【doc】激发型抗CD40单抗介导恶性肿瘤细胞凋亡及其机制探讨

【doc】激发型抗CD40单抗介导恶性肿瘤细胞凋亡及其机制探讨 激发型抗CD40单抗介导恶性肿瘤细胞凋亡 及其机制探讨 364SUZHOUUNIVERSITYJOURNALOFMEDICALSCIENCE2002;22(4) 激发型抗CD40单抗介导恶性肿瘤细胞凋亡及其机制探讨 汤琳庄羽美周照华余葛华潘建忠张学光 (苏州大学医学生物技术研究所,苏州215007) 摘要:目的探讨激发型CD40单克隆抗体对人B淋巴细胞恶性肿瘤的生物学效应及其机制. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 将激发 型CD40单克隆抗体5C11加入肿瘤细胞的体外培养体系,采用细胞计数,流式细胞仪等方法分析单克隆抗体5C11 对不同肿瘤细胞株的作用.结果5C11能引起CD40表达的多发性骨髓瘤(MM)细胞株XG2和恶性淋巴瘤细胞 株Daudi发生同型聚集,抑制其生长并介导凋亡;CD40分子介导的XG2和Daudi细胞凋亡作用与可溶性TNF产 生无关.结论激发型CD40单克隆抗体通过诱导B细胞恶性肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的体外生长. 关键词:CD40;单克隆抗体;多发性骨髓瘤;淋巴瘤;B细胞;细胞凋亡 中图分类号:R392.11;R730.3文献标识码:A文章编号:1000—5749(20022)04—0364—04 EffectsofAnti'——CD40mAbonInducingMalignantBCells ProliferationArrestandApoptosisanditsMechanism TANGLin,ZHUANGYu—mei,ZHOUZhao—hua,etal (DepartmentofBiotechnology,SuzhouUniversity,Suzhou215006,China) Abstract:ObjectiveTostudytheexpressionofCD40moleculeandthebiologicaleffectsmedi ated byCD4omoleculesonmalignantBcells.MethodsAgonisticanti—humanCD40monoclonalantibody (clone5Cl1)wasaddedtocellculturesystem.Cellcounting,PIstaining,Annexin— Vstainingand flowcytometricanalysiswereusedtostudythebehaviorofmalignantBcelllinesaftertreatmentwith mAbclone5Cl1.Results5Cllinducedhomotypicaggregationandproliferationarrestandmediated apoptosisinmultiplemyelomacelllineXG2thatexpressedCD40strongly;5CllinducedBlymphoma celllineDaudihomotypicaggregationandproliferationarrestandapoptosis,theapoptosisofXG2and DaudibyCD40activationwasnotmediatedbyTNF.ConclusionAgonisticanti— CD40mAb5Cll caninhibittheproliferationofmalignantBcellsbyinducingthemtodieapoptotieally. Keywords:CD40;Monoclonalantibody;Multiplemyeloma;Lymphoma;Bcell;Cellapoptpsis CD40是分子量48KD的细胞表面分子,属肿瘤 坏死因子受体(TNFR)超家族…1.CD40分子表达 于许多类型的细胞,包括B细胞,单核细胞,树突状 细胞,胸腺上皮细胞,内皮细胞和许多肿瘤细 胞【2】.CD40的信号传递在不同细胞上可产生截 然不同的效应:可为正性调节,促进细胞的增殖或分 化;也可为负性调节,导致细胞的生长抑制和/或凋 亡.