毛细管电泳法

毛细管电泳法 毛 细 管 电 泳 法 电泳(electrophoresis)是电解质中带电粒子在电场作用下想电荷相反方向迁移的现象，利用种现象对物质进行分离分析的方法，称之为电泳法。电泳已有近百年历史，在生物和生物化学发展中 、β-和γ-球蛋白，由于他们的有重要的意义，Tiselins等用电泳法从人血清中分离出清蛋白、α- 杰出贡献，1948年荣获诺贝尔化学奖。经典电泳最大的局限性在于难以克服由高电压引起的电解质的自解，称为焦耳热(Joule heating)，这种影响随电场强度的增大而迅速加剧，因此限制了高压电的应用。毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)是在散热效率很高的毛细管内进行的电泳，可以应用高压电，极大地改善了分离效果。 毛细管电泳的开创性工作一般认为是在1981年，Jorgenson和Lukacs使用内径75µm的毛细管柱，分离丹酰化氨基酸，获得了40万/米理论塔板数的高柱效，充分展现了细内经毛细管电泳的巨大潜力。他们还从理论上证明，毛细管电泳柱效与电场强度成正比，与分子扩散系数成反比，这样意味着外加高电压可以获高柱效，而且分离扩散系数小的分子，如生物大分子可以更有效。随着1988年商品仪器的迅速推出，毛细管电泳开始突飞猛进的发展。近年来又建立了芯片式毛细管电泳(Chip capillary electrophoresis;CCE)和阵列毛细管电泳(capillary array electrophoresis;CAE)。芯片式毛细管电泳利用刻制在载玻片上的毛细通道进行电泳，可以在秒级时间内完成上百的样品的同时分析。阵列式毛细管芯片有多条电泳通道，如Mathies实验室理由具有96条放射状分布的阵列毛细管芯片在25min内完成了四色M13 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 DNA的测序工作。此外，还实现了样品预处理及柱后衍生化芯片式毛细管电泳。毛细管电泳对单细胞成分的分析、对疾病的早期诊断和特定药物的研究开发都具有重大的意义。 第一节 毛 细 管 电 泳 的 特 点 和 分 类 一 、电 泳 与 色 谱 毛细管电泳和色谱都是一种分离分析方法，但二者的原理不同，两者比较见下。 1.分离原理 电泳是指带电粒子在一定介质中因电场作用而发生定向运动，因粒子所带的电荷数、形状、离解度等不同，有不同的迁移速度而分离。色谱是不同组分在两相(固定相和流动相)中的分配系数的不同而分离。但毛细管电泳的一些分离模式也包含了色谱的分离机制。 2.分离过程 电泳和色谱的分离过成都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述，如色谱中所用的一些名词概念和基本理论，如保留值、塔板理论和速率理论等均可借用于毛细管电泳中。 3.仪器 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 色谱与电泳的仪器，都包括进洋部分、分离柱。检测器和数据处理等部分。 二、毛 细 管 电 泳 的 特 点 毛细管电泳和高效液相色谱一样，同是液相分离技术，它们可以互为补充，但无论从效率、速 56-1度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势。毛细管电泳柱效更高，可达10~10m，故也称为高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis;HPCE)，分离速度更快，几十秒至几十分钟内即可完成一个式样的分析;溶剂和试样的消耗极少，试样用量仅为纳升级;毛细管电泳没有高压泵输液，因此仪器成本更低;通过改变操作模式和缓冲溶液的成分，毛细管电泳有很大的选择性，可以对性质不同的各种分离对象进行有效的分离。毛细管电泳的特点可以概括为“高效、低耗、快速、应用广泛”。 三、毛 细 管 电 泳 的 分 类 按毛细管中填充物质的性状可分为自由溶液和非自有溶液毛细管电泳;按机制可分为电泳型、色谱型和电泳/色谱型三类。