小麦苯丙氨酸解氨酶基因和几丁质酶基因转录起始点的鉴定

小麦苯丙氨酸解氨酶基因和几丁质酶基因转录起始点的鉴定 ( ) 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 武汉 430070 Rainer Fischer ( )德国亚琛技术大学植物及分子遗传研究所 , 亚琛 52056 摘 要 本文应用改良的引物延伸法 , 鉴定了一个小麦的苯丙氨酸解氨酶和几丁质酶基因的转录起始点 。这种方法只需少量同位素 , Sep hadex G - 25 柱和严格的杂交条件 。利用两种基因的特定引物及总 RNA 进行的引物延伸反应产物在电泳的凝胶上均呈现一条十分清楚的带 , 表明这两种多拷贝小麦基因 的转录分别起始于一个核苷酸 。小麦苯丙氨酸解氨酶基因的转录起始点为 5′- CT GCC GA GT - 3′序列中 的第 2 个 C ; 而小麦几丁质酶基因转录起始点为 5′- A TCACCA GC - 3′序列中的第 2 个 A 。它们都分别位 于各自基因 TA TA 盒的下游 。 关键词 引物延伸法 , 小麦 , 苯丙氨酸解氨酶基因 , 几丁质酶基因 Ident if icat ion of the Transcr ipt ion Start Sites of a Phenylalan ine Ammon ia - lya se Gene and a Chit ina se Gene From Wheat Liao Yucai Li Heping ( )State Key Laboratory of Crop Genetic Imp rovement , Huazho ng Agricult ural U niversity , Wuhan 430070 Rainer Fischer ( ( ) )Instit ut f ur Biologie I Molekulargenetik/ Botanik, RW TH Aachen , D - 52056 Aachen , Germany Abstract An imp roved p rocedure for p rimer extension analysis was used to identif y t he t ranscription start site of ( ) a p henylalanine ammonia - lyase PAL gene and a chitinase gene f rom wheat . This p rocedure requires less amount of isotope , a Sep hadex G - 25 column and highly st ringent hybridization conditions. One distinct band was detected in each p rimer extension reaction wit h total RNA ext racted f rom wheat leaves and t he p rimers specific for t he wheat genes. These result s indicated t hat t he t ranscriptions for bot h genes were initiated at a single nucleotide respectinely. For t he PAL gene , t he band corresponded to t he position of t he second C in t he sequence 5′- CT GC2 C GA GT - 3′, while for t he chitinase gene , it corresponded to t he second A in t he sequence 5′- A TCACCA GC - 3′. Bot h t ranscription start sites are located downst ream of t heir TA TA box. ? 国家自然科学基金和 “九五”国家攻关资助的课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。 Key words Primer extension analysis , Wheat , Phenylalanine ammonia - lyase gene , Chitinase gene 植物苯丙氨酸解氨酶和几丁质酶基因都属于与植物抗病有关的基因 。它们的表达均受病菌侵染的诱导, 并在〔3 , 4〕( ) 植物抗病过程中起重要作 用。苯丙氨酸解氨酶 EC4 . 3 , 1 . 5是植物抗毒素生物合成及木质化过程中的第 〔4〕一个关键酶。沉积木质素以加强细胞壁的功能是植物受病菌侵染之后的一种主要防卫反应机制 。在抗秆锈病小 〔8〕( ) 麦中 , 细胞的木质化程度与抗病反应呈高度正相关。几丁质酶 EC3 . 2 , 1 . 14 是几丁质的水解酶 。迄今尚 未在植物中 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 到几丁质的存在 , 但它是真菌细胞壁的主要成份 。包括来自小麦的植物几丁质酶在体外抑制真菌 生长 , 以及外源几丁质酶基因的转基因植物抗真菌能力增强的研究结果表明 , 几丁质酶基因在植物中的遗传操作 〔2 , 3 , 10〕可以提高它们的抗病性。分离 、鉴定这两种基因是近年来植物抗病分子生物学研究的热点 。我们已从小麦 ( ( ) ) L . 中国春中分离到苯丙氨酸解氨酶基因 EMBL accession No , X 99725 和几丁质酶基因 T ri ticu m aest i v u m 〔6 , 7〕( ) EMBL accession No , X 76041并测定了它们的序列。 基因转录起始点的鉴定是研究基因分子结构的内容之一 。引物延伸法是基因转录起始点鉴定的主要方法 。