标准
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菌验收、制备、保藏、 传代、使用、销毁的管理
发布日期：2010-12-31 浏览次数：4889
核心提示：介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、 传代、使用、销毁的管理规程 规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验
方法
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的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用
说明书
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1.标准菌的来源
标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC（B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收
从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球
3.2培养基
改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.
液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.
营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.
3.3操作步骤：
a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
j．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。
3.4菌种确认
用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。
3.5污染处理
假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管
3.6菌种的传代与保藏
将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。
菌种的传代保藏过程
3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。 传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。
定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：
（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。
（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。
（3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。
（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。
（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。
（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。
当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。
菌种斜面的培养、保藏条件及时间
菌种 培养条件及时间 培养基 保存条件及时间
大肠埃希菌(CMCC(B)44102) 30～35℃22～ 24h 营养琼脂培养基 2℃～ 8 ℃保存3个月
金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003) 30～35℃22～ 24h 营养琼脂培养基 2℃～ 8 ℃保存3个月
枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501) 30～35℃22～ 24h 营养琼脂培养基 2℃～ 8 ℃保存3个月
铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104) 30～35℃22～ 24h 营养琼脂培养基 2℃～ 8 ℃保存3个月
乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094) 30～35℃22～ 24h 营养琼脂培养基 2℃～ 8 ℃保存3个月
生孢梭菌(CMCC(B)64941) 30～35℃22～ 24h 营养琼脂培养基 2℃～ 8 ℃保存3个月
白色念珠菌(CMCC(F)98001) 23～28℃ 最多7天 改良马丁琼脂培养基 2℃～ 8 ℃保存3个月
黑曲霉(CMCC(F)98003) 23～28℃ 最多7天 改良马丁琼脂培养基 2℃～ 8 ℃保存3个月
短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602) 30～35℃22～ 24h 营养琼脂培养基 2℃～ 8 ℃保存3个月
注：菌种斜面1次/周观察状态是否正常。
3.7菌种的使用及销毁
每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。
每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有牢固的标签。标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。
废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121℃ 高压蒸汽灭菌30分钟。并对操作过程进行记录。
食品卫生微生物检验实验室操作要求
发布日期：2010-12-31 来源：互联网 浏览次数：4398
核心提示： 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。
一、无菌操作要求
1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。
3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。
4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。
7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。
8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
二、无菌间使用要求
1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。
2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。
3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。
4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置
三、消毒灭菌要求
微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。
（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法
1．灭菌前准备
（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。
（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。
2．装放
（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
（2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。
3．设备检查
（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。
（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。
（3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。
4．灭菌处理
(1) 干热灭菌法：此法适应于在干热情况下，不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。
① 器械器皿应清洗后再干烤，以防附着在表面的污物炭化。
② 灭菌时安放物品不能过挤，不要直接接触底和箱壁，物品之间留有空隙。
③ 菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔打开约30min，排除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调节指示灯，维持1.5 –2h。
④ 灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。
(2) 手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：
① 手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）.
② 手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。
③ 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。
④ 关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。
⑤ 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下 再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。
(3) 卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：
① 关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。
② 夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。
③ 待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至
④ 自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。
⑤ 使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。
5．灭菌温度与时间(1) 干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。(2) 压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间
（二）间歇灭菌方法
1.灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。
（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。
（2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。
（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。
2．血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。
(1) 在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。
(2)将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。
3．煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15 min，也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5 min，加入0.02﹪甲醛, 80℃煮60 min均可达到灭菌目的, 但选用煮沸消毒的增消剂时, 应注意对物品的腐蚀性.