这些矛盾的结果,其原因和机制目前尚不清楚. 研究表明:CD40分子激发的肿瘤细胞常常发生生 长抑制甚至凋亡[8-9J. 为了进一步阐明CD40分子介导对多发性骨髓 瘤(MM)细胞和B淋巴瘤细胞株的生物学效应及其 机制,我们采用本室研制的CD40激发型单克隆抗 体5Cll为工具,探讨CD40分子被激发后肿瘤细胞 的生物学效应,并对其信号传导的可能机制作初步 探讨. 1材料和方法 1.1细胞株人多发性骨髓瘤细胞株XG2是苏州 大学免疫室张学光教授在国外建立的细胞系,用含 【资助项目]2001年度"若政学者"资助项目 收稿日期:2002—04—20作者简介:汤琳(1981一),女.南京市人.在校儿科专业本科 生*指导老师 苏州大学(医学版)2002;22(4)365 体积分数为10%胎牛血清及3ng/mlrIL一6(中国 科学院刘新垣教授赠送)的RPMI1640(Gibco公司) 常规培养:B淋巴瘤细胞株Daudi(购自ATCC)用含 体积分数为10%胎牛血清的PRMI1640常规培养; 对肿瘤坏死因子TNF敏感的L929细胞株(购自 ATCC)用含体积分数为10%胎牛血清的RP— MI1640常规培养. 1.2细胞培养将XG2,Daudi细胞各2×10/ml 培养于24孔板,加不同浓度的5Cll,于培养的24, 48,72,96h计数台盼蓝染色去死细胞.每组设3个 复孔. 1.3流式细胞术检测Annexin—V标记按 Boehringe公司的说明书进行,1×10细胞用PBS 洗两次,重悬于100/~l标记液中,其中HEPES缓冲 液(HEPES/NaOH,pH7.4;140mmol/LNaC1; 5mmol/LCaC12)含2/AAnnexin—V和2/API(50/A/ m1),室温放置20min,用HEPES缓冲液洗两次,用 流式细胞仪分析细胞凋亡情况. 1.4TNF的检测将L929细胞8×10/ml培养 于96孔板,加不同浓度Daudi细胞培养上清(Daudi 细胞2×10/ml培养96h后取上清),并用TNF标 准品作阳性对照,于培养的72h加MTT(5mg/m1) 20ul/孔,反应6h,吸弃上清,加异丙醇,用酶联仪在 5C1110,O00n$ 5C11lO00n$ controlmAb McdIu? 570nm测定OD值.每组设3个复孔. 2结果 2.1抗CD40单抗5C11介导XG2和Daudi细胞发 生同型聚集在IL一6依赖性的XG2及Daudi细 胞培养体系中加入lptg/ml的5Cll,在培养后的 24h,光镜下观察呈明显的同型聚集,并在48h后细 胞凝集成团(图1). 2.25Cll抑制XG2和Daudi细胞生长加入单 抗共同培养后的XG2和Daudi细胞,光镜下细胞生 长缓慢,经不同培养时间的细胞计数表明,5C11对 XG2和Daudi细胞的生长有抑制作用,lt-tg/ml即具 有显着的抑制作用(图2). 2.35Cll介导XG2细胞的凋亡镜下观察5Cll (1/~g/m1)处理24h后的XG2细胞,可发现细胞膜皱 缩,细胞浆颗粒增多.随即用Annexin—V和PI双 标记,流式细胞仪分析表明,40%,60%的XG2细 胞呈现凋亡(图3). 2.4CD40介导的Daudi细胞凋亡与可溶性TNF 无关用对TNF敏感的L929细胞株来检测培养 了96h的Daudi细胞株培养上清,发现CD40分子 介导的Daudi细胞凋亡过程中,并未诱导可检测性 有活性的可溶性TNF产生(图4). 图15C11引起XG2和Daudi细胞的同型聚集 用含1~g/ml的5C11培养肿瘤细胞,48光镜(250×)TN片(A:XG2细胞;B:Daudi细 胞 A?96hn 曼a72hn日48 塞824llr:口Ohrs 蜜粤自-r——一 宝宝毒:皇—广———— 020406080loo120l4o 020406080 图25C11对XG2和Daudi细胞株的生长抑制剂效应.dh'.' 