蚕丝蛋白溶液的聚集和构象变化的研究（可编辑）

蚕丝蛋白溶液的聚集和构象变化的研究（可编辑） 蚕丝蛋白溶液的聚集和构象变化的研究 山东大学 硕士学位论文 蚕丝蛋白溶液的聚集和构象变化研究 姓名:李扬 申请学位级别:硕士 专业:材料物理与化学 指导教师:陶绪堂;刘向阳 20080504 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 日 期:丝璺:兰 论文作者签名:压查翌 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 ，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 期: 论文作者签名:冷盟导师签名:闺锺圭日 山东大学硕士学位论文 中文摘要 蚕丝蛋白作为一种天然动物纤维，具有优良的综合力学性能，良好的生物相 容性和较低的生产成本，在纺织、国防、医药、食品和美容等诸多领域中具有较高 的应用价值和良好的前景。蚕丝的成丝机理和构象转变成为目前研究的重点。 本文首先研究了不同途径提取的丝素蛋白的完整性。采用凝胶电泳定性的表 征了再生丝素蛋白和丝腺丝素蛋白的水解情况。结果表明:第一，再生丝素蛋白在 提取过程中会发生部分水解，其水解程度随溶解温度的提高和溶解时间的延长而加 剧，并随溶剂体系的不同而变化。第二，中部丝腺的丝素蛋白没有发生水解现象， 只存在完整的重链和轻链，是研究蛋白质构象转变的良好基质，而从后部丝腺中提 取的蛋白含有较多的杂质。 本文通过圆二色谱、荧光光谱研究了再生丝素蛋白的溶液构象转变。圆二色 谱的结果表明，再生丝素蛋白发生了由无规线团向B(折叠的构象转变，其动力学 经历了两个不同速率的过程。色氨酸 Trp 残基的荧光发射谱发生蓝移，表明该 残基在构象转变过程中，有亲水的蛋白质表面转移到疏水的蛋白质内部，其峰强有 先减弱后增强的过程。 本文采用圆二色谱、荧光光谱和动态光散射研究了丝腺丝素溶液的构象转变和 聚集情况。圆二色光谱表明，丝腺丝素蛋白溶液也会发生从无规线团向B(折叠的 构象转变，随蛋白质浓度的增加，其构象转变速率加快。丝腺丝素蛋白的整个构象 转变过程可以分为三个阶段，诱导 induction 、增长 growth 和稳定 显的蓝移现象。不同的是，丝腺丝素蛋白的荧光峰强不存在一个先减弱后增强的过 程，较为均一。丝腺丝素蛋白的动态光散射结果表明，丝素蛋白的构象转变过程伴 随着蛋白质分子的聚集，其最终的聚集体尺寸为2微米左右。 关键词:丝素蛋白;构象转变;圆二色谱;荧光光谱;动态光散射。 山东大学硕士学位论文 Abstract mechanical andbio― Becauseofitsexcellent comprehensive properties natureanimal and onkindof fiber,has widelyapplications compatibilities，Silk,as thefieldsof andcosmetic in textile,defense，medicine， foodindustry(Its potentials inthescientific mechanismandconformationattract attentions formation change many 锄(e巩 silkfibroinextractedfromsolidsilk Thecurrentthesis the of integrity investigates the of molecular SDS― fiberandsilkworm measurement protein weightusing glandby silkfiber the ofsilkfibroinforsolid PAGE(Theresultsindicatethat process regeneration willresultin onthe partialdegradation,whichdepends extractedfromthemiddledivisionof and silkfibroin dissolvingagent(Furthermore，the Canbe division silkwormisintactandNo observed(The degradation posterior gland content,however,hasmanyimpurities( Dichroism Fluorescence Circular Spectrometer CD and silk tomonitortheconformationof beenused fibroin RSF in changeregenerated from a transition solution(CDresults thatRSF conformation aqueous suggest undergoes consiststwodifferentratesections(The randomcoilto transitionkinetics