4．灭菌处理:灭菌后物品,按正常情况已属无菌,从灭菌器中取出应仔细检查放置,以免再度污染。
(1) 物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉,不可作为无菌物品使用。
(2) 取出的物品,如为包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。
(3) 培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。
(4) 启闭式容器,在取出时应将筛孔关闭。
(5) 取出的物品掉落在地或误放不洁这处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。
(6) 取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。
(7) 凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。
(8) 每批灭菌处理完成后,记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。
四、有毒有菌污物处理要求
微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。
1. 经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。
2. 经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。
3. 染菌后的吸管，使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30 min高压灭菌。
4. 涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。
5. 打碎的培养物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。
污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。
五、培养基制备要求
培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：
1．根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。
2．PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。
3．培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。
4．盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。
5．培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。
6．每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。
7．目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。
8．每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。
六、样品采集及处理要求
1．所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。
2．根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。
3．采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。
4．样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。
5．检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。
(1) 样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。
(2) 瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。
(3) 按规定采样数量不足者。
对送检符合要求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。
6．样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。
(1) 液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。
(2) 固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。
(3) 瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。
七、样品检验、记录和报告的要求
1．检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。
2．样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。
期移植法
发布日期：2010-12-31 来源：CICC 浏览次数：881
核心提示：定期移植法是一种传统的菌种保藏方法，本文介绍了定期移植法的具体操作。
定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：
1 培养基制备
器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2接种
2.1 斜面接种
点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。
稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。
密波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。
挖块接种法 挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。
2.2 穿刺接种
用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。
2.3 液体接种
挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。
3 培养
将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。
4 保藏
培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1～3个月移植一次。
保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。
斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。
液体石蜡法
发布日期：2010-12-31 来源：CICC 浏览次数：1032
核心提示：液体石蜡法是定期传代法辅助法。由于培养物表面覆盖液体石蜡后可隔绝空气，因此降低了微生物菌体的物质代谢，延缓细胞的衰老，同时也防止培养基水分蒸发，是一种简易的菌种保藏方法。
亦称矿物油保藏法,定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。
操作步骤如下：
1 液体石蜡的准备
选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：
121℃湿热灭菌30min，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。
160℃干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。
2 斜面培养物的制备 参照定期移植法。
3 灌注石蜡 将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部1cm左右，使菌体与空气隔绝。
4 保藏
4.1 注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4～6℃）干燥处保藏，保藏时间2～10年。
4.2 保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。
5 恢复培养 恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。
高压蒸汽灭菌器的一种验证方法
发布日期：2010-12-31 来源：互联网 浏览次数：2929
核心提示：高压蒸气灭菌器的灭菌效果直接关系到微生物的实验结果，这里提供了进行灭菌效果验证的一个简易可行的方法。
除少数培养基只需加热溶解，不需高压灭菌外，大部分培养基均需121℃高压灭菌15-30分钟。尤其是对无菌试验培养基灭菌不彻底，直接关系到试验结果。因此必须认真对高压灭菌器进行灭菌效果的验证。
1．试验材料
(1)嗜热脂肪芽胞杆菌纸片。嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)ATCC7053是本法常用的生物指示菌，含芽胞量5-lO5 CFU/片。
(2) 121℃压力蒸气灭菌化学指示卡。
(3)溴甲酚紫胨水培养基116℃高压灭菌20分钟后备用。
(4)O-150℃留点温度计。
2．方法与结果
将嗜热脂肪芽胞杆菌纸片（以下简称菌片）用无菌镊子放人密封试管中。化学指示卡和留点温度计放入敞口试管中。以上两种试管各准备5-10份。分别放置在高压灭菌器蒸气口处、底部排气口处及底部出水口处或上下左右中间5处。如灭菌器为二层，则需放10处。
留点温度计标化合格后方可用于验证试验。检测前，需将温度计的水银柱甩至40℃以下。每次监测后留点温度计的温差应存1℃之间，则说明灭菌器内的温度分布是均匀的。
灭菌后的菌片应在严格无菌操作条件下放入灭菌后的溴甲酚紫胨水培养基内56-60℃培养24-48小时，观察颜色变化。如培养基变为黄色，说明菌片中的嗜热脂肪芽胞杆菌尚未完全灭活，细菌仍可在培养基中生长，分解葡萄糖产酸变为黄色。如培养基颜色不变化仍为紫色，则说明芽胞已灭活。同时要用未经灭菌的纸片放入培养基内作为阳性对照，不加纸片的空白培养基作为阴性对照。
化学指示卡上的指示色块，在高压蒸气灭菌时，由淡黄色变为黑色。随着颜色变化的深浅，并与对照色相比，可判断灭菌效果是否达到要求。化学指示卡应在干燥处保存。遇潮会变色，影响灭菌效果的观测。
高压蒸气灭菌必须使蒸气顺利进入灭菌器内，与灭菌物品接触，并将原有的冷空气排出方可达到灭菌的效果。要进行空载热分布和满载热穿透力验证(满载时不超过总体积的2/3)。二种验证各重复三次，共做六次。
5个点六次试验表明温度均在121℃，化学指示卡变黑；程度与对照色一致；培养基均未改变颜色，说明高压蒸气灭菌效果合格。
高压灭菌器属于强检仪器，但强检只是对仪器物理参数的考核。所以做过强检的灭菌器还必须进行灭菌效果的验证。一些单位常常忽略了这个重要的问
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
。国内市售的手提灭菌器，往往仪器指针达到所需的温度，但灭菌物品的实际温度却未达到要求。导致灭菌物品不彻底，影响实验结果。培养基灭菌不彻底，影响培养基的使用及结果判断。因此高压蒸气灭菌器无菌效果的验证是一个必须引起重视的问题。
大肠菌群及其食品卫生学意义
发布日期：2010-12-31 来源：食品微生物 浏览次数：5138
核心提示：大肠菌群是微生物常规检验项目之一，本文论述了大肠菌群作为食品微生物检测指标的卫生学意义