常用于药物分析的毛细管电泳的分离模式详见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 21-1 表21-1毛细管电泳主要分离模式 名称 缩写 管内填充物 说明 pH缓冲的自由电解质溶液，可含属自由溶液电泳型，但可通毛细管区带电泳 CZE 有一定功能的添加剂过加添加剂引入色谱机制 胶束电动毛细管色谱MECC CZE 载体+带电荷的胶束 CEZ扩展的色谱型 由缓冲液、不溶于水的有机液体微乳液电动毛细管色谱MEECC CEZ扩展的色谱型 和乳化剂构成的微乳液 属非自由溶液电泳，含有毛细管凝胶电泳 CGE 各种电泳用凝胶或其他筛分介质 “分子筛”效应 按等电点分离，属电泳型，毛细管等电聚焦 CIEF建立 pH梯度的两性电解质 要求完全抑制电渗流 毛细管电色谱CEC CEC载体+液相色谱固定相 属非自由溶液色谱型 非水毛细管电泳 NACE 含电解质的非水体系 属自由溶液电泳型 第二节 毛 细 管 电 泳 理 论 一、电泳和电泳淌度 电泳是在电场作用下带电粒子在缓冲溶液中的定向移动，这种移动速度uep由下式决定: uep,,ep,E (21?1) 式中E为电场强度， µep为电泳淌度(mobility)，即溶质在给定缓冲溶液中中和单位场强下单位时间内移动的距离，即单位场强下的电泳速度(µep/E)。下标ep表示电泳(electrophoresis)。 在空心毛细管中一个粒子的淌度可近似表示为: ,, i,ep , ,, (21?2) 4 式中ε和,分别为介质的介电常数和粘度。δ是粒子的Zeta电势，这是电荷粒子形成的类似i 双电层结构，再剪切平面，即在荷电粒子有效半径所构成的面存在的Zeta电势，其大小和粒子表面 2/3Z/M的电荷密度有关，近似地正比与，其中M是摩尔质量，Z是净电荷，即表面电荷越大，质量越小，Zeta电势越大，因此离子可按它们的表面电荷密度的差别，一不同的速率在电介质中移动，而实现分离。这就是在自由溶液区带电泳中不同粒子的分离基础。 在实际溶液中，离子活度系数、溶质分子的离解度程度均对粒子的淌度有影响，这时的淌度称为有效淌度，用µef表示: efiiep,,,,,,i (21?3) ,i式中为样品分子的第i级离解度，为活度系数或其他平衡离解度。 iα 由上而见，荷电粒子在电场中的迁移速度，除与电场强度和介质特性有关外，还与粒子的离解度、电荷数及其大小形状有关。 二、电 渗 和 电 渗 率 电渗是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。电渗的产生和双点层有关，由于用作毛吸管材料的石英的等电点约为1.5左右，因此在常用缓冲溶液pH(pH>2)下，管壁带负电，即石英毛细管内壁覆盖一层硅醇基阴离子，并吸引溶液中的阳离子，由此在毛细管内壁形成表面带阴离子的双点层。双点层中处于扩散层的阳离子，在负电荷表面形成一个圆筒形的阳离子塞流，在外加电场作用下，朝向阴极方向运动，如图21-2。由于这些阳离子是溶剂化的，当它们沿剪切面作相对运动时，携带着溶剂一齐向阴极迁移，形成电渗流(electroosmotic flow;EOF)。在开管柱条件下，毛细管内电渗流为平头塞状，即流速在管截面方向上不变。电渗流速度u以下式表示: os ,,os,u,E,Eosos , (21?4) 式中µ为电渗率(或电渗淌度)，δos 为管壁的Zeta电势，下标os表示电渗。 os 在多数水溶液中，石英和玻璃毛细管表面因硅醇基离解会产生负电荷，许多有机材料如聚四氟乙烯，聚苯乙烯等也会因为残留的羧基而产生负电荷，其结果是产生指向负极的电渗。因此，在通常的毛细管区带电泳条件下，电渗流从阳极流向阴极，其大小受电场强度、Zeta电势、双电层厚度和介质粘度的影响。一般，Zeta电势越大，双电层越薄，粘度越小，电渗流值越大。在一般情况下，电渗流的速度是电泳速度的5~7倍。 三、表 观 淌 度 和 权 均 淌 度 在毛细管电泳中，同时存在着电泳流和电渗流，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内的运动速度应当是两种速度的矢量和， 即: uap,uef，uos,(,ef，,os)E (21?5) 或 ,ap,,ep，,os (21?6) u为表观迁移速度，µ称为表观淌度(apparent mobility)。当把试样从正极端注入到毛细管apap 内时，不同符号的离子将按表21-2的速度向负极迁移。分离后出峰的次序是:正离子>中性分子>负离子。