超低温冷冻对黄鳝精子中几种酶活性的影响

超低温冷冻对黄鳝精子中几种酶活性的影响 超低温冷冻对黄鳝精子中几种酶活性的影 响 第35卷第5期 2011年9月 水生生物 ACTAHYDROBIOLOGICASINICA Vo1.35,NO.5 Sep.,2011 DOI:10.3724/SP.J.1035.2011.00882 超低温冷冻对黄鳝精子中几种酶活性的影响 闫秀明张小雪 (贵州大学动物科学学院,贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵阳550025) EFFECTSoFCRYoPRESERATIoNoNENZYMEACTIVITYoF?l?,P7冠【 三【SPERMAToZoA YANXiu--MingandZHANGXiao--Xue (GuizhouKeyLaboratoryofAnimalGeneticsBreedingandReproduction,CollegeofAnim alScience, GuizhouUniversity,Guiyang550025,China) 关键词:超低温冷冻;黄鳝;精子;酶活性 Keywords:Cryopreservation;Monopterusalbus;Spermatozoa;Enzymeactivity 中图分类号:Q954.4文献标识码:A文章编号:1000—3207(2011)o5-0882—05 黄鳝(Monopterusalbus)S(名鳝鱼,蛇鱼,田鳗等,属 硬骨鱼纲(Osteichthyes),合鳃目(Synbranchiformes),合鳃 科(Synranchidae),黄鳝属(Monopeterus).黄鳝只限于东 经90.一150.和北纬43.以南的亚热带地区繁衍,在我国 除西部高原外各水域均有分布,其中安徽,江苏,浙江等 地产量最多[1].黄鳝营养价值丰富,肉质细嫩,无肌间刺, 肉味鲜美,一直以来深受广大消费者的喜爱.为了追求经 济效益,长期以来,人们过量捕捉,加之黄鳝生活水域被 农药,生活污水等污染,使其自然资源日益下降,远远不 能满足日益增长的市场需求.目前,黄鳝已经开始人工养 殖,但在实际生产中,常会遇到精卵发育不同步的问题. 超低温冷冻保存技术可以长期保存种质资源,因此,可 以有效解决黄鳝人工繁殖中精卵发育不同步的问题.超低 温冷冻保存技术对黄鳝的人工繁殖具有重要意义. 中国在鱼类精子冷冻保存方面已经做了许多研究, 并已经建立了包括"四大家鱼"在内的淡水鱼类精子库[,, 还制定了相关的技术操作规程[4】.鱼类精子经过超低温冷 冻后,精子可以复苏,但复苏后的精子活力及受精率总 是难以达到鲜精的水平.目前,超低温冷冻保存对精子的 冷冻损伤机理尚未阐明J. 本研究试图通过测定黄鳝精子内几种酶,在超低温 冷冻保存(一196~C)前后酶活性的变化,探讨超低温冷冻保 存对黄鳝精子酶活性的影响,为提高黄鳝精子超低温冷 冻保存效果提供理论依据. 1材料与方法 1.1精液采集 2010年7月在贵州省贵阳市徐家冲菜市场购买性成 熟雄性黄鳝.取成熟度好的个体,解剖后取精巢,再用干 毛巾擦去精巢 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的体液和血液,挤压精巢取精液,并 用干净的吸管将精液移入准备好的干净的培养皿中.整个 操作过程要求保持精液无水,无污染,在光学显微镜下, 采用医用血球计数板计数法,镜检精子活力,选取活力 在90%以上的精子作为试验材料. 精子活力激活后,在10x40倍显微镜下观察,运动 的精子占全部精子的百分比_5】. 1.2稀释液的配制 参照陈松林等『6]所使用的鱼类精子稀释液配方,配 制黄鳝精子冷冻保存稀释液,稀释液成分(表1). 将B液缓缓地注入A液中,得到混合液.再将C液 倒人混合液中混匀,容量瓶定容至1L,转入试剂瓶中, 4?冰箱保存备用. 收稿日期:2010—09—14;修订日期:2011-04—29 基金项目:贵州省自然科学基金项目【黔科合J~2:(2008)2130];贵州大学引进人才科研项目【贵大人基合字(2007)o03]资助 作者简介:闫秀明(1984—),男,黑龙江绥棱人;硕士研究生;主要从事动物遗传育种与繁殖方面研究.E-mail:yxm2tjj@126?corn 通讯作者:张小雪,E-mail:zhangxx508@163.com 5期闫秀明等:超低温冷冻对黄鳝精子中几种酶活性的影响883 注:"一"表示不含此成分 Note:"——''meansnotcontainingthiscomposition 1.3精子冻存与复苏 将取得的鲜精与稀释液按1:3的体积比稀释,然后 加入二甲亚砜(DMSO)~混合液中,使最终溶液中DMSO 浓度分别达到9%,10%,11%三个梯度[1,然后用洗耳球 将混合液吸人直径0.3mlTl,长15cm的细管中,两端用 火焰封口,无需平衡,直接置于液氮(一196~C)中保存.