大肠菌群主要包括肠杆菌科中的埃希氏菌属、柠檬酸细菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧。不形成芽泡，在35—39℃条件下，48h内能发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性。大肠菌群中以埃希氏菌属为主，埃希氏菌属被俗称为典型大肠杆菌。大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外7—30 d后在环境中的变异。所以食品中检出大肠茵群，表示食品受到人和温血动物的粪使污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧日污染。
大肠菌群最初作为肠道致病菌而被用于水质检验，现已被我国和国外许多国家广泛用做食品卫生质量检验的指示菌。大肠菌群的食品卫生学意义是作为食品被粪便污染的指示菌，食品中粪便含量只要达到10-3mg/kg即可检出大肠菌群。
一股认为，作为食品被粪便污染的理想指示菌应具备以下特征：
①仅来自于人或动物的肠道，并在肠道中占有极高的数量。
②在肠道以外的环境中，具有与肠道病原菌相同的对外界不良因素的抵抗力，能生存一定时间，生存时间应与肠道致病菌大致相同或稍长。
③培养、分离、鉴定比较容易。
大肠菌群比较符合以上要求。然而由于大肠菌群在低温条件不适宜生长，特别是在冰冻条件下容易死亡，所以用大肠菌群作为冷冻食品的粪便污染指示菌并不理想。由于肠球菌对冷冻条件有强的抵抗力，因而有人主张以它作为冷冻食品的粪便污染指示菌更为合适。
肠道致病菌如沙门氏菌属和志贺氏菌属是引起食物中毒的重要致病菌、然而对食品经常进行逐批逐件地检验又不可能，鉴于大肠茵群与肠道致病菌来源相同，而且一般在外环境中生存时间也与主要肠道病原茵一致，所以大肠茵群的另一个重要食品卫生学意义是作为肠道病原菌污染食品的指示菌。当然食品中检出大肠菌群，只能说明有肠道病原茵存在的可能性，两者并非一定平行存在，但只要食品中检出大肠菌群，则说明有粪便污染，即使无病原菌．该食品仍可被认为是不卫生的。
含量测定方法的评价(Analytical performance parameters)
发布日期：2010-12-31 来源：互联网 浏览次数：2265
核心提示：任何一种分析测定方法，根据其使用的对象和要求，都应有相应的效能指标。一般常用的分析效能评价指标包括：等；测定方法的效能指标可以作为对分析测定方法的评价尺度也可以作为建立新的测定方法的实验研究依据。
a、精密度(precision)
系指用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。它们越接近就越精密。在药物分析中，常用 标准(偏)差(standard deviation，SD或S)； 相对标准(偏)差(relative standard
deviation，RSD)，也称变异系数(coefficient of variation，CV)，表示。
生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内(或日内)精密度及批间(或日间)精密度。
批内精密度(within-run precision)：是同一次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各7-10份，每种浓度的样品按所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定。计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批内精密度也可视为日内精密度(with- in-day precision)。所得RSD应争取达到5％以内，但不能超过10%。
批间精密度(between-run precision)：是不同次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7-10份，置冰箱冷冻。自配制样品之日开始，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批间精密度也可视为日间精密度(day to day precision)。所得RSD应控制在15％以内。
b 、准确度(accuracy)
是指测得结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。
由于“真实值”无法准确知道，因此，通常采用回收率试验来表示。生物药物分析中，常用标准添加法来计算回收率，即取已准确测定药物含量P (present)的真实样品(如人血浆样品等)，再加入药物标准品已知量A (added)，混合物作为测定液，其测定值为M (measured)。测定液要配制成高、中、低三种浓度，每个浓度测定3-5次，求出每种浓度的平均测定值M，且RSD应符合要求。由于预先要准确测定样品中原含有的药物量P，因此也应测定3-5次，求其平均值P，且RSD应符合要求。
回收率＝ （测定液平均测定值M - 原样品液含量平均值P）/ 加入量A×100％
回收率结果越接近100％表明分析方法准确度越高。生物样品分析时，一般控制回收率范围应为85％-115％(样品药浓＞200ug／L)及80%-120％(样品药浓＜200ug／L)。
制剂的含量测定时，采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法作回收试验及计算RSD，还应作单独辅料的空白测定。每份均应自配制模拟制剂开始，要求至少测定高、中、低三个浓度，每个浓度测定三次，共提供9个数据进行评价。
回收率＝（平均测定值M -空白值B）/ 加入量A×100％
回收率的RSD一般应为2％以内。
c．检测限(limit of detection，LOD)
是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时，所需样品中药物的最低浓度，无需定量测定。
