微生物量碳的测定方法
氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳
一、采样与样品预处理
土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2,3 mm),或放在低温下(2,4?)保存。如果土壤太湿无法过筛,进行晾干时,必须经常翻动土壤,避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右,在室温下于密闭装置中预培养1周,密闭容器中要放入两个50mL的烧杯,分别加入水和稀NaOH,以保持其湿度和吸收释放的CO。预培养后的土壤最好立即
分析
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,若需要放置一段时间,在低温下(2,4?)2
最好不要超过10d。
土壤田间持水量采用改进的Shaw(1958)方法测定。在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管,漏斗用玻璃纤维堵塞。取50.00 g土壤于漏斗中,夹紧橡胶管,加入50 ml水,保持30 min,再打开夹子使多余的水流入量筒,30 min后测定流出的水量,同时测定土壤湿度,计算土壤田间持水量,用烘干土壤质量
表
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示。——林启美老师文件内容
二、方法—氯仿薰蒸浸提法(FE)
1、方法原理
土壤经氯仿薰蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后,细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。
浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定,也可用微量碳分析仪测定。此处介绍比较简
单
名单名单延期单出门单老板名单
的重铬酸钾容量方法。
2、仪器及设备
培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率200rev/min);冰柜;磷酸浴。
3、试剂
1.无乙醇氯仿:量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中,加入50mL硫酸溶液
[,(HSO)=5%],充分摇匀,弃除上层硫酸溶液,如此进行3次。再加入50 mL去离子水,24
同上摇匀,弃去上部的水分,如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中,并加入约
20g无水KCO,在冰箱的冷藏室中保存备用。(试剂浓硫酸 ,(HSO)=95~98% ,稀释192324
倍)
-12.硫酸钾溶液[c(KSO)= 0.5 mol?L]: 称取硫酸钾(KSO,化学纯)87.10g,加热溶于2424
去离子水中,稀释至1L。(需加热溶解)
-1 o3.重铬酸钾[c(1/6KCrO)=0.2000 mol?L]: 称取经130C烘干2,3h的重铬酸钾(KCrO,227227
分析纯)9.8110g,溶于1000mL的去离子水中。
-1 o4.重铬酸钾标准溶液:[c(1/6KCrO)=0.1000 mol?L]: 称取经130C烘干2,3h的重227
铬酸钾(KCrO,分析纯)4.9055g,溶于1000mL的去离子水中。 227
5.邻啡罗啉指示剂:称取邻啡罗啉指示剂[CHN?HO,分析纯]1.49g,溶于含有0.70g 12822
FeSO?7HO的100mL去离子水中,密闭保存于棕色瓶中。 42
-16.硫酸亚铁溶液[c(FeSO)=0.05 mol?L]:称取硫酸亚铁(FeSO?7HO)约13.9005g,溶442
解于600,800mL去离子水中,加浓硫酸(化学纯)20mL,搅拌均匀,定容至1000mL,
于棕色瓶中保存。此溶液不稳定,需在用时每天标定其浓度。
7.硫酸亚铁溶液浓度的标定:
吸取重铬酸钾标准溶液5.00mL,放入100mL三角瓶中,加水约20mL,加浓硫酸5mL和邻
啡罗啉指示剂2滴,用FeSO溶液滴定,根据FeSO溶液的消耗量即可计算FeSO溶液的444
准确浓度。
-1硫酸亚铁溶液标定方法:吸取0.1000 mol L(1/6 KCrO)标准溶液(试剂4)5.0ml,放227
入150ml三角瓶中,加浓硫酸5ml和邻啡罗啉指示剂2滴,用硫酸亚铁溶液滴定,滴至溶液由蓝绿色变为棕红色即为终点。根据滴到终点消耗的硫酸亚铁溶液量计算其准确浓度,即C =(C, V)/ V。 21 12
-1式中: C—重铬酸钾标准溶液浓度(0.1000mol L); 1
-1C—硫酸亚铁标准溶液浓度(mol L); 2
V—吸取的重铬酸钾标准溶液体积(5ml); 1
V—滴到终点时消耗硫酸亚铁溶液体积(ml)。 2
4、操作步骤
4.1薰蒸
称取相当于20.0g烘干土重的湿润土壤3份,分别放在约100 mL的烧杯中,一起放入同一干燥器中,干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度,同时放入一个装有50mL NaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量,同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片),用少量凡士林密封干燥器,用真空泵抽气
o至氯仿沸腾并保持至少2 min。关闭干燥器的阀门,在25C的黑暗条件下放置24h。
打开阀门,如果没有空气流动的声音,表示干燥器漏气,应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时,取出装有水、碱液和氯仿的烧杯,氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部,用真空泵反复抽气,每一次都要打开干燥器,以加快除去氯仿的速度,直到土壤闻不到氯仿气味为止。
薰蒸开始的同时,称取等量土壤3份,用KSO溶液(见下一步骤,试剂2)浸提——,24
o同时做不加土壤为空白对照。浸提液在室温下可以放置1周,4?下放置1个月或在-15C
下保存。
4.2浸提
薰蒸结束后,将土壤全部转移到250 mL的塑料震荡瓶中,加入80 mL 0.5mol/LKSO24溶液(1:4水土比),在振荡机上振荡浸提30min(25?,185 rev/min)(转速根据仪器进行调整,必须使得土壤完全振荡开,过滤。
4.3测定
准确吸取浸出液10.00 mL放入硬质消煮管中,加入重铬酸钾标准溶液(试剂3)5.00 mL、浓HSO 5mL,加入少量的抗暴物质,在170-180?磷酸浴上煮沸10min,冷却后用去离子水24
洗涤消化管全部转移至150mL三角瓶中,总体积为70mL左右,。加入2滴邻啡罗啉指示剂,用硫酸亚铁溶液(试剂6)滴定剩余的KCrO。溶液颜色由橙黄色变为蓝绿色,再变为棕红色227
即为滴定终点。
4.4 测定土壤含水量
称5.00g 上述湿润土壤,放在铝盒中,在105?烘箱中烘8h,然后称其干重。 5、结果计算
1.有机碳(Oc)的计算
W(C) =(V-V)×c×3×ts × 1000 /DW 01
-1 式中:W(C) ,, 有机碳(Oc)质量分数,mg?kg;
V,, 滴定空白样时所消耗的FeSO体积,mL; 0 4
V,, 滴定样品时所消耗的FeSO体积,mL; 1 4
-1 c ,, FeSO溶液的浓度,mol?L; 4
3 ,, 碳(1/4C)的毫摩尔质量,M(1/4C)=3mg/mmol;
1000 ,, 转换为kg的系数;
ts ,, 分取倍数,等于(浸提液体积+土中的水中)/吸取液的体积;
DW ,,土壤的烘干质量,g。
2.生物量碳(Bc)的计算
W(C)=2.64Ec
-1 式中:W(C) ,, 微生物量碳(Bc)质量分数,mg?kg;
-1 Ec ,, 薰蒸土样有机碳量与未薰蒸土样有机碳量之差,mg?kg;