%KCL,0.144%Na2HPO4,0.024%KH2PO4 pH至7.4) 辣根过氧化物酶显色液(可用?或II) ? 取6mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 溶于9ml 100mM Tris-HCl(pH7.6) 中，加入1ml 0.3%(w/v)的NiCl2或CoCl2。过虑去除沉淀。取10μl 30%双氧水 与上液充分混匀 注意，此液必须新鲜配制。 II 取20mg,4-chlor-1-raphthol于20ml冷甲醇中，另取60μl30%双氧水，混匀。 注意，此液必须新鲜配制。 碱性磷酸酶显色液 5,NBT溶液 (溶于70,二甲基甲酰胺中) 66ul - 22 - 5,BCIP溶液(溶于100,二甲基甲酰胺中) 33ul 碱性磷酸酶缓冲液 100mMNaCL 5mMMgCL2 100mMTris-HCL(pH 9,5) 以上三者充分混匀，需要在30分钟内使用完 1.3实验操作 1.NC膜漂洗，NC膜用TBST缓冲液漂洗一次 2.NC膜的封闭 将上实验经电转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液(液面需盖过胶面)室温下轻轻遥 荡2-3小时。 3. 目标靶蛋白与第一抗体的反应 一抗的稀释: 将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定，但可参考下列数据: 1:100-1:5000 培养的杂交瘤细胞上清液，1:100 鼠腹水细胞1:1000-1:10000 4. 将封闭好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml一抗/cm，NC膜，赶尽塑料袋内2 所有气泡，封口机封口，,?下轻轻震荡,小时。 5. 洗膜。反应完毕后，将塑料袋剪开，弃去反应液，用PBS洗三次，每次10分钟。 6. 靶蛋白,一抗复合物与二抗反应 a:将膜从PBS溶液中转至TBST溶液中，室温下轻轻震荡,,分钟。 此操作是为了去除NC膜上的磷酸及叠氮钠 b:将二抗用二抗稀释液稀释，稀释度一般为1:200-1:2000。 c:将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0,1ml二抗溶液/cm2膜，封好塑料袋， 在室温下轻轻震荡,小时。 7. 剪开塑料袋，取出NC膜，在TBST溶液中冲洗1-5次，每次,,分钟。 8.显色 ，照相保存结果。 A:AP系统 a: 将膜放入碱性磷酸酶显色液(10ml碱性磷酸酶缓冲液，66ulNBT，33ulBCIP)中，室温下 轻轻摇动。 b: 待条带出现后(约显色20分钟)，将膜放入200ul0.5MEDTA(pH8.0)和50mlPBS溶液中 c: 照相，保存结果。 B:辣根过氧化物酶系统 a:将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动。 b:待条带出现后(约显色1,3分钟)，立刻用水洗膜，然后转入PBS中 c:照相，保存结果。 1.4讨论 1. Western印迹法检测蛋白的敏感性约为1-5ng，0.75mm厚的SDS-PAGE板的一个孔可上总蛋 白量约为100μg，所以只要被检蛋白不低于总蛋白量的万分之一，即可被检测出来。如果所分 析的样品为未知时，应同时作阳性对照。杂交技术主要有NC膜的封闭， 靶蛋白与第一抗体的 反应，结合靶蛋白的一抗与二抗的反应，显色等几部分构成。 2. NC膜与蛋白质的结合无任何特异性，因此作为特异性检测靶蛋白的探针,一抗蛋白也能与 NC膜结合，而一旦这种结合情况发生，当加入二抗后，背景上将出现许多非特异性条带,而则 势必造成目标蛋白的不可检测性。因此Western印迹技术的敏感性、可行性将取决于能否对NC 膜上一些蛋白质潜在结合位点进行有效封闭。在实际操作中这些结合位点一般用脱脂奶粉封闭， - 23 - 也可用血清白蛋白封闭。如果操作中加蛋白封闭后，非特异性背景仍很大的话，则可在封闭液中加入Tween20，Tween20的存在，能降低背景噪声，且不影响抗体与靶抗原的结合。 3. 在室温下，延长反应时间，可增加靶蛋白的可检出量，但也会增加非特异性结合，加大背 景噪声。 4. 显色带在阳光下几小时即褪色。 - 24 -