B-sheet(The indicatesthatamicro―environment blueshiftof change peek Tryptophan Trp emission transition( OcCBr theconformation during have conformationtransitionand GlandSilk Fibroin OSF solution aggregation thecombinationof and been CD，FS by DynamicLightScattering DLS ( investigated coilto astheCDandFSresultsof conformationfromrandom Similar RSF，the p― change be fromGSFsolution sheetandmicro-environmentof residuecarlobserved changeTrp transitionincrease( CDandFS(With the concentration，thespeed by increasingprotein 2 山东大学硕士学位论文 ThewholetransitionkineticsCallbedividedtothreeindividual sections:induction, and with conformation growth stabilization(Accompaniedprotein change;the has finalsize of moleculesbeen DLStoa of protein by 2心咀( aggregation proved Fibroin;conformation Keyword:Silk change;Circular Spectrum;DynamicLightScattering 3 山东大学硕士学位论文 第一章蚕丝蛋白的结构与性能 ?1(1蚕丝及其应用 蚕丝是由熟蚕结茧时分泌的丝液凝固而成的连续长纤维，也称“天然丝”。它与 羊毛一样，是人类最早利用的动物纤维之一，根据食物的不同，又分桑蚕、柞蚕、 木薯蚕、樟蚕、柳蚕和天蚕等。由单个蚕茧抽得的丝条称为茧丝，它由两根单纤维 借丝胶粘合包覆而成。缫丝时，把几个蚕茧的茧丝抽出，借丝胶粘合而成的丝条， 分别称为桑蚕丝 也称生丝 、柞蚕丝，统称蚕丝。除去丝胶的蚕丝，称精练丝。由 于桑蚕丝从栽桑养蚕至缫丝织绸的生产过程中未受到污染，因此是世界推崇的绿色 产品。又因其为蛋白质纤维，属多孔性物质，透气性好，吸湿性极佳，而被世人誉 为“纤维皇后”。蚕丝用于织制各种绸缎、针织品、工业、国防和医药用品，是重要 的纺织原料之一。中国、日本、印度、苏联和朝鲜是主要产丝国，总产量占世界产 丝量的90,以上。中国自1969年蚕茧产量跃居世界首位以来，1978年生丝产量也 居世界首位。1980年中国生丝产量达2万吨以上[1】。 桑蚕丝不仅是丝绸织造最主要的原料，而且还可用于制成人造血管。蚕丝与人 体的角质和胶原同为蛋白质，结构十分相近，因此，具有极好的人体生物相容性。 桑蚕丝人造血管在体内不会引起过敏或致癌作用，还可以与活体血肉相连，长成与 真血管一样的外壁和内膜。 桑蚕丝还可开发成许多高科技副产品。将桑蚕丝脱胶、溶解、透析提纯后，可 制成纯净的丝素溶液，再将丝素溶液置于塑料模具中，经烘干制成薄膜，最后再经 辐射消毒形成“丝素膜”。该膜专门用于烧伤创面，有助于创面愈合，也称为“人工 皮肤”。 丝素蛋白的多孔性结晶粉末与皮肤存在良好的附着能力，又具有良好的吸湿性 和抗紫外线性，可用作化妆品的基材。丝素蛋白是大分予聚肽，它水解时产生的氨 基酸和低聚物能被皮肤吸收，可作为一种高效的营养化妆品添加剂，并且丝素蛋白 4 山东大学硕士学位论文 降解得到的低聚肽与毛发有良好的相容性，能在毛发表面形成结晶性保护膜，可制 成增加营养，滋润秀发的洗发水[2】。目前，化妆品市场上已经可以找到SunsilL SilkPro等品牌的含丝素蛋白的化妆品，市场前景良好。 桑蚕丝还可以制成蚕丝蛋白供人们食用。这种技术是由日本人首先开发的。最 初经试验的这种冻胶的丝素分子还是由数千个氨基酸连接成的较大分子组成，不易 被肠壁吸收。因此采用能分解蛋白的放线菌酶，进一步分解成低聚肽和氨基酸粉 末，吸收率可大大提高。如今，在日本市场上已有加入了经裂解的蚕丝粉末的食 品，如蛋糕、饼干、面条、果冻、冰淇淋、饮料、片剂和糖果等，受到了消费者的 欢迎。此类食品含有18种氨基酸，脂肪、碳水化合物等含量较少，因而被视为一 种健康的绿色食品[3】。 此外，与桑蚕丝结构类似的令外一种天然动物丝――蜘蛛 丝，因其高断裂强 度，高塑性，高断裂吸收能的优异综合力学性能而备受瞩目，被誉为“生物钢”， 在国防军工等领域有广泛的应用前景。然而，蜘蛛本身具有难于饲养，产丝量少的 缺点，限制了其工业化的应用。目前，人们正尝试采用基因工程的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，利用细 菌，植物或者山羊作为主体生产蜘蛛丝蛋白，进而制备纤维。