中性分子都与电渗流速度相同，不能相互分离。 表21-2 在电泳中的组分迁移速度 组分 表观淌度 表观迁移速度 正离子 u+u efosµ+µ efos 中性离子 u osµ os 负离子 uu os-efµµ efos- 在毛细管内一旦灌入缓冲溶液，就可能形成固-液界面，这就有了向分配的基础条件。如果在毛细管中引入另一相，如胶束、高分子团等准固定相或色谱固定相等，称为P相，则试样就会有机会在溶液相与P相之间进行分配。这样，当试样组分在电迁移过程中会发生相间分配，其迁移速度或淌度将发生变化。因此，引入另一平衡的粒子迁移速度和淌度，称之为加权平均速度和加权平均淌度，简称为权均速度和权均淌度，以符号u和µ表示。设相分配过程远快于电泳过程，则有: kp,np/ns (21?7) u11 ,,p,p,,， ppE1，k1，k (21?8) 式中k为容量因子，n和n分别为试样在P相和溶剂中的分子数，µ为P相的表观淌度。ppps 注意，P相在电场中可静止，也可迁移，运动方向可正、可负。引入P相后，可以使中性组分产生不同的权均淌度，因而解决中性组分在毛细管电泳中的分离问题。 四、分 离 效 率 和 谱 带 展 宽 (一)理论塔板数和塔板高度 由于毛细管电泳在功能和结果显示形式上，与色谱技术颇为相似，因此，在不少讨论中引入与色谱相似的处理和表达方法，特别是直接沿用了色谱的塔板高度H和理论塔板数n的概念，用以表示柱效。 2n,5.54(tm/W)1/2 (21?9) tm为流出曲线最高点对应的时间，称为迁移时间(migration time)。因为毛细管电泳中，在理想情况下粒子和管壁之间的相互作用可以忽略，因此可以认为没有离子保留下来，所以用迁移时间代替色谱中的保留时间。另外，对于柱上检测的毛细管电泳来说，记录器上显示峰顶时，组分尚未流出，因此在毛细管电泳的塔板高度为: H,Ld/n (21?10) Ld为进样口到检测器的距离。理论塔板数和塔板高度用来评价色谱峰的展宽，衡量整个毛细管电泳系统性能的优劣。但塔板理论是以分配平衡为基础的色谱理论概念，这种分离理论的基础和电泳所涉及的被分离物质的电荷、质量及形状等有着本质的差别，因此，在毛细管电泳中引入理论塔板数的概念主要是为了寻求一种对分离效率评价的通用方法。 (二)谱带展宽 在毛细管电泳中，影响谱带展宽的原因主要有两类:?来源于柱内溶液和溶质本身，其中特别是自热、扩散和吸附;?来源于系统，如进样和检测。下面对第一类来源进行讨论，第二类的影响将在一起部分讨论。 1.流型 毛细管电泳中的电渗是流体相对于带点管壁移动的一种现象，是由离表面很近的一层过剩的正离子层引起，这就如在毛细管内形成一个带电的外壳，包围着流体内核，在管子两端加了电场后，带电的外壳带动管子内的其余流体以相同的速度向负极移动。在内径很小的毛细管内，整个流体会像一个塞子一样以均匀的速度向前运动，使整个流型呈扁平型。呈扁平型的柱效的重要原因。但如果毛细管直径太大，如大于200~300µm，或者内部的自然热过大，则这种流型可能会被破坏。与之相应的压力驱动系统，如HPLC中的泵驱动，液体和固体表面接触处的摩擦力会导致压力降低，从而是流线呈抛物线型，或称层流。靠近管壁出，其速度趋近于零，而中心出的速度则是平均速度的2倍，两种流型的示意图如图21-3。 由于在毛细管电泳中无固定相，因此速率方程中不存在传质项，而且流型又是扁平的，于是只有纵向扩散项: H,2D/u (21?11) n,Ld,/2D (21?13) 由式(21?5)和式(21?6)得: n,,apELd/2D (21?13) 由上式可知，理论塔板数与电场强度成正比，电场强度越大，柱效越高这是因为溶质在较高的电压下，以较快的速度通过柱子，纵向扩散小。理论塔板数还与溶质的扩散系数成反比，扩散系数越小的分子柱效越高，因为分子越大，扩散系数越小。所以毛细管电泳特别适合分离生物大分子。 2.自热 电流通过缓冲溶液时产生焦耳热(或称为自热)，在普通电泳中这种自热已成为实现快速、高效的重大障碍。对毛细管电泳而言，管内径是影响自热的一个重要因素。Knox等人指出，如果毛细管的直径能满足下述方程，那么自热就不会引起太严重的谱带展宽和效率损失，此方称为: 1/3EdC，1500 (21?14) 式中E是电场强度(KV/m)，C是介质浓度(mol/L)，d为管内径(µm)，在E=50KV/m，C=0.01mol/L的条件下，求得d值小于140µm。