然 后分别在精子冻存1,2,3,4,5,6,7,15及30d后取 出,38?水浴解冻. 1.4酶活性检测方法 总ATP酶,琥珀酸脱氢酶(SDH),乳酸脱氢酶 (LDH),总蛋白质均采用试剂盒(南京建成生物工程研究 所)检测,相应操作参照说明书进行.总ATP酶采用比色 法,酶活力单位定义为每小时每毫升样品中ATP酶分解 ATP产生1gmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位(u). SDH采用比色法,酶活力单位定义为每毫克蛋白每分钟 使反应体系的吸光度降低0.01为1个比活性单位(u). LDH采用比色法,酶活力单位定义为1000mL血清37? 与基质作用15min,在反应体系中产生1~tmol丙酮酸为1 单位(u).总蛋白含量采用考马斯亮兰法测定. 冷冻前后分别测定了10尾黄鳝精子内3种酶的活性 及总蛋白质的含量,每个样重复3次,结果取平均值. 1.5数据分析 采用Excel和statistica(version6.0)软件进行处理分 析,利用双因素方差分析(Two.WayANOVA)来检验精子 冷冻前后所有酶活性差异的显着性,差异显着水平为 P<0.05. 2结果 2.1超低温冷冻对精子总ATP酶活性的影响 从图1可知,黄鳝精子中总ATP酶活性随冷冻时间 的延长,活性逐渐降低.冷冻保存5d以上(包括5d),三种 浓度DMSO组内两两比较,差异显着(P<0.05).这说明, IO%DMSO对总ATP酶的保护作用明显优于其他两种浓 度的DMSO.黄鳝鲜精中总ATP酶的平均活性为 (140.379-4-2.145)U/mL,经过超低温冷冻保存2d后, 10%DMSO组黄鳝精子中,总ATP酶平均活性降低至 (56.932~1.218)U/mL,此时总ATP酶平均活性已不足鲜 精的一半.30d后10%DMSO组总ATP酶平均活性降至 (13.643~0.668)U/mL. 分析表明:超低温冷冻使黄鳝精子内总ATP酶活性 显着降低<0.05);l0%DMSO对黄鳝精子内总ATP酶活 性的保护作用显着(尸<0.05)优于另外两种浓度的DMSO; 不同浓度的抗冻保护剂与冷冻时间这两个因素对黄鳝精 子中总ATP酶活性的影响,差异显着(P<0.05). 图1超低温冷冻对总ATP酶活性的影响 Fig.1EffectsofcryopreservationonthetotalATPactivities 同一时间点,直柱上所标字母不同表示差异显着<0.05),下 图同 Thesametimespot,thedifferentlettersonthestraightcolumn showedsignificantdifferencefP<0.05).Nextchartsarelikewise 2.2超低温冷冻对精子LDH活性的影响 从图2可知,黄鳝精子中LDH活性随冷冻时间的延 长,活性逐渐降低.冷冻保存1d以上(包括1d),三种浓度 DMSO组内两两比较,差异显着(P<0.05).这说明, 10%DMSO对LDH的保护作用明显优于其他两种浓度. 黄鳝鲜精中LDH的平均活性为(5736.441+172.361)U/mL, 经过超低温冷冻保存7d后,IO%DMSO组黄鳝精子中, LDH平均活性降低至(3105.745~118.654)U/mL,此时 LDH平均活性仍有鲜精的50%以上.30d后,10%DMSO 组LDH平均活性降至(1743.671~138.897)U/mL. 分析表明:超低温冷冻使黄鳝精子内LDH活性显着 降低(尸<0.O5);IO%DMSO对黄鳝精子内LDH活性的保护 作用显着(尸<0.05)优于另外两种浓度的DMSO;不同浓度 的抗冻保护剂与冷冻时间这两个因素对黄鳝精子中LDH 活性的影响,差异显着fP<0.05). ?加????加0 一rI牟【/3一110《?《 链《 884水生生物35卷 !{g 窿 z 凸 精子冷冻时间 Spermfreezingtime(d) 图2超低温冷冻对精子LDH活性的影响 Fig.2EffectsofcryopreservationonLDHactivities 2.3超低温冷冻对精子SDH活性的影响 从图3可知,黄鳝精子中SDH活性随冷冻时间的延 长,活性逐渐降低.冷冻保存ldrid:(包括ld),三种浓度 DMSO组内两两比较,差异显着(P<0.05).