尽管如此，基因工程 的方法仍然存在着成本高，操作复杂及产量有限的缺点。 与蜘蛛丝相比，桑蚕丝生产简单，产量大，成本低廉。通过特定的处理工艺改 性，其性能提高的潜力很大。近年来，许多科学家正努力尝试采用各种方法提高蚕 丝的综合力学性能，其优越的性能和低廉的成本使得这种新兴的材料具有极为广泛 的应用前景。 5 山东大学硕士学位论文 表1(1蚕丝与几种典型的生物纤维的力学性能比划41 rrL-clmniall ComparisOaofprol鬻rtiesofo【’mmtmsilks silkwormand ofb,omatefial6k“andli鲻u雌?mIno矗Iy spiderdralgtine to瓣veraltypes ?dtoda Material at Authors ljrS MPa’M xlulus GPa 。‘Stratabreak 最”“，打?lk w。scrtcin# 砌J S12 19 cl Pcrcz??Rig?lroal【b8I 最用n盯_lkmjl’sc―dn广 610690 1517 416 ct 羚???RIgaetrna1( 681 B删??，nqlk‘ 740 lll 20 ’unmff“al f13l 器75972 ll 13 17lS 【‘m?uffd Spl出r、dP i11(【13l n97(4 0?lX舡 046 2468 l'Injn Collagtalo aI(1聃l X(1ink。d7 Col"lagm 47让 n 08 1216 Hn nal l伪l PL^‘ 鉴妁 1(2, 30 2 6 andKohn F(ngdherg 170l lemon 150 1(5 12 Goslln clal l?呷6捌ofmai吣eolhgen 17ll 8011e lb0 ? 3 Goshncc,al 171l Kc、'lar 49tiber 舢抑 l如 2(7 Goslmeet a1(【7Il symhetlcRubber 鲫 OIlOI 850 Goslinccl a1(171l ?1(2家蚕的生活史与蚕丝的形成 1(2(1家蚕的生活史 个世代中，历经卵、幼虫、蛹、成虫4个发育阶段 图1(1 。家蚕只在幼虫期摄 食桑叶，经四次蜕皮发育至五龄蚕。五龄蚕的体重可比刚孵化的一龄蚕增加一万多 倍。在五龄末期，蚕停止食桑，通体变为半透明，开始吐丝结茧。结茧过程约需 2,3日，之后便会化蛹【51。 6 山东大学硕士学位论文 怨怠 图1―1家蚕的生活史‘5】 图1-2家蚕的丝腺构造和纺丝示意副6】 7 山东大学硕士学位论文 1(2(2丝腺的解剖学构造和功能 蚕的丝腺是一对位于家蚕幼虫身体两侧的管状器官。每一条独立的管状丝腺可 以被分为三个相连的部分:后部丝腺，中部丝腺和前部丝腺 图1(2 位置。每一 部分具有不同的生理学构造和功能。丝素和丝胶蛋白是由丝腺表皮的六角形上皮细 胞分泌而成。同时，丝腺还具有储存丝蛋白的功能【6】。 l„22 1后部丝腺 后部丝腺位于蚕体身体后端，呈细长，卷曲状。蚕丝蛋白的主要成分一丝 素蛋白是在后部丝腺合成并分泌的。后部丝腺的DNA分子合成非 常活跃。丝素分 子是由一大一小两个亚单元构成的。因此，两种不同类性mRNA被分别转录，并 输送到丝腺细胞的粗面内质网中，从而指导丝素蛋白的合成。蚕丝蛋白的合成和蚕 的吐丝行为都是在激素的控制下进行的。咽侧体分泌的脑激素进入循环系统并刺激 前胸腺分泌蜕化类固醇。这种类固醇在丝素分子的合成和储存时具有重要的作用， 当此类固醇的含量达到最高值时，蚕丝蛋白的合成也达到最高水平[7]。分泌的丝 素蛋白沿着后部丝腺向前移动，到达中部丝腺。 1(2(2(2中部丝腺 中部丝腺的形状较后部丝腺有明显的变化，变的更粗，并 且有明显的两个近 180度的转弯。中部丝腺的主用功能有两点:一是作为丝素蛋白的储存场所;二是 分泌第二种蚕丝蛋白――丝胶蛋白。丝胶在此合成并分泌到中部丝腺的管道中，包 裹在丝素蛋白之外，形成一层包覆层。 12(2(3前部丝腺和纺丝管 丝素和丝胶蛋白一起经由中部丝腺继续向丝腺前端移动，从而到达细长的前部 丝腺。前部丝腺越靠近纺丝管的一端越细，从而迫使丝素蛋白发牛剪切流动，使得 8 山东大学硕士学位论文 报道了在家蚕和蜘蛛的丝腺内部，靠近纺丝管处的蚕丝蛋白具有液晶态结构。一对 丝腺的内容物在纺丝口处汇合，在家蚕的头胸摆动和纺丝管的挤出作用下，一起经 由纺丝管挤出，遇到空气凝固，从而形成具有两根单纤维 丝素 ，并由丝胶包覆 的茧丝。 ?1(3丝素蛋白的结构 蚕丝作为一种天然大分子材料，具有优良的综合力学性能和生物相容性。从材料科 学的角度来讲，材料的宏观力学性能是由其微观结构 决定 郑伟家庭教育讲座全集个人独资股东决定成立安全领导小组关于成立临时党支部关于注销分公司决定 的。近几十年来，科学家 为了揭示蚕丝，以及与其类似的天然蛋白丝的结构与性能的关系，对于动物丝，尤 其是桑蚕丝和蜘蛛丝做了深入的研究，得到了许多系统性的结 论。在蚕丝的两种蛋 白组分中，丝素蛋白是提供力学性能的主要组分，也是科学研究 的重点领域。