LOD是一种限度检验效能指标，它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白(本底)值的高低。要根据采用的方法来确定检测限。当用仪器分析方法时，可用已知浓度的样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度S与噪音(或背景信号)强度N，以能达到S／N＝2或S／N＝3时的样品最低药浓为LOD；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差(即3δ空或3S空)作为检测限的估计值。为使计算得到的LOD值与实际测得的LOD值一致，可应用校正系数(f)来校正，然后依之制备相应检测限浓度的样品，反复测试来确定LOD。如用非仪器分析方法时，即通过已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。
d．定量限 (limit of quantitation，LOQ)
是指在保证具有一定可靠性(一定准确度和精密度)的前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的最低浓度。
它反映了分析方法测定低药物浓度样品时具有的可靠性。它与上述的检测限的差别在于：定量限要定量测定某一药物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低浓度应该符合一定的精密度和准确度的要求。确定定量限的方法也因所用方法不同而异。当用非仪器分析方法时，与上述检测限的确定方法相同；如用仪器分析方法时，则往往将多次空白试验测得的背景响应的标准差(即空白标准差)乘以10，作为定量限的估计值，继之，再通过分析适当数量已知接近定量限或以定量限制备的样品来验证。
e．选择性(selectivity)
是指在样品介质中有其他组分共存时该分析方法对供试物质准确而专属的测定能力。
它与专属性(specificity)的含义稍有不同。专属性是指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号；选择性则可对多种化学成分产生不同响应，而主要成分的响应可与其它响应区分。
因此，选择性是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的量度。
在药物分析中考察一个分析方法的选择性时，应着重考虑杂质、降解产物、相关化合物以及制剂辅料等其他组分是否对被测药物的测定有干扰。一般，通过添加上述物质的样品与未曾添加的样品所得分析结果进行比较而确定。
f．线性与范围 (linearity and range)
分析方法的线性是在给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力。换句话说，就是供试物浓度的变化与试验结果(或测得的响应信号)成线性关系。
所谓线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且成线性的供试物浓度的变化范围，其最大量与最小量之间的间隔，可用mg／L ~ mg／L、 ug／ml ~ ug／ml等表示。
线性与范围的确定可用作图法(响应值Y／浓度X)或计算回归方程(Y＝a+bX)来研究建立。
测定样品时所有生物药物分析方法都必须同时作标准曲线。每次作标准曲线时，方法应与分析方法考核时完全一致。标准浓度应包括一定梯度的5-8个浓度(非线性者如免疫分析可适当增加)，每个浓度只需测定一次(免疫分析可测定两次并取均值)；标准曲线应覆盖样品可能的浓度范围，对于含量测定要求一般浓度上限为样品最高浓度的120％，下限为样品最低浓度的80％ (但应高于LOQ)；目前仍广泛采用相关系数(r)表示标准曲线的线性度、并控制r≥0.9900。对照品的LOQ必须包括在线性范围。
g. 耐用性 (robustness)
是指利用相同的方法在各种正常实验条件下对同一样品进行分析所得结果的重现程度。
所谓各种正常实验条件，包括不同的实验室、不同的分析人员、不同的仪器、不同批号的试剂、不同的测试耗用时间、不同的分析温度、不同的测定日期等等。分析方法重现性的测定是通过在不同实验室由不同的实验者(操作和环境条件虽有差别但仍在规定的分析参数内)对同一样品的分别测试而获得的。
h、重现性 (ruggedness)
即是指在不同实验室中使用此种分析方法的精密度。
是评价其保持不受参数微小变差影响的能力，并可作为正常使用的一个可靠性指标。
i. 与参比方法测得结果的相关程度的比较
由于生物样品中含有许多干扰测定的杂质，特别是与原型药物相似的代谢物常对药物的测定有影响。因此，除考察选择性外，有时还用参比方法对实际生物样品同时测定并进行比较。比较试验时，取若干份实际样品
(如病人服药后采取的血样)，用一个已证明有相当专属性和可靠性的方法与新建立的方法同时进行测定，以参比方法测得的药浓为横坐标(X)，以新建立方法测得的药浓为纵坐标(Y)作成散布图(scatter diagram)，并求出直线回归方程 (y＝a+bx)及相关系数 (r)。r最大值为1，表示两法完全相关(结果完全吻合)；r＝0时，表示两法完全不相关。一般要求两法的相关系数r＞0．95，而相关直线的斜率 (b) 应接近于1。
评价一种分析方法的效能，并不一定对上述各项指标都有要求。一般．根据方法的使用对象有所区别。大体上有以下四种情况：
A．用于原料药中主要组分或制剂中有效组分含量测定的方法：除了检测限和定量限二项指标外，对精密度、准确度、选择性、线性与范围、耐用性等均应有所要求；
B．用于原料药中杂质测定或制剂中降解产物测定的方法又可分为两种：①用于含量测定；②用于限度检查。
对于①法的要求是：除检测限和精密度指标不必要求外，对准确度、选择性、线性与范围、定量限、耐用性等均应有所要求；
对于②法的要求是：只对检测限、选择性和耐用性三项指标有所要求，其余均无需要 求。
C．用于溶出度测定的方法及药物释放度测定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余项目均不作要求。
D．用于生物样品中药物测定的方法，对精密度、准确度、检测限、选择性、可测线性范围、定量限、对生物样品的耐用性以及与参比方法测得结果的相关程度的比较等指标应有所要求。
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