不同培养体系中恶性B淋巴细胞的生长计数.A:XG2细胞株;B:Daudi细胞株 P<o.Ol 帆,,= ?u眦m. 5 366SUZHOUUNIVERSITYJOURNALOFMEDICALSCIENCE2002;22(4) 1?2 1 0.8 . O.4 O.2 O XG2调亡率:0.1% l2 ' 3W, ' _ .4 ? ? 一一—— ll000 pI XG2+511调亡率:58% 图3流式细胞仪5Cll介导细胞的调亡作用 Annexin—V和PI双标记调亡分析(48h:1.早期调亡细胞;2.二次坏死细胞,3.活细 胞) D?士清Daudi清Daudi清Control(,)TNFIngTNFSngTNF10ng51020 图4Daudi细胞培养上清对L929细胞的增殖影响 3讨论 CD40分子在B淋巴细胞生长和分化中是至关 重要的.用CD40单抗建立的CIM0体外培养系统 能使B淋巴细胞增殖,分化,开启免疫球蛋白的分 泌及其类型转换.在恶性淋巴细胞特别是恶性浆细 胞表达CIM0分子,其意义和功能如何,一直是存在 争议的.Westendorf等报道,新鲜分离的MM细胞 均表达CIM0分子,同时CIM0分子介导了MM细 胞株ANBL一6的IL一6自分泌生长,并由此推论 CD40对MM在体内扩散和增殖起了关键的作 用J.而随后的一些研究表明,CIM0分子激发的 MM细胞的增殖或克隆形成与IL一6分泌不一定 有直接联系n0】.甚至CD40的激发能导致一些 MM细胞株的生长抑制?.而在本研究中,我们所 获得的抗CIM0单抗,能抑制CD40的多发性骨髓 瘤细胞株XG2的增殖,并介导了其凋亡,表明CD40 介导的信号可能存在双向调节性,即可以介导增加 或分化,或者产生生长抑制甚至凋亡.而其中的机 理,可能与CD40配基化的程度有关或者经由CD40 分子的信号传递过程中涉及的结合蛋白不同所致. 据文献报道,在CD40介导的CD40转基因细胞凋亡 是由于诱导了内源性TNF分子的表达.我们的实 验发现,CD40分子介导的XG2和Daudi细胞凋亡 过程中,并未诱导可检测性有活性的TNF产生. 业己证实,新鲜分离的MM细胞均表达CD40 分子,值得采用5Cll单抗进一步观察能否促使其 凋亡.这将为运用CD40单抗或sCD40L诱导MM 细胞凋亡提供理论依据.Funakoshi等在负瘤小鼠 实验中发现,CD40mAb能抑制淋巴瘤细胞的生长和 促使肿瘤消退;我们在实验中亦发现应用5C1l 与淋巴瘤细胞共同培育后,有显着地抑制其生长的 作用,并可以提高淋巴瘤对其它促凋亡因素的敏感 性.同时,CIM0单抗处理后的淋巴瘤细胞株上调 性表达Fas,ICAM—l,CD58等一系列与T细胞激 发有关的粘附分子,并能在体外由外周单个核细胞 诱导产生特异性CTL(结果未显示),这表明CD40 单抗具有潜在l临床运用价值. 参考文献: 1UckunFM,Gaji—PeczalskaK,MyersDE,eta1.Temporal associationofCD4Oantigenexpressionwithdiscretestages ofhumanB—eel1ontogenyandtheefficacyofanti—CD4O immunotoxinsagainstclonogenicB—'lineageacutelym? phoblasticleukemiaasewllasB—lineagenon—Hodgkin'S lymphomacells[J].Blood,1990,76:2449--2456 2LingNR,MaclennanICM,MasonDY.B—cellandplasma cellantigens:newandpreviouslydefinedclusters.In:Leuco? cytetypingllI.McMichaelA.JedEJ].Oxford:OxfordUni— versityPress,1987:302,335 3UckunFM.RegulationofhumanB—cellontogeny[J]. Blood,1990,76:1908,1923 4PaulieS,Ehlin—HenrikssonB,MellstedtH,eta1.Ap50 surfaceantigenrestrictedtOhumanurinarybladdercarcino— masandB-lymphocytes[J].CancerImmunolImmunother, 