表1( 1(2家蚕蚕丝蛋白的氢基酸细成 【13】 TableIV(1(Aminoacid o B-mortsilk in oftotalaminoacids composition proteinspercentage chymotrypsin cp precipitate;C"chymouTpsinsoluble 【7J7 Wholefibroin fraction Sericin CD C，fraction 29(3 32。89 22(16 5(2 A alanlne 1(3 0(56 3，87 14(6 acid D《aspattic 0(5 0(18 1(29 2(8 R al’ginine 0(2 0(00 0(OO 0(3 C Q-sttne ;haIf 1(0 0(43 2(58 7(9 E glutamlcacid 44(5 48(00 36(85 13(5 G《g冬'cine 0(2 0(06 0(50 1(0 H histi塌he 0(7 0(13 1(80 0(6 I 1soleucine 0(5 0(00 1(29 0(8 L kucine 0(3 0(20 0(77 4(3 K 1ystne 0(1 0(00 0(00 0(1 M methionine 0(6 0(13 1(54 0(5 F phenylalanlne O(3 0。00 1(03 0(5 P proline 12(1 14(97 6(96 33(1 S serine 0(9 O(36 2-32 8(3 T threonine 0(2 0(00 O(oo 0(3 W《tLTptophan 5(2 1(40 10(80 3(1 Y Wrosine 2(2 0(64 5(67 3(1 V valine 9 山东大学硕士学位论文 1(3(1丝素蛋白的化学组成及氨基酸序列 丝素蛋白中一共包含18种氨基酸 表1-2 ，其中较为简单的甘氨酸 G; 丝素分子的氨基酸序列。用酶处理丝素的水溶液得到沉淀Cp和溶液Cs。进一步的 2，Y为酪氨酸 Y;Tyr ，而较大的氨基酸大部分都存在于Cs片段中。 Z 8―-―――――-―-―― j-―――――――――――,,――((:::::: --((((((((((((((((一 I兰(o m兰m型m l绷 一―_未ll写::::亏―_一lIl黼I『::J 二器I nu攀拦斟 漫，_I-l―l嘲l删一l C’ 榭蝴番蝴缨黧苎篓s譬蝥翌唆 鼍!蝴缀榭螂谢瓣蝴瓣瓣l貔 槲辩磊僻 瀚僦簖钎秽泓 蝴蝴嬲黼磊菇赫叛 错彻蝴馘熟笆魁垡 蝴。粥 蝴榭槲勰瓣黼 鼢秽榭职磊TC,k 图1(3蚕丝蛋白的氨基酸序列，R代表重复单元【‘7】 从氨基酸序列来看，含有亲水性侧链的氨基酸大都分布在丝素蛋白链的两端 [rrj。在丝素蛋白的中部，具有疏水侧链和亲水侧链的氨基酸较为均匀地相间分 布(，94,的氨基酸一级序列由高度重复的 GIy-X，X A，S 组成 图1(3 。 丝素蛋白的分子量测定因测定方法的不同而略有差异。通过超离心的方法测定 的结果为400kDa，通过沉淀分析的方法侧得的结果为370kDa，而通过光散射测定 的结果为435kDatl8】。这种不同方法导致测定所得的平均分子量的不同，一方面是 由于测定的原理不同，另一方面是可能是由于不同的实验方法导 致蛋白分子的聚集 有所不同。目前为止人们还难以精确的测定丝素蛋白质的分子量。但是，通过电泳 和基因测序的结果来分析，研究者较为接受的结果是400kDa，其中较大的亚单元 为350kDa，较小的亚单元26kDa，P25为30kDa[19】。 10 山东大学硕士学位论文 与其他蛋白质一样，丝素蛋白中除了包括C、H、O、N四种主要元素以外， 还含有其他多种元素，这些元素与丝素蛋白的性能以及蚕吐丝的机理有直接的关 系。目前的研究表明，丝素蛋白中含有K、Ca、Cu等多种元素，这些元素与丝素 蛋白之间的关系也是近年来研究的重点【20‘221，如Ca，cu等二价离子，被认为在丝 素蛋白的聚集过程中，起着非常重要的作用。 1(3(2天然丝的聚集态结构 蚕丝纤维的聚集态结构与其他天然蛋白纤维及人造纤维有很大的相似性，约 55,结晶态的13(折叠分散在无定型的基体中，整个分子链沿纤维长轴方向取向。 这种微小晶区分散在连续的非晶区中并且沿纤维方向高度取向的结构是蚕丝纤维优 良力学性能的主要原因。 图l-4蚕丝的多级结构示意图【231 山东大学硕士学位论文 b 晶区和非晶区‘24J 图1-5蚕丝蛋白的结构 a 反平行B一折叠晶体; I和Silk 大量的X(射线衍射的结果表明，丝素蛋白主要以两种晶形存在，Silk 等人以及Lots[13】等人用X(射线衍射研究了天然蚕丝中的晶体结构。他们的研究结 果表明，天然蚕丝中的晶体主要是以Silk II为正交晶系 II为主。他们认为Silk 胞中只存在以Gly，础a和Ser残基构成的反平行13(折叠结构。 较大的氨基酸残基 如Tyr和Leu等都存在于无定形基质中。虽然他们的模型能解释部分实验结果，但 也存在许多缺点。近年来，许多学者又基于X(射线衍射【27捌，核磁共振【29剖】等方 法对SilkII进行了进一步的研究和修正。 对于蚕丝的另外一种结晶形态――SilkI，通常只存在于成丝前的丝腺蛋白浓 溶液中，在成丝的过程中会转变为更为稳定的SilkII结构。