这说明, 10%DMSO对SDH的保护作用明显优于其他两种浓度. 黄鳝鲜精中SDH的平均活性为(28.34-0.748)U/mL,经过 超低温冷冻保存7d后,在l0%DMSO组黄鳝精子中,SDH 平均活性降低至(19.54-0.887)U/mL,此时SDH平均活性 仍有鲜精的50%以上.30d后,10%DMSO组SDH平均活 性降至fl1.8~0.798)U/mL. 分析表明:超低温冷冻使黄鳝精子内SDH活性显着 降低(尸<0.05);10%DMSO对黄鳝精子内SDH活性的保护 作用显着(P<O.05)优于另外两种浓度的DMSO;不同浓度 的抗冻保护剂与冷冻时间这两个因素对黄鳝精子中SDH 活性的影响,差异显着fP<0.05). 煨 窿 凸 ? 鲜精ld2d3d4d5d6d7d15d30d 精子冷冻时间 Spermfreezingtime(d) 图3超低温冷冻对精子SDH活性的影响 Fig.3EffectsofcryopreservationonSDHactivities 2.4超低温冷冻对精清总蛋白含量的影响 从图4中可知,黄鳝精液冷冻保存ld以上(包括ld), 三种浓度DMSO组内总蛋白含量两两比较,差异显着 f尸l<0.05).随着黄鳝精子冷冻时间的延长,10%DMSO精 子混合液中总蛋白含量由鲜精中的(16.5694-0.934)g/L先 小幅度降低至(14.4014-0.924)g/L,再大幅度升高到 f30.7234-0.789)g/L.其他两组也呈现相似的变化趋势. b0 皿到至 寸廿舌 .J 骂 鲜精1d2d3d4d5d6d7d15d30d 精子冷冻时问 Spermfreezingtime(d) 图4超低温冷冻对精清总蛋白含量的影响 Fig.4Effectsofcryopreservationontotalprotein 3讨论 3.1超低温冷冻对黄鳝精子总ATP酶活性的影响 ATP酶存在于机体的组织细胞及细胞器的膜上,它 是一种蛋白酶.ATP酶可以催化ATP水解产生ADP及无 机磷的反应.这一反应可以释放出大量的能量,为生命体 的各种生命活动提供能量.1955年Hofman—Berling最早 证明ATP是精子尾部运动的能量来源.当机体处于缺氧, 低温等恶劣环境时,ATP酶会因损伤而降低活力.因此, 可以通过ATP酶活力的大小来衡量细胞能量和功能代谢 有无损伤.有学者研究发现,精子活力与精子中ATP酶 含量呈正相关IS[.Comhaire,eta1.认为精子中的ATP酶的 水平是反映人体精子受精能力的最好标志l9].Bilgeri,eta1. 认为ATP含量越高,精子活率和运动能力越好,受精潜 在能力越大I】. Babiak,eta1.在研究中发现,超低温冷冻后虹鳟 (Oncorhynchusmykiss)精子中ATP酶的活性显着低于鲜 精I?].黄鳝鲜精经超低温冷冻保存后,ATP酶活性也显着 下降.这与前人的研究相吻合.这说明,超低温冷冻对黄 鳝精子内的ATP酶造成了损伤,使其活性显着降低,但 具体损伤机理还有待进一步研究. 3.2超低温冷冻对黄鳝精子LDH活性的影响 LDH广泛的存在于机体组织内,它是一种糖酵解酶, 在体内能量代谢,精子发生及受精过程中均起着重要作 用.LDH酶在黄鳝的不同组织器官中具有明显的组织特 异性,且在生殖腺内的含量高于其他组织器官[121. Gavella,eta1.认为精子LDH与生育力呈正相关.LDH的 活性与人的性成熟和生育能力密切相关,其活性下降, 导致精子能量供应障碍,从而影响生育【l.邓顺美等在 研究患有不育症病人的精子时指出,测定精子LDH活性 比单纯测定精浆LDH活性更能反映精液的质量【l引.陈田 飞等在对家蚕精子冷冻保存研究中指出,冷冻保存后家蚕 精子中LDH向精浆中溢出,导致精子中LDH活性下降【l. 黄鳝精子在冻存过程中,LDH活力显着下降,精子 运动能力也显着降低.这一现象可能通过陈田飞的理论得 以合理的解释.但另一方面,低温冷冻本身对酶类物质的 囝阻 c一]??? L 豳园豳圉圈阻 0一]闰曩 :. L p]?? L 盟日 ,]?? 上 ?园 :? L b蹑噩 娌图 %mb豳噩目一口]....?__j b?_皿 b.. .-量?0-_jb?_圈臣 ^,????????j b??姐圈量 b?I盟圈I c一]??? 上 ?_圈 c一]?b?_—I ;???? bII? .......... L 圈圈圈曩?I 5期闫秀明等:超低温冷冻对黄鳝精子中几种酶活性的影响885 结构会造成一定程度的损害,这也可能是黄鳝精子内 LDH活性降低的原因.