1985.20:23,28 5JacksonN,LingNR,BallJ,eta1.Ananalysisofmyeloma plasmacellphenotypeusingantibodiesdefinedatthe11Ird internationalworkshiponhumanleucocytedifferentiation antigens[J].ClinExpImmunol,1998,72:351,356 6WestendorfJJ,AhmannGJ,ArmitageRJ.eta1.CD4Oex— pressioninmalignantplasmacdls[J].JImmunol,1994.152 :1】7,128 苏州大学(医学版)2002;22(4)367 7JabaraHH.FuSM,GehaRS,eta1.CD40andIgE:syner— gismbetweenanti——CD40monoclonalantibodyandinter. 1eukin4intheinductionofIgEsynthesisbyhighlypurified humanBcells[J].JExp.Med,1990,172:1861,1864 8周照华,王江方,王月丹.等.一株特殊功能的抗人CD40 单克隆抗体的获得及其生物学特性分析[j].中国免疫学 杂志.1999,15(12):280 9FunakoshiS,LongoDL,BeckwithM,etal:Inhibitionof humanBcelllymphomagrowthbyCD40stimulation[J]. Blood,1994,83:2787,2794 10MexW.Tong.ZhangBQ,MuesG,SolanoM,HansonT, andStondMJ:Anti—CD40antibodybindingmodulates humanmultiplemyelomaclonogenicityinvitro[J].Blood, 1994.84(9):3026,3033 11Pellat—DeceunynckC.Amiot—M,RobillardN,eta1.CDI— la—CD18andCD102interactionsmediatehumanmyelo. macellgrowtharrestinducedbvCD4Ostimulation.Cancer Res,1996,15:56(8):1909,1916 '虹c,,,0矗' 球后注射氯丙嗪治疗绝对期青光眼 过钦群 (苏州第二人民医院眼科,苏州215002) 关键词:球后注射;氯丙嗪;绝对期青光眼 中图分类号:R775.05文献标识码:A文章编号:1000—5749{2002)04—0367—01 我院自1995年开始以球后注射氯丙嗪治疗8例绝对期 青光眼,取得了较好的效果,症状基本控制,现对其进行分析 讨论. 1临床资料 1.1一般情况共8例8眼,其中男3例,女5例,年龄17 , 72岁,平均62.3岁,病程10月,二十余年,均确诊为绝 对期青光眼,6例为原发性闭角型青光眼,2例为继发性青光 眼.2例继发性青光眼中1例为外伤性青光眼,另1例为渗 出性视网膜脉络膜炎,继发视网膜剥离,最后导致绝对期青 光眼.患者均有剧烈眼痛,同侧偏头痛,并有恶心,呕吐,胸 闷及便秘等症状.眼科检查:视力均为无光感,结膜充血明 显,角膜浑浊水肿,虹膜萎缩,大量新生血管形成,瞳孔强直 闭锁,对光反射消失,除2例继发性青光眼前房不浅外,其余 6例前房均极浅,晶体浑浊,眼压46.4,81.8mmHg,平均 65.2mrnHg,经降眼压药物治疗,症状不能很好控制. 1.2治疗方法患者取平卧位,双眼正视前方,消毒下睑皮 肤,用5号长针头在眶下缘中外1/3皮肤面进针,针头朝向 眶下壁,沿眶下壁向眶深部缓慢进针,穿过眶隔后针头再向 上抬起,稍向内后方进针约2.5,3cm,进入肌圆锥内,抽无 回血,注入2%普鲁卡因lml,氯丙嗪25mg,拔针后适当按压 数分钟,观察血压变化,止痛效果及不良反应. 1.3治疗结果注射后约半小时出现眼睑肿胀,球结膜充 血水肿,第1,2天反应最明显,3,4天反应减轻