多年来，人们对于Silk I的存在及其结构产生了浓厚的兴趣，因为这一结构是研究纺丝机理的关键。尽管 如此，由于其结构不稳定，容易转变成为更稳定的SnkII，很难得到完善的晶体， 人们对于其结构的了解还不多。人们曾经提出过数个模型来解释SilkI结构，包括 12 山东大学硕士学位论文 型，以及Fosseyt341提出的片层模型，但这些模型都不能完全解释所有的实验现 象。最近，Asakura等人的研究结果表明，SilkI似乎是以一种第二类13转角 13一 turn II 的结构存在【351。 type e t I_――?& 图1-6Asakura等人提出的SilkI晶体模型【351 此外，Valluzzi[3?8】等人发现并报道了一种存在与空气和水界面丝素蛋白LB 膜中，不同于SilkI和SilkII的结构，并称之为Silkm。基于投射电镜及单晶电子 衍射的结果，他们认为这是一种左手32螺旋结构的三方晶系的结晶。由于这种结 构的高度不稳定性，并未引起人们的广泛关注。 13 山东大学硕士学位论文 图1(7 SilldII的分子模型。( a 俯视图; b 侧视刚371 14 山东大学硕士学位论文 1(3(3丝素蛋白的溶液态构象 蛋白质的构象主要可分为三种:无规线团、Q(螺旋 Q(helix 和B(折叠 B(sheet ，其中B(折叠构象又可分为平行B一折叠和反平行B一折叠两种构象 图 1(8 ，丝蛋白中多种构象在一定条件下可以相-瓦转化。反平行B(折叠构象由于分 子链段间的组装最好，能量处于最低状态，因此也最稳定。在特定的外界条件下， 如温度、湿度、浓度、pH值的变化、溶剂处理、溶解作用、金属离子作用及剪切 应力作用等，丝素蛋白会发生由无规线团向B(折叠的构象转变。即使不存在任何 外部作用下，丝素蛋白也会由无规线团向能量最低的B(折叠构象转变。 ‘a’‘4bent’’1I_bonds c，《《阳N 《桃linearH_bonds N搦蹲c 图1(8平行 a 与反平行 b B(折叠 15 山东大学硕士学位论文 1(3(3(1丝素蛋白的稀溶液构象 在丝素蛋白的再生过程中，会以稀溶液的形式存在。Canetti,39]等人在1989 年就应用圆二色光谱 CircularDichroism;CD 研究了丝素蛋白分子在稀溶液下的 构象及其变化。他们的研究表明，在纯水溶剂中，丝素蛋白主要是以无规线团构象 存在的。当在丝素蛋白纯水溶液中加入不同比例的不良溶剂甲醇时，丝素蛋白的溶 液态构象发生明显的变化，丝素蛋白的二级结构由无规线团向beta折叠转变。 邵正中【柏】等人将已经形成beta折叠的丝素溶液做为“种子"，加入到无规线 团构象的丝素溶液中，也观察到类似的构象转变。同时，他们还对比了有无“种 子’’的情况下，丝素溶液的构象转变速率。他们的结论表明，在有“种子’’存在的 情况下，丝素蛋白的从无规线团到beta折叠的构象转变速率有明显的提高。因 此，他们提出再生丝素蛋白溶液的构象转变具有晶体生长的“成核――生长’’动力 学机制。 陈新【41】等人采用时间分辨红外光谱研究再生丝素蛋白在重水中的构象转变， 他们的研究结果也表明，丝素蛋白从无规线团到B(折叠的构象转变具有三个不同 外源探针，采用荧光发射光谱，荧光淬灭谱研究了再生丝素溶液 在水溶液中的构象 转变。他们的研究结果表明，丝素蛋白在由无规线团向B(折叠转变的过程中，其 Trp和Tyr残基的化学环境会发生变化。Tyr残基会发生由亲水环境向疏水环境的 转移。 1(33(2丝素蛋白的浓溶液构象 丝索蛋白在丝腺中的构象及其在成丝过程中的构象转变对于揭示蚕丝的成丝机 理具有重要的指导意义。由于丝腺中蛋白质浓度很高，在体外极不稳定，并且目前 人们还无法在体外配制具有相同浓度的稳定溶液，使得这一领域的研究受到很大的 限制。 16 山东大学硕士学位论文 Michel P6zolet[44]等人采用拉曼光谱研究了家蚕和蜘蛛丝腺蛋白的构象，并探 讨了不用拉伸比率的作用下，丝腺蛋白的构象变化。他们的研究表明，在丝腺内部 丝素蛋白主要以Q(螺旋 33士2, 的构象存在，在拉伸作用下Q(螺旋会向13(折叠 374-2, 转变，并且这种拉伸转变要在拉伸比率为4倍以上才会出现。与天然蚕 丝相比，拉伸丝腺内容物所得的B(折叠要少的多，并且取向较差。据此，他们认 为在蚕的纺丝过程中，应变并不是构象转化的唯一驱动力。 蚕丝蛋白是一种生物大分子，它的浓溶液具有与合成高分子浓溶液或熔体相类 似的粘弹性性质，因此，家蚕和蜘蛛腺体纺丝液的流变学性质对于研究其成丝机理 以及人工纺丝都有重要的意义。Holland[45]等人采用流变仪对家蚕和蜘蛛腺体内的 纺丝液的流变学性质进行了详细的研究。他们的研究表明，家蚕和蜘蛛的纺丝液与 高分子熔体具有相类似的粘弹性性质，为采用高分子的理论来解释说明天然动物丝 的成丝机理提够了依据。 Asakura[46。481等人采用13C核磁共振谱研究了家蚕丝素蛋白溶液的构象和链段 动力学。根据Ala的羰基振动峰 C--O，C。和C。 ，他们发现家蚕丝素蛋白与 Samia Cynthia硪砌f相比没有C1(螺旋的构象。此外，他们发现随着蛋白浓度的增 加，丝素蛋白开始以SnkI的形式存在。 Ayub[49】等人发现，丝素凝胶是由于丝素蛋白在水溶液中形成SilkII结构而形 成的，这种转变受溶液的pH值影响明显。