本 〔1〕研究采用改良的 Ausubel 等方法, 分别鉴定出上述两个受病菌侵染诱导表达的小麦基因转录起始点 。发现这两 个多拷贝基因的转录均起始于 TA TA 盒下游的一个核苷酸 。 1 材 料 和 方 法 111 材料 普通小麦中国春种子于室温下萌发后播种于人工生长室。7 天后选择大小相似的幼苗接种秆锈菌种 32 号 , 在黑暗条件下保湿过夜 , 于接种后 6 天取叶片于液氮中 , 然后贮于 - 80 ?备用 。 32 35 γRNA 酶抑制剂和 M - ML V 反向转录酶购自 Promega 公司 。[- P dA TP 及S 购自 Amersham 公司 。DNA 序列测定试剂盒购自 U SB 公司 。寡核苷酸引物由 Eurogenic 公司合成 。 112 RNA 抽提及 D NA 序列测定〔6〕RNA 抽提及按照廖玉才等差别沉淀法进行 。DNA 序列测定按照 U SB 厂家指南提供的 Sanger 双脱氧末端终 止法进行 。 113 引物延伸法 〔1〕〔9〕〔12〕按照 Ausubel 等方法 , 并结合 Sambrook 等和 Willian 等的方法改进后进行引物延伸反应 。30 ng 合成的 32 ( () μμμγ 进行末端标记 , 以 Nick 柱 Sep hadex G 25 , GIBCO3 000Ci/ mmol 寡核苷酸引物用 3l 10Cil/l - P A TP 4 ) μμ( ) - BRL 公司除去未标记的同位素 。取 50g 从小麦叶片中抽提的总 RNA 与 1l 5 ×10cp m标记的引物混合 , (( ) 加入 1/ 10 体积的 3mol/ L 醋酸钠 p H512及 215 倍体积的乙醇 , 置 - 20 ?30 分钟 , 离心 15 000g , 4 ?, 10 分 ) μ( 钟沉淀核酸 , 70 %乙醇洗涤 , 空气干燥后的核酸沉淀悬浮于 30l 甲酰胺杂交液中 40mmol/ L P IP ES , p H614 , ) 1mmol/ L ED TA , p H810 , 014mol/ L NaCl , 80 %甲酰胺, 用微量进样器上下吸取至少 50 次 , 并用 Vortex 激烈振 荡 , 以确保核酸溶解在杂交液中 。然后分两个不同处理 。一个在杂交反应之前于 85 ?加热 10 分钟 , 另一个不加 μ(μ) 热 。所有杂交反应均于 30 ?保温过夜 。将 170l 013mol/ L 醋酸钠 p H512和 500l 乙醇与杂交反应液混合 , 于 μ- 20 ?30 分钟 , 如上述离心 , 核酸沉淀经含 75 %乙醇和 25 %011mol/ L 醋酸钠溶液洗涤 , 室温干燥后溶解在 25l ( μ延伸反应液中 560mol/ L 每一种 dN TP , 10mm D T T , 50mmol/ L Tris - HCl , p H813 , 75mmol/ L KCl , 3mmol/ L ) μMgCl50 U 人胎盘 RNA 酶抑制剂 , 200 U M - ML V 反向转录酶 , 延伸反应于 42 ?90 分钟 。再加 1l 015mol/ L 2 μμED TA , p H810 , 1 g 牛胰脏 RNA 酶 A , 37 ?保温 30 分钟 。加入 100l 215mol/ L 醋酸钠后 , 以苯酚/ 氯仿/ 异戊醇 μμ及氯仿/ 异戊醇各抽提一次 。上清液与 300l 乙醇混合 , 以上述方法沉淀引物延伸产物 , 经 500l 70 %乙醇洗涤并 〔7〕 这个基因是两个紧密连锁的苯丙氨酸解氨酶基因中的一个。在已测定的序列中 , 最长的阅读框架起始信号的上游有 885bp , 除一个 118bp 的内含子外 , 该基因的编码序列全长 211 kb 。Nort hern 杂交分析检测到一条约 214 kb 的杂交带 。据此我们推测转录起始点位于翻译起始点的上游 。化学合成用于引物延伸反应的含 29 个核苷酸 ( ) 的寡核苷酸链 5′- T TCTC GCACTCCA TC GAAA TA T GCA GCAA - 3′, 对应于 69 nt 至 97 nt 的互补序列 图 1 , a 32 γ 该寡核苷酸经 [- P dA TP 末端标记后作为引物 , 以从秆锈菌侵染的叶片中抽提的 RNA 为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 , 进行引物延 伸反应 。图 2 , a 表示放射自显影结果 。在两个不同处理的延伸反应中 , 都只有一条非常清楚的延伸带 。杂交前于 () 85 ?加热对延伸产物没有改进作用 图 2 , a , 行 1。根据同时电泳的 DNA 序列测定的顺序 , 这条带代表一个长 度为 97 个核苷酸的延伸产物 , 它对应于 DNA 序列 5′- CT GCC GA GT - 3′中的第 2 个 C。这个结果表明 , 该苯丙 氨酸解氨酶基因转录起始于一个核苷酸 , 位于翻译起始点 A T G 上游 118 nt 处 , 在 TA TA 盒下游 , 它在 DNA 序列 ) ( 中被定为 + 1 图 1 , a , 下同。 212 小麦几丁质酶基因转录起始点的鉴定 这个小麦几丁质酶基因在其 960 bp 的阅读框架内不含内含子 。Nort hern 杂交分析检测到一条约 1 . 1 kb 的杂 交带 。据此 , 我们 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 出了一个用于延伸反应的含有 29 个核苷酸的寡核苷酸引物 , 5′- AA GCC GAACT T GCT () GCA GCA GA GGCA GT T - 3′, 它对应于翻译起始信号 A T G 下游 23 nt 至 51 nt 处 图 1 , b。采用前述方法将经同位 素标记的引物与小麦总 RNA 混合 , 未经加热处理直接转入杂交反应 。图 2 , b 显示出一条信号十分强烈的延伸反 应带 , 它代表一个长度为 161 个核苷酸的延伸产物 , 对应于 DNA 序列 5′- A TCACCA GC - 3′中的第 2 个 A 。 () ( ) 图 1 小麦苯丙氨酸解氨酶基因 a及几丁质酶基因 b转录起始点的鉴定 箭头标出引物延伸法鉴定的小麦苯丙氨酸解氨酶基因转录起始点 , 双线为 TA TA 盒 , 单线为转录起始点旁邻序列 , 延伸反应引物的互补序列以点线标出 , 星号表示翻译起始密码子。编码序列以大写字母表示。 本文报道的两个不同小麦基因转录起始点都位于各自 TA TA 盒下游 , 这与其他植物基因的转录起始点一〔5〕〔11〕( ) 致。Smale 等总结出真核生物基因转录起始点邻近序列的一般规律是 YYCA YYYYY Y = C 或 T, 其中 A 多为转录起始点 。据此 , 本研究鉴定的小麦几丁质酶基因的转录起始点邻近序列 5′- A TCACCA GC - 3′与其十分相似 。小麦苯丙氨酸解氨酶基因转录起始点邻近序列 5′- CT GCC GA GT - 3′中 , 除起始点碱基为 C 外 , 其它序列 也有一定的同源性 。这些结果表明真核生物基因转录机制具有一些共同特征 。 () ( ) 图 2 引物延伸法鉴定小麦苯丙氨酸解氨酶基因 a和几丁质酶基因 b转录起始点 1 . 杂交前于 85 ?加热 10 分钟的引物延伸反应产物 ; 2 . 未作加热处理的引物延伸反应产物 ; P. 引物 延伸反应产物 ; T 、G、C 、A. 双脱氧核糖核酸末端终止法序列测定 ; 箭头指示引物延伸反应带。 〔6 , 7〕小麦苯丙氨酸解氨酶基因和几丁质酶基因的表达既受外界环境条件影响 , 也受植物发育控制。DNA 序列 同源性比较分析表明 , 在这两个基因的启动子序列中 , 存在着大量在其他植物抗病有关基因中已经鉴定的调控元 件保守序列 。研究表明 , 这些序列在各自基因表达中起重要的调控作用 。测定这两个基因的转录起始点 , 将为深 入分析基因表达调控中的顺反调控因子 , 为抗病育种工程所需受病菌侵染诱导表达的启动子提供了资料 。 参 考 文 献 Ausubel F M , et al . Current Protocol in Molecular Biology. Jo hn Wiley and So ns , New York , 1989 , pp . 41811,41814 1 Broglie K , et al . Transgenic plant s wit h enhanced resistance to t he f ungal pat hogen R hi z octoni a sol ani . Science , 1991 , 254 : 1194,2 1197 3 Colling D B , et al . SPlant chitinases. Plant J . , 1993 , 3 : 31,40 Dixo n R A , et al . St ress - induced p henylp ropanoid metabolism. Plant Cell , 1995 , 7 : 1085,10974 5 Joshi C P. In inspectio n of t he do main bet ween p utative TA TA bo x and t ranslatio n start site in 79 plant genes. Nucl . Acids Res. , 1987 , 15 : 6643,6653 6 Liao Y - C , et al . Characterizatio n of a class Ib chitinase gene differentially induced in isogenic lines by infectio n wit h Pucci ni a gra m i nis . Plant Sci . , 1994 , 103 : 177,187 ( ) 7 Liao Y - C , et al . SNucleotide sequence of o ne of t wo tandem genes Accessio n No . 99705encoding p henylalanine ammo nia - lyase ( ) in T rit icu m aest i v u m P GR 96,102. Plant Physiol . , 1996 , 112 : 1397 Moerschbacher B M , et al . Changes in t he level of enzyme activities involved in lignin biosynt hesis during t he temperat ure sensitive re2 8 ( ) sistant respo nse of wheat Sr6to stem rust . Plant Sci . , 1989 , 65 : 183,190 9 Sambroo k J , et al . Molecular clo ning : A Laboratory Manual , 2 nd Cold Sp ring Harbor , New York , 1989 , pp . 7179,7183 10 Schlumbaum A , et al . Plant chitinases are potent inhibitors of f ungal growt h . Nat ure , 1986 , 324 : 365,367 11 Smale S T , Baltimore D. The“initiator”as a t ranscriptio n co nt rol element . Cell , 1989 , 57 : 103 () 12 Williams J G , et al . Hybridizatio n in t he analysis of RNA. In : Hames and Higgins eds. , Nucleic Acid Hybridizatio n , A Practical App roach , IRL Press , Oxford , 1985 , 1139,1160 1996 - 10 - 9 收稿 , 1997 - 02 - 25 修回.