实验结果较此值还小一些，因此目前采用的多是内径25µm~75µm的毛细管。事实上，毛细管电泳之所以能实现快速高效，很大程度上就是由于采用了极细的毛细管。若使用更细的的柱子，则会在检测、进样等方面带来一系列困难，极易造成柱的堵塞。 电泳中的自热影响柱效的原理:由于焦耳热通过管壁向周围环境扩散时，在毛细管内形成径向温度梯度，如内半径为50µm的毛细管，轴心与管壁之间的温差为1.39?，内半径为100µm时，则为5.58?。温度径向梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度，因而产生离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏了区带的扁平流轮廓，导致区带展宽，塔板高度增加。 毛细管温度差大小取决于管内径、壁厚、聚酰亚胺外涂成的厚度，以及从中心到壁管的传热系数。因此管内径以小为宜，外径则越大越好，实际上常用内径50µm，外径达375µm的毛细管。同时也可降低缓冲液浓度来降低焦耳热。另外对仪器来说，可采用冷却温控方法来减少焦耳热。 3.扩散与吸附 前面一叙述，在毛细管电泳中，一般情况下，溶质纵向扩散是谱带展宽的唯一因素，从式(21?11)和(17?37)可得: 2,,2DLd/u,2Dtm (21?15) 2,从上式可看出扩散引起的谱带方差()，由溶质的扩散系数和迁移时间两项决定。迁移时间受许多分离参数影响，如外加电压、毛细管长度、操作缓冲溶液浓度等。扩散系数是溶质本身的一 种物理特性，它随分子量的增加而降低。 在毛细管电泳中吸附一般是指毛细管壁对于被分离物质粒子的作用。要考虑到管壁表面活性中心的位置以及活性大小，不同溶质分子之间或者溶质分子与溶剂分子之间对管壁活性中心的竞争吸附等因素对溶质吸附的影响。造成管内壁表面吸附的主要原因有两个:?阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用。?疏水作用。毛细管内表面积和体积之比越大，吸附的可能性也越大，因此，细内径的毛细管不利于降低吸附。 五、分 离 度 分离度是指将淌度相近的组分分开的能力，毛细管电泳仍然沿用色谱分离的R的公式来衡量两组分分离度: 2(mm)mmt2,t1t2,t1 R,, 124,W，W (21?16) 式中下标1和2分别代表相邻两个物质，W为以时间表示的峰宽。分离度也可以表示为柱效的函数: n,u R,, 4u (21?17) (,ap，,os),apu,uu这里为两相相邻组分的相对速度差。用或代替将式(21?13)和式(21??15)代入(其中E=V/L)，得: 1/2，，1VLdR,,,ef,,DL(,ef，,os)42，， (21?18) 上式表明，R是下列四个因素的函数:?外加电压V;?有效柱长与总长度之比(Ld/L);?电 ,os,,ef泳有效淌度差();?电渗淌度()。 第三节 毛 细 管 电 泳 的 主 要 分 离 模 式 一、毛 细 管 区 带 电 泳 毛细管区带电泳(Capillary Zone Electroporesis ;CZE)也称为毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管电泳最基本也是应用最广的一种操作模式，通常把它看成其他各种操作模式的母体。在上述关于毛细管电泳的理论讨论中，一般都以区带电泳作为对象进行阐述。在CZE中，主要选择的操作条件是电压、缓冲溶液以及其pH和浓度、添加剂等。下面分别叙述这些条件。 1. 操作电压 分离体系的最佳外加电压值与毛细管内径和长度及缓冲溶液浓度(离子强度)有关。一般，在柱长确定时，随操作电压的增加，电渗流和电泳流速度的绝对值都会增加，迁移时间缩短，尽管电泳流速的增加视粒子所带的电荷而异，但由于电渗流速度一般远大于电泳流速度，因此表现为粒子的总迁移速度加快。在升高电压的同时，将使柱内的焦耳热增加，缓冲液的粘度减小，而粘度和温度的关系是指数型的，因此使操作电压和迁移时间的关系不呈线性，表现为电压高时速度增加更快一些。 关于电压和柱效的关系，前面已有详细的讨论，即在一定范围内柱效随电压的升高而升高，过了极点后，随着电压的升高，焦耳热的影响加剧，柱效反而下降，而极点的具体位置视系统和组分 而异。 