pH为3(叫(0之间时，蛋白溶液能够在 两天内成胶，但是当pH小于1(5或大于13时则没有凝胶形成。这种酸化成胶的现 象与Vollrath[50】等人报道的结果相符。 蚕采用的是液晶而不是各向同性溶液来存储蛋白和纺丝。蛋 白质胶状物中分子 以液晶状态存在，也使丝素蛋白能够保持在高浓度而不致形成B(折叠沉淀。液晶 纺丝有许多优势【511:首先，从纺丝模 die ee产生后，它本质上不用进行非受控的分 子重新取向:其次，纺丝所需要的力很小;最后，在未成丝的蛋白质胶状物中所进 行的分子预排列可能会减少缺陷的形成。通过小心地控制液晶纺丝溶液的溶剂 纯 水 饱和度，动物可以大大降低纺丝所需要的代谢成本。不仅仅是成本低，实际上 能量需求也与纺丝管的直径无关。当向列液晶纺丝液流经逐渐变细的纺丝器时，其 17 山东大学硕士学位论文 剪切有助于进一步降低纺丝所需要的代谢能量【521。从溶致型液晶溶液 即液晶聚合 物分子和溶剂分子的混合物 中纺丝可以使分子链具有高度的轴向排列。好的分子 排列无疑对于材料的力学性能来说是很重要的。由此可见，丝素蛋白在进入前部腺 体之前己为最后顺利地形成高度取向的固态纤维作好了一切准备。对丝素蛋白来 说，向列型液晶态在中部腺体的形成无疑是从无规线团的液态到高度取向的固态这 个转变过程中极为关键的一环。 2 ' ? ? 拿 至 O 220 2?O 嗍ELENGTHInm’ 图1-8丝素蛋白在甲醇作用下的构象变化。丝素溶液浓度为 O(Img,rnL，1-(6对应的甲醇含量分 别为O,，15,，17,，20,，50,和90, [39】 18 山东大学硕士学位论文 -- 1 皇皇昌_―――?―皇詈詈鼍置???詈暑暑量詈E皇-――_――?|??量量暑皇盲皇詈暑詈皇-- 。 I|皇―――――量??鼻―?鼍暑墨量――置―置―――――?――――?_ 6 4 2 O 之 一lOEp,,o西o?(o 4 o一。】 七 200 210 220 230 240 250 190 wavelength nm 图1-9丝素蛋白溶液在没有“13(折叠种子”的情况下的 圆二色谱随时间的变化图【删 6 ，_、 o 4 2 O E弓鼍。西。p,(oS巨 2 1? 200 210 220 230 240 250 wavel ength nm 图1(10丝素蛋白溶液含有20,。9(折叠种子”的情况下的圆二色谱随时间的变化图‘柏】 19 山东大学硕士学位论文 ?1(4本论文研究的主要内容和意义: 天然蚕丝因其优良的综合力学性能和良好的生物相容性而引起人们的广泛关 注，在轻纺，医药，食品，国防等许多领域都有广泛的应用前景。虽然人们已经对 蚕丝的组成、结构等做了大量的研究，但仍存在很多不足，尤其是对于蚕丝形成的 机理及其过程中的构象变化研究还不够完善。 丝素蛋白在丝腺中以高浓度的液晶状胶体存在，迄今为止，人们还不能在蚕体 外模拟出这一状态，给试验带来很大困难。人们通常从蚕丝提取丝素蛋白，形成再 生丝素蛋白溶液的方法研究丝素蛋白的构象转变。然而，丝素蛋白在提取的过程中 会发生部分水解，所得溶液实际上是一种丝素蛋白和其水解多肽的混合物。为了解 决这一问题，有研究者采用基因工程的方法，通过细菌等宿主分泌并提纯出转基因 丝素蛋白，这种蛋白的纯度较高，体系均一，但目前人们还不能利用转基因的方法 得到完整的丝素蛋白，所得到的都是与丝素蛋白类似的分子量较小的“类丝素蛋 白”。本论文的目的在于研究不同途径得到的丝素蛋白溶液的构象转变及其聚集情 况，并进行比较，尝试模拟并研究蚕丝蛋白溶液的构象转变情况。 本论文首先研究了再生丝素蛋白和丝腺丝素蛋白的提取方法，比较了不同溶 剂、温度、溶解时间等对于再生丝素蛋白的影响，比较了丝腺不 同部位丝素蛋白的 组成，采用凝胶电泳的方法对各种不同条件下所得的丝素蛋白溶液的分解情况做了 定性的分析。然后，采用圆二色谱，荧光光谱和动态光散射等非破坏性的光学测试 手段分别对再生丝素蛋白和丝腺丝素蛋白在水溶液中的构象转变及聚集情况做了系 统的研究。这对于揭示蛋白质的构象转变和聚集机理，蚕丝的成丝机理和指导人工 纺丝都具有重要的意义。 山东大学硕士学位论文 第二章丝素蛋白水溶液的制备方法 蚕丝的成丝过程同时也是其蛋白质分子的构象由无规线团向B(折叠转变的过 程(研究蚕丝的形成机理，实际上也就是研究在生理学条件下蚕丝蛋白的构象转 变。在研究这一构象转变的过程中，丝素蛋白溶液的制备方法具有十分重要的地 位。 再生丝素溶液是制备人造再生丝，生物相容性材料，如人造皮肤，生物多孔材 料等的起始原料。再生丝素溶液中的蛋白质浓度，分子量以及构象和聚集等因素在 很大程度上影响到最终产品的质量。因此，研究蚕丝蛋白的“再生”过程，获得高 质量，高浓度的再生丝素溶液也是近年来研究的热点。 ?2(1再生丝素水溶液的制备与表征 2(1(1丝素蛋白的再生 蚕丝蛋白由两种蛋白质组成:丝素和丝胶。丝素是蚕丝力学性能的主要提供 者，而丝胶则通过粘性将两根丝素纤维粘合在一起形成蚕丝。在纺丝工业中，收购 的蚕茧要在高温下处理 110? 杀死蚕蛹，进而通过高温热水煮茧，并将多个蚕 茧丝抱合在一起，通过缫丝机制成工业生丝。