具体变化机理,还有待进一步研 究和探索. 3.3超低温冷冻对黄鳝精子SDH活性的影响 SDH是线粒体的一种标志酶,是连接氧化磷酸化与 电子传递的枢纽之一,可为真核细胞线粒体和多种原核 细胞需氧和产能的呼吸链提供电子.因此,SDH活性的强 弱,可反映精子能量代谢的活跃程度,SDH活性检测对 评价冷冻前后精子线粒体功能具有重要意义I]. SDH位于线粒体内膜上,其活力依靠线粒体膜的 结构完整和功能正常【"].线粒体对环境因素的作用比 较敏感,很多环境因素的影响都能迅建引起线粒体发 生变化【.丁鸿才等研究证实,冷冻后细胞线粒体明显 肿胀变性,呈空泡样变[】.精子经超低温冷冻后,也会 出现线粒体肿胀,线粒体膜破裂等现象,这些现象都可 能对SDH的活性造成一定程度的影响. 黄鳝精子经过超低温冷冻保存后,精子内SDH活性 显着下降.这也许可以用上述理论解释,但还需要进一步 研究证实. 3.4超低温冷冻保存对黄鳝精子的损伤作用 研究显示,精子在冷冻,解冻过程中因有冰晶的形 成和消失,会对精子造成一定的机械性损伤.同时,精子 膜中类脂蛋白,会因冰晶的冻融而从细胞结构中分离出 来,使细胞膜的空间结构发生改变,从而导致细胞膜发 生肿胀,畸形及膜翻转等变化.无论是机械损伤,还是细 胞膜结构改变,都会导致精子内的酶类溢出,从而降低 精子中酶的活性.同时,从精子内溢出的酶类会进入精清 中,这会增加精清中总蛋白质的含量. 黄鳝精子在冻存过程中,精子内ATP酶,LDH,SDH 三种酶的活性呈现显着下降趋势,精清中的总蛋白含量 则显着升高.此结果表明,超低温冷冻保存对黄鳝精子造 成了冷冻损伤,但具体的冷冻损伤机理,还需要进一步 研究验证. 通过试验,寻求更好的冷冻保护剂及稀释液,可以 有效降低超低温冷冻对精子的损伤作用,因此,相关研 究可能是以后研究的重点. 参考文献 【1]MengQMiuXZ,YuTJ,eta1.Ichthology(Morphology, Taxonomy)[M】.ShanghaiScienceandTechnologyPress. 1989,261[孟庆闻,缪学组,愈泰济,等.鱼类学(形态, 分类).上海科学技术出版社.1989,2611 [2]ChenSL,LiuXLuDC,eta1.Studiesoncryopreserva— tiontechniquesofchub,carp,breamandgrass carpspermatozoa[J].ActaZoologicaSinica,1992,38(4): 413—424[陈松林,刘宪亭,鲁大椿,等.鲢,鲤,团头鲂 和草鱼精液冷冻保存的研究.动物,1992,38(4):413— 424】 【3】ZhangXJ.Studiesprogressoncryopreservationtechniques offishspermatozoa[J】_JournalofFisheriesofChina,1987, 9(3):259_-267【张轩杰.鱼类精液超低温冷冻保存研究进 展.水产,1987,9(3):259—267] [4]LuDC,LiuXLZhangLZ,eta1.Technicaloperationof fishspermcryopreservation[J].FreshwaterFisheries,1997, 2(4):13—15[鲁大椿,刘宪亭,章龙珍,等.鱼类精液冷冻 保存技术操作规程.淡水渔业,1997,2(4):l3—15] [5]JiXS,ChenSL,ZhaoY,eta1.Studiesprogressonqual? ityevaluationoffishspermatozoa[J].JournalofFishery SciencesofChina,2007,6(14):1048--1054[季相山,陈松 林,赵燕,等.鱼类精子质量评价研究进展.中国水产科 学,2007,6(14):1048--1054] [6]ChenSL.Progressandprospectofcryopreservationoffish gametesandembryos[J】.JournalofFisheriesofChina, 2002,26(2):161—168『陈松林.鱼类配子和胚胎冷冻保存 研究进展及前景展望.水产,2002,26(2):161—168] [7]ZhangXJ,LiuJ.Studyoncryopreservationoffishsper- matozoa:I.Screeningofantifreezedilution【J].ActaSci— encesNatureUniversityNormHunan,1991,3(14):255— 259『张轩杰,刘筠.家鱼精液超低温冷冻保存研究:I.