2 . 缓冲液的种类 缓冲溶液的选择直接影响力子的迁移和分离，还影响进样过程，特别是采用电进样方法时更是如此。缓冲溶液的选择通常考虑下述几点: ?在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量。?在检测波长的吸收低。?自身的淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生。?为了实现有效进样和有合适的电泳淌度，缓冲溶液的pH至少必须比被分析物质的等电点(PI)高或低1个pH单位，例如，pH 8.5的缓冲溶液可以用来分析等电点低于7.5或高于9.5的蛋白质。?只要条件允许就尽可能采用酸性溶液，在低pH下，吸附和电渗流值都很小，毛细管涂层的寿命较长。 除此之外，要特别强调的是在配制毛细管电泳用的缓冲溶液时，必须使用高纯蒸馏水和试剂，用0.45µm的滤器滤过以除去颗粒等。常用于CE的缓冲溶液有硼砂、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和醋酸盐等。一些生物学上的理想缓冲溶液(表21-3)也特别有用，因为它们的离子质量都很大，可采用高浓度而不产生大电流。 表 21-3 HPLC中的生物缓冲液 名称 pKa 名称 pKa 2-[N-吗啉]-乙烷磺酸(MES) 6.13 甘氨酰胺 8.20 N-[2-乙酰氨基]-2-亚氨基二乙 三(羟甲基)氨基甲烷( TRIS) 8.30 6.60酸(ADA) ,,-双[2-羟乙基]甘氨酸N,N8.35 6.80 哌嗪-N,N-双[乙烷磺酸](PIPES) (BICINE) 3-[N-吗啉]-丙烷磺酸(MOPSO) 6.90 硼酸盐 9.24 2-[双-(2-羟乙基)]氨基磺酸 2-[N-环己氨基 ]乙烷磺酸(CHES) 9.55 7.16(BES) ,3-[环己氨基]-1-丙烷-磺酸N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸7.55 10.40 (CAPS) (HEPES) ，N-2-羟乙基哌嗪-N-2-丙烷磺酸7.90 (HEPPS) 3.缓冲溶液的pH 对于两性电解质来说，它的表观电荷数受到缓冲溶液的影响，在不同的pH下有不同的电荷，因此有不同的质荷比及电荷密度，给迁移带来很大的影响。在缓冲溶液的pH低于溶质的pI值时，溶质带正电，朝阴极泳动，和电渗同向，粒子迁移的总速度较电渗还快，若缓冲溶液的pH高于溶液的pI值，情况则恰恰相反。 除影响溶质的电荷外，pH的改变还会引起电渗的相应变化。在高pH下，电渗很大，溶质的流出次序依次为阳离子，中性分子和阴离子。这中性分子之间无法分离，因为净电荷数为零。对阴离子而言，则有两种情况，电泳淌度的绝对值小于电渗太大又往往会使溶质在分离前即被流出。在这种情况下，需要增加柱长或者降低电渗流 4.缓冲溶液的浓度 缓冲溶液浓度增加，使离子强度增加，能减少溶质和管壁之间、被分离组分之间(如蛋白质-DNA)的相互作用，从而改善分离。 在大多数情况下，随着缓冲溶液浓度的增加，电渗率降低，溶质的迁移率下降，因此迁移时间延长。随着浓度的增加，导电的离子数增加，在相同的电场强度下毛细管的电流值增大，焦耳热增加。 缓冲溶液的浓度对柱效的影响比较复杂，因为要同时顾及扩散和粘度的影响。一般，对于迁移时间较短的组分，其柱效随浓度的增加而明显提高，而对于后出峰的各组分则无明显的相关性。 二、胶 束 电 动 毛 细 管 色 谱 胶束电动色谱(micellar electrokinetic chromatography;MEKC)是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合。因在毛细管中进行，故又称为胶束电动毛细管色谱(Micellar electrokinetic capillary chromatography;MECC)。MECC是在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束(假固定相)，溶质不仅可以由于淌度差异而分离，同时又可基于在水相和胶束相之间的分配系数同而得到分离，这样毛细管区带电泳中不能分离的中性化合物，在MECC中可以分离。 1. 