虽然丝胶在纺丝工业和生物材料中具 有一定的应用，但是应用不广泛。因此，在蚕丝处理的过程开始前，通常用热的碱 水肥皂溶液煮茧，去除丝胶。这个过程成为脱胶，得到丝称为精炼丝。在脱胶过程 中，蚕丝的质量损失约为22-一25,。 为了从蚕丝中提取丝素蛋白，也就是所谓的“再生"过程。精炼丝需要在特定 的溶剂体系中打断晶区B(折叠中的氢键。通常采用的溶剂体系有两种，一种是含 有锂盐的水溶液，比如9(3M的溴化锂水溶液t53巧5】或9M的硫氰酸锂溶液【56,57]。另 外一种则是中性的盐,水,醇溶液体系，如硝酸钙甲醇水溶液[5s,591，或者氯化钙乙醇 水溶液[60,611。这些溶液体系可以打断丝素蛋白分子之间的键合作用，从而溶解丝素 21 山东大学硕士学位论文 蛋白。之后，这些用来溶解丝素蛋白的盐溶液还需要通过透析过程除掉盐，从而得 到再生丝素水溶液。 Tsubouchi等人【62】用凝胶电泳研究了在不同脱丝胶条件以及溶解条件下得到的 再生丝素蛋白的分子量。他们的研究表明，在脱丝胶的过程中，不同的脱丝胶溶 剂，温度以及脱丝胶的时间都会对丝素蛋白分子产生影响。例如，肥皂水，碳酸氢 钠溶液和蛋白酶相比，8M尿素溶液更为温和，对丝素蛋白的损害较小。在较低的 脱胶温度下，丝胶不易去除干净，而温度过高则会使得丝素蛋白分解加剧。延长脱 胶的时间也会对丝素蛋白产生影响，促使丝素分解。他们认为8M尿素溶液，在 80?下脱胶0(5小时是最佳的脱胶条件。同时，他们的电泳结 果说明，与采用钙 盐、醇类和水三元溶剂相比，硫氰酸锂溶剂更为温和，能够在室 温条件下溶解丝 素，所得的丝素蛋白分解程度较小。本节的目的在于测定不同溶 解条件下得到丝素 蛋白的分解情况，并找到最佳的溶解条件。 2(1(2材料与试剂 材料与试剂名称 供应商 纯度 ACSGrade 碳酸氢钠 Na。CO。 关东化学株式会社 Sanland――ChemInternationalInc Grade 尿素 Urea Biology ACSGrade 溴化锂 LiBr Sigma―’Aldrich ACSGrade 硫氰酸锂 LiSCN Sigma―‘Aldrich Merck ACSGrade 氯化钠 NaCl Merck 氯化钙 CaCI ACSGrade 氯化钾 KCl ACSGrade Sigma―’Aldrich 三甲醇氨基甲烷 Tris BioRad ACSGrade ACSGrade 磷酸二氢钾 KH。PO。 Sigma――Aldrich ACSGrade 磷酸氢二钠 Na。HPO。 Sigma―’Aldrich 6000-8000 透析袋 Spectra,Por 山东大学硕士学位论文 2(1(3再生丝素蛋白质溶液的制备 1 生丝的脱胶: 以9M的尿素溶液或l,肥皂,0(5,碳酸钠溶液分别作为脱胶溶剂。将桑蚕生丝 在80"C的9M尿素溶液中，在强烈的机械搅拌作用下脱胶30分钟;或在95?的碳 酸钠肥皂溶液中脱胶95分钟。将脱胶后的蚕丝，用大量的去离子水冲洗干净，并 在室温下干燥2天。 2 脱胶蚕丝的溶解: 以9M硫氰酸锂或9(3M溴化锂溶液作为溶剂。将脱胶丝加入到9M硫氰酸锂 溶液中，在室温下搅拌至完全溶解，制成1,W,v的丝素蛋白盐溶液。或者，将脱 胶丝加入到9(3M溴化锂溶液中，分别在室温 20? 、40?、60?和80?下搅拌 至完全溶解，制成1,W,v的丝素溶液。 3 透析: 将配制好的丝素蛋白盐溶液倒入透析袋中 截留分子量6000至8000 ，用去 u 离子水透析，每12小时换水一次，直至透析袋外溶液的电导率小于2S。将透析 好的溶液以8000rpm的转速离心半小时以去除沉淀，留下清液。 2(1A再生丝素蛋白质溶液的浓度测定――紫外吸收 丝素蛋白溶液的浓度采用紫外吸收来测定。根据 Beer-Lambert定律，对于丝 c,1,。 素蛋白，其紫外吸收与溶液的浓度成线性关系:A276rim 11(3 将2(3节所得的溶液稀释10倍移入10x10cm石英样品池中，紫外吸收谱在 50 Bio紫外可见分光光度计上测量，扫描范围 200--400rim，扫描速率 Cary 600nm,min( 山东大学硕士学位论文 3(0 2(5 2(0 ‘疗 是1(5 1(0 0(5 0(0 200 250 300 350 Wavelen(clh nm 图2(1再生丝素蛋白水溶液的紫外吸收谱 2(1(5再生丝素蛋白质溶液分子量测定――蛋白质电泳 2(1(5(1蛋白质电泳 SDS(PAGE 凝胶电泳是用于分离不同物理性质 如大小、形状、等电点等 的分子的一种 有效方法。通常，琼脂糖凝胶电泳被用于DNA的分离，而聚丙烯酰胺凝胶电泳则 用于蛋白质的分离。本节所采用的是用十二烷基硫酸钠 Sodium sulfate, dodecyl SDS (聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量。 带净电荷的蛋白质分子在电场的作用下会发生迁移。迁移的速率 v 取决于 电场强度 E ，蛋白质的净电荷 z 和摩擦系数 f : y Ez,f 24 山东大学硕士学位论文 摩擦系数是移动分子与介质之间的阻力，它取决于迁移分子的分子量，分子的 形状以及介质的粘度。