防冻 稀释液的筛选.湖南师范大学自然科学,1991,3(14): 255—259] [8]ChanSY,WangC.Correlationbetweensemenadenosine triphosphateandspermfertilizingcapacity[J].Fertility Sterility,1987,47:717—725 [9]ComhaireFH,VermeulenL,Schoo~ansF.Reassessmentof theaccuracyoftraditionalspermcharacteristicsandadeno— sinetriphosphate(ATP)inestimatingthefertilizingpotential ofhumansemeninvivo[J】.InternationalJournalofAn— drology,1987,10:653—663 【10]BilgeriYR,WinckelmannA,BerzinM,eta1.Denosine triphosphatelevelsinhumanspermatozoa[JJ.Archives Andrology,1987,18:183 [11]BabiakI,GlogowskiJ,GoryczkoK,eta1.Effectofextender compositionandequilibrationtimeonfertilizationability andenzymaticactivityofrainbowfloutcyropreservedsper? matozoa[J].Theriogenology,2001,56:177—182 [12]ZhouA,ChenDY,XiaL.Apreliminarystudyontheelec— trophoreticpaRernsofLDHisoenzymesinsixtissuesof maleandfemaleMonopterusalbus[J】.ActaHydrobiologica Sinica,1994,18(1):l2一l6【周昂,陈定宇,夏玲.不同性 别黄鳝六种组织中LDH同工酶电泳谱的初步研究.水生 生物,1994,18(1):12—16] [13]GavellaM.SemenLDH—C4deficiencyandmaleinfertility [J】.ArchAndrology,1985,15:173 [14]DengSM,LiSG,WenJG,ela1.Determinationofactivity andstudyoflocalizationaboutlactatedehydrogenaseisoen- zymeLDHxininfertilespermatozoa[J].ChineseJournalof 12[邓顺 HistochemistryandCytochem~try,2001,10(1):8— 美,李叔庚,文建国,等.不育症精子乳酸脱氢酶同功酶 886水生生物35卷 主编 副主编 委员 编辑部 《水生生物》编辑委员会 EDIToRIALBoARDoFACTAHYDRoBIoLoGICASINICA ChiefEditor桂建芳GUIJian—Fang AssociateEditor解绶启XIEShou—Qi Membersf以姓氏拼音为序) 蔡庆华CAIQing—Hua曹文宣CAOwen—Xuan常剑波CHANGJian.Bo 陈家宽CHENJiaKuan陈宜瑜CHENYi—Yu陈毅峰CHENYi—Feng 高坤山GAOKun—Shan何舜平HEShun—Ping洪云汉HONGYun—Han 胡征宇HUZheng—Yu李文鑫LIWen—Xin李钟杰LIZhong—Jie 林浩然LINHao.Ran刘建康LIUJian.Kang刘永定LIUYong-Ding 麦康森MAIKang—Sen聂品NIEPin曲久辉QUJiu—Hui 阮韫芬SHENYun.Fenl宋立荣SONGLi—Rong唐启升TANGQi—Sheng 王丁WANGDing吴灶和wuZao.He吴振斌WUZhen—Bin 相建海XIANGJian—Hai肖伟XIAOwei谢平XIEPing 谢小军XIEXiao—Jun熊邦喜XIONGBang.Xi熊思岳XIONGSi—Yue 徐旭东xUXu.Dong杨先乐YANGXian—Le于丹YuDan 余其兴YuQi—Xing游力YOULi张奇亚ZHANGQi—Ya 朱作言ZHUZuo.YanHaraldRosenthal(德国) Editorialoffice杜新征DUXin—Zheng王芹WANGQin余茜Yuxi