胶束假固定相 胶束是表面活性剂的聚集体，表面活性分子由亲水和疏水基组成，疏水部分是直链或支链烷烃，或甾族骨架;亲水部分则较多样，可以是阳离子、阴离子、两性离子的基团。常用的阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰-N-甲基牛磺酸钠(LMT)、牛磺脱氧胆酸钠(STDC)等。阳离子表面活性剂最常用的是季铵盐，如十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等。阳离子表面活性剂分子易吸附在石英毛细管壁上，常可使电渗流转向或减慢电渗流速度，称之为EOF改性剂。表面活性剂在低浓度时，以分子形态分散在水溶液中，当浓度超过某一最小值，分子缔合形成胶束。表面活性剂开始聚集形成胶束时的浓度，称为临界胶束浓度(CMC)。CMC一般小于20mmol/L。胶束有多个分子缔合而成，组成一个胶束的分子数叫做聚集数(n)。典型的胶束由40~140个分子组成，如SDS为62，DTAB为56。 2. 基本原理 MECC比起CZE来说，增加了带电的离子胶束这一相，是不固定在柱中的载体(假固定相)，它具有与周围介质不同的淌度，并且可以与溶质互相作用。另一相是导电的水溶液相，是分离载体的溶剂。在电场作用下，水相溶液EOF驱动流向阴极，离子胶束依其电荷不同，移向阳极或阴极。对于常用的SDS胶束，因其表面带负电荷，泳动方向与EOF相反，朝阳极方向泳动。在多数情况下，EOF速度大于胶束电泳速度，所以胶束的实际移动方向和EOF相同，都向阴极移动(图21-6)。中性溶质在水相中随电渗流移动，进入胶束中则随胶束泳动，基于其与胶束作用的强弱，在两相间的分配系数不同而得到分离。 3. 流动相 在MECC中可以通过改变流动相来调节选择性。溶质在胶束相和流动相之间进行分配，因此改变缓冲溶液体系将会对溶质分配系数，进而对容量因子和迁移产生影响。流动相的改变通常包括缓冲溶液种类、成分。pH和离子强度的改变，也可通过添加有机改性剂来实现。 pH能影响电动色谱中带电组分迁移的速度，也影响电渗速度，但是不改变SDS的荷电状况，因此不影响它的泳流速度。 三、毛 细 管 凝 胶 电 泳 毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis;CGE)综合了毛细管电泳和平板凝胶电泳的优点，成为分离度极高的一种电泳分离技术。 在CGE中，毛细管内充有凝胶或其他筛分介质，这些介质在结构上类似于分子筛。流经凝胶的物质，原则上按照分子的大小分离。应用最多的介质是交联和非交联聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide gel; PAG)。交联PAG是由丙烯酰胺单体与甲撑双丙烯酰胺作交联剂聚合而成，非交联(线性)PAG在无交联剂存在下聚合而成。除PAG外，琼脂糖、甲基纤维素和它的衍生物，以及葡聚糖、聚乙二醇等也被用作CE分离介质。线性聚丙烯酰胺、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇等属于非胶筛分介质，它们是一些亲水线性或枝状高分子。这些物质溶解于水，当浓度大到一定值时会形成动态网络。将不同聚合度的聚乙烯醇进行组合，能够构建出适合于DNA测序用的介质。结合使用SDS，利用不同浓度的纤维素组合，可以进行蛋白质分子量的测定。 由于受凝胶介质对pH的限制，CGE缓冲溶液的可选择性小于CZE。当使用非胶筛分介质时，缓冲溶液的选择和CZE没有差别。 四、毛 细 管 电 色 谱 毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC)是在毛细管电泳技术的不断发展和液相色谱理论的日益完善的基础上逐步兴起的。它包含了电泳和色谱两种机制，溶质根据它们在流动相和固定相中的分配系数不同和自身电泳淌度差异得以分离。CEC结合了CE的高效和HPLC的高选择性，开辟了微分离技术的新途径。 CEC可以视为是CZC中的空管被色谱固定相涂布或填充的结果，也可以看成是微色谱中的机械泵被“电渗泵”所取代的结果。毛细管电色谱的介质选择首先是固定相的选择，其次才是流动相或缓冲溶液的选择。根据固定相的特征(正相、反相等)、缓冲液也可以是水溶液或有机溶液。固定相的选择主要依据HPLC的理论和经验。