因此，蛋白质分子在凝胶中的迁移速率与蛋白质所带电荷， 分子量以及蛋白质的构象相关。 SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水 键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，每 克蛋白质一般结合1(4克SDS。SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质一SDS复合物均带 上相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质问原有的 电荷差异。在水溶液中，蛋白质一SDS复合物具有相同的构象，近似雪茄烟形的长 椭圆棒 短轴均为1(8nm，长轴则随蛋白质的分子量成正比变化 ，克服了蛋白质 问原有的形状差异。这样蛋白质一SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受原有电荷和 形状的影响，而只是蛋白质分子量的 函 关于工期滞后的函关于工程严重滞后的函关于工程进度滞后的回复函关于征求同志党风廉政意见的函关于征求廉洁自律情况的复函 数。 2(1(5(2再生丝素蛋白质溶液的分子量测定 由图2(2为分别以硫氰酸锂和溴化锂为溶剂得到再生丝素蛋白的电泳结果。在 以溴化锂为溶剂，50?下溶解得到的再生丝素蛋白溶液中，除了可以得到丝素蛋白 Chain 27kDa的两条 的两个亚单元:重链 HeavyChain 370kDa和轻链 Light 色带之外，还有多条分子量介于100--350kDa的色带。这说明由碳酸氢钠肥皂溶 液脱胶，溴化锂为溶剂得到的丝素蛋白有部分分解，分解得到的多肽链分子量介于 100---350kDa之间。而在以硫氰酸锂为溶剂得到的丝素蛋白中也发生了类似的分 解。据文献报道【6l】，采用硫氰酸锂做溶剂，其对于蚕丝蛋白的损害较小 与盐,醇, 水体系相比 。我们的实验结果表明，硫氰酸锂作为溶剂仍然会使得蛋白质发生部 分水解，但与溴化锂不同，硫氰酸锂溶液可以在室温下直接溶解丝素蛋白，这对于 实验操作和减少对蛋白的损害都是相当有利的。 由于硫氰酸锂和溴化锂溶液对丝素的溶解能力不同，前者可以在室温下溶解丝 素，而后者通常需要加热。因此，在研究不同溶剂体系对于丝素蛋白的影响时，温 度也是一个重要的因素。我们研究了以9(3M溴化锂为溶剂，在室温至80?下溶解 丝素对于丝素蛋白的影响。 25 生查查兰堡圭兰!!丝圣 LiSCN L-Br 。小。。小。 嘲 图2-2以硫氰酸锂和溴化锂为溶剂的再生丝素蛋白的凝腔电泳结栗。 山东大学硕士学位论文 , 。一 , ‘o 鲁 :多 一 LadderGSF 40? 60?80? 20?，6h20?。24h 一。鬟鬻黛?。蠛 ”j’ 囊? 。鼍骥 霸蟠 2、臻 ?t j毫:蔓 嘲m――一笺”黔移‘登?警二懑，燃黪锄阁赣努嬲嘲懒? ‘” j’- 。? ?二嚣l嚣 獭嘲 黪 ”鬟鬻羹黧 鲞麓。盔;盖。。。。;磊二主:;:l窿盆蔷:_((;誓。鎏潼量翻甍数 。盘溢-。。。。磊i盆二鎏警盆?。。盘。盆誊l垂澄 ?。囊一 图2-3不同溶解温度下提取的再生丝素蛋白溶液的凝胶电泳照片 山东大学硕士学位论文 图2(3是在不同溶解温度下得到的再生丝素蛋白的电泳照片。在选用相同的脱 丝胶溶剂和丝素溶剂条件下，溶解的温度越高，电泳照片中的多肽色带就越多，且 色带宽度越宽，说明丝素的分解越严重。这一结果可以从化学平衡的角度来解释， 蛋白质在溶液中的水解是一个平衡反应，升高温度会使得反应平衡发生移动，温度 越高，水解的速率越快，程度也越高。 由于溴化锂的溶解能力没有硫氰酸锂强，在室温条件下，溴化锂溶液需要较长 的时间溶解丝素，我们考察了溶解时间的长短对于丝素蛋白的影响。图2(1中有两 条标注为20?的图谱，左边图谱为溶解时间为6小时，右边图谱溶解时间为24小 时。溶解24小时所得的丝素蛋白电泳结果中有明显的多肽分子色带，说明增加丝 素蛋白的溶解时间会增加蛋白的水解。 ?2(2丝腺丝素蛋白溶液的制备和表征 2(2。1丝腺丝素蛋白溶液的制备 将成熟的五龄蚕用二氧化碳气体麻醉并置于解剖盘中，向解 剖盘中加入适量的 NaCl，1(3mM Tris，用盐酸调节 KCl，1(8mMCaCl2，0(05M Ringer溶液[631 128mM 至pH 6(2 ，以解剖剪从蚕背部剪开，将蚕体在解剖盘内展开，轻轻拉去消化 管，用镊子小心移出在腹面两侧的白色半透明的屈曲管状丝腺。将丝腺移入盛有 pH 6(6磷酸盐缓冲溶液的培养皿中静置lO分钟。用一对镊子小心的剔除丝腺的表 皮层。将丝腺的内容物转移到盛有去离子水的培养皿中，用去离子水反复清洗包覆 在外层的丝胶。将经过清洗的胶状丝素小心的移入试管中，加入 去离子水静置24 小时。大部分丝素分子会溶解到水中，形成丝素蛋白溶液。 2(2(2丝腺丝素蛋白溶液的表征 用2(1(4节的方法测定丝素蛋白质的浓度，并按照2(1(5节的方法用凝胶电泳进 行分子量测试。 28 山东大学硕士学位论文 在丝腺的三个部分中，前部丝腺的内容物由于浓度高，难以重新溶解到去离子 水中形成溶液，因此，我们重点研究了后部丝腺和中部丝腺的蛋白。由