目前反相毛细管电色谱研究最多，毛细管填充长度，一般为20cm，填料为C18或C8*，3µm粒径，用乙腈-水或甲醇-水等为流动相。还可改变流动线的组成比例、导电大小、pH、散热能力、背景吸收等来改善分离。 在填充柱电色谱柱中，柱的填充是一项关键性技术，迄今报道的填充方法有3种，拉制法、压力法和电填充法。电填充法利用电泳力进行填充，效果好。目前已有很多商品柱供选择。气泡产生是导致CEC分离失败的最常见原因。气泡一般出现在塞子与填料交界处，由于两侧电渗淌度 不同，易形成气泡。气泡的存在增大电阻，使分离电流减小，最终中断分离。如果发生这种情况，就必须用高压缓冲液重新重新冲洗柱子。 五、非 水 毛 细 管 电 泳 非水毛细管电泳(non-aqueous capillary electrophoresis;NACE)是在有机溶剂为主要的非水体系中进行的毛细管电泳。在非水毛细管电泳中，增加了在CE的可优化参数，如介质的极性、介电常数等，使在水中难溶而不能用CE分离的对象能在有机溶剂中有较高的溶解度而实现分离。与水体系相比，非水体系可承受更高的操作电压产生的高电场，因而会有更高的分离效率，也可在不增大焦耳热相比的条件下提高溶液中的离子浓度，或增大毛细管内径，从而可增加进样量。 作为NACE介质的有机溶剂，最好不易燃烧、挥发和氧化，并应具有良好的溶解性。非水溶剂的介电常数和粘度对分离选择和分离效率的影响最为显著。甲醇、乙腈、甲酰胺、四氢呋喃、N-甲基甲酰胺等是NACE中最常用的有机溶剂。 在有机溶剂中加入电解质使之具有一定的导电性是实现NACE的必要条件。与经典毛细管电泳相同，在NACE中也常需要加入一些电解质以调节介质的pH和分离选择性。大多数电解质在有机溶剂中的溶解度较低，这限制了电解质的选择范围。酸及其铵盐是最常用的电解质，如醋酸铵、甲酸等，这类挥发性电解质不适合于毛细管电泳与质谱联用。 第四节 毛 细 管 电 泳 仪 毛细管电泳仪的基本结构包括高压电源、进样、填灌/清洗、毛细管及其温度控制、检测、记录/数据处理等部分，如图21-1所示。 一、高 压 电 源 高压电源包括电源、电极、电极槽等。高压电源一般采用(0~?30)KV连续可调的直流高压电源，电压输出精度应高于1%。电极通常由直径0.5~1mm的铂丝制成，在许多情况下。可以用注射针头代替铂丝。电极槽通常是带螺帽的小玻璃瓶或塑料瓶(1~5ml不等)，要便于密封。 在仪器 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 和操作过程中，必须注意高压的安全保护问题。商品仪器通常有自锁控制，在漏电、放电。突发高电流或高电压等危险情况下，高压电源会自动关闭。高压容易放电，尤其是在湿度高 的地方。防止高压放电的方法包括:干燥、隔离或适当降低分离电压。 二、毛 细 管 柱 理想的毛细管柱应是化学和电惰性的，可以透过紫外光和可见光，有一定的韧性，易于弯曲，耐用而且便宜。毛细管柱的材料可以是聚四氟乙烯、玻璃和石英等。其中，聚四氟乙烯可以透过紫外光，不用另开窗口，它有电渗，但很弱，主要缺点是很难得到内径均匀的管子，对样品有吸附，热传导性差。玻璃电渗最强，但有杂质。目前采用的毛细管柱的材料主要是石英。石英表面的金属杂质极少，也很少存在路易斯点，不会对溶质产生非氢键吸附。表面有硅醇基，这种硅醇基是构成氢键吸附并使毛细管内产生电渗流的主要原因。 目前石英毛细管内径一般在25~75µm之间，有报道使用5µm和2µm柱做细胞质的直接分析。细柱子能减少电流，减少自热，但内径的变小使吸附严重，同时又会造成进样、检测和清洗等技术上的困难。 在理想条件下，如果电场强度保持恒定，则理论塔板数随着柱长的增加而增加，但为了保持电场强度的恒定，在增加柱长的同时还必须提高操作电压。一般认为，管长70cm是个阈值。区带电泳的常用长度在30cm左右，凝胶柱要短得多。 对于从未用过的未涂渍柱，使用前宜用5~15倍柱体积1mol/LNaOH，5~15倍柱体积的水及3~5倍柱体积的运行缓冲溶液依次冲洗(已涂渍毛细管应按供应厂家的要求处理)，然后再用运行的缓冲溶液平衡。当改变缓冲溶液时，也需要冲洗和平衡毛细管，特别是当其中有一种是磷酸盐缓冲溶液平衡。更宜如此。这样可以使毛细管有足够的时间和所使用的缓冲溶液建立平衡，没有完全平衡的管柱，难以取得重现的结果。 三、进 样 毛细管电泳采用无死体积的进样方法，这就是让毛细管直接与样品接触，然后由重力、电场力或其他动力来驱动样品流入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。目前进样方法有下述3种: 1. 电动进样 当把毛细管的进样端插入试样溶液并加上电场E时，组分就会因电迁移和电渗作 Co用而进入管内。设毛细管的横截面积为S，半径为r，试样的浓度为，迁移速度为 uap,uef，uos,(,ef，,os)EQvQin,，那么在时间内试样进入毛细管的体积和进样量便是: 2Qin,CoQv,CoS,(ef，,os)E,,Co,r(,ef，,os)E, (21?19) 上述表明，电动进样的控制参数是电场强度E和进样时间*，其中E是进样动力，取样多在 ,1~10KV/60cm之间;是进样时间，取值通常在1~10s之间，有时可达1min或更大。 电动进样对毛细管内的填充介质没有特别限制，可实现完全自动化操作，也是商品仪器必备的进样方式。不过电动进样对离子组分存在进样偏向，即*大者多进，小者少进或不进，这会降低分析的准确性和可靠性。另外，基质变化也会引起导电性和进样量的变化，影响进样的重现性。 2. 压力进样 压力进样也叫流动进样，它要求毛细管中的填充介质具有流动性。当将毛细管的两端置于不同的环境中时，管中溶液即能流动相，将样品带入。设毛细管的长度为L、两端的压力 ,,P差为、管中溶液的粘度为，则有: 2CSroQ,(,P),in 8L, (21?20) ,,,P显然，和是控制参数，其中是进样动力，可用3种方法产生:正压、负压(管尾抽 ,吸)或重力(虹吸)，取值一般在?3 450Pa附近。的取值在1~5s之间，有时可超过60s。利用压缩空气如钢瓶气可以实现正压进样，并能和毛细管清洗系统共用，多为商品仪器采用。利用重力进行虹吸进样时，因*正比与毛细管进、出口的液面落差*，所以进样量也可由*控制: ,P,,g,H (21?20) 式中*为缓冲溶液的密度，*为重力加速度。*的取值通常在5~20cm之间，多数取10cm，对应的*多在5~10s间取值。 压力进样没有组分偏向问题，进样量几乎与试样基质无关，但选择性差，组分及基质都同时被引进管中，对后续分离可能产生影响。 3. 扩散进样 利用浓度差扩散原理同样可以将试样分子引入毛细管。当将毛细管插入一试样溶液时，组分分子因在管口界面存在浓度差而管内扩散，扩散量由下式决定: Qin,400COS2D, (21?22) 式中D为溶质分子的扩散系数，*为浓度，单位取mol/L。扩散进样动力属不可控制参数，进样量仅由扩散时间控制，一般在10~60s间，用简单的定时器也可达到比较紧密的控制。扩散进样对管内介质没有任何限制，属普适性进样方法。 扩散具有双向性，在溶质分子进入毛细管的同时，区带中的背景物质也向管外扩散。由此能抑制背景干扰，提高分离效率。扩散也与电迁移速度和方向无关，可抑制进样偏向，提高定性定量的可靠性。 四、检 测 由于毛细管电泳中毛细管内径极小，因此在毛细管电泳检测器的研制中，首先面临的一个问题是如何既对溶质作灵敏的检测，又不使谱带展宽。通常采用的解决方法是柱上检测，这是减小谱带展宽的有效途径。紫外检测器和荧光检测器是目前使用最广的两种，激光诱导荧光检测的灵敏度高，但大多数物质需要衍生。另两种具有高灵敏度的有发展前途的检测器是电化学检测器和质谱检测器。 1. 紫外检测器 在毛细管的出口端适当位置上除去不透明的保护涂层，让透明部位窗口对准光路即可实现柱上检测(on-colµmn detection)，也可采用柱后检测。聚酰亚胺涂层剥离长度通常控制在2~3mm之间。涂层剥离方法有硫酸腐蚀法、灼烧法、刀片刮除法等。 多数商品UV检测器采用球镜聚焦，示意图如图21-7，球镜材料为蓝宝石，可将光束聚焦到0.2nl的小体积，灵敏度可以提高10倍。 2. 激光诱导荧光检测器 和紫外检测一样，激光诱导荧光(laser induced fluorescence, LIF)也可采用柱上和柱后两种检测方式。 LIF检测器结构类似于UV检测器，主要由激光器、光路系统、检测池和光电转换器等部件组成。进行倾角应小于45*，以降低背景杂散光的强度。激光的单色性和相干性好、光强高、能有效地提高信噪比，从而大幅度地提高检测灵敏度，能达到单分子检测水平。常用的连续激光器是氩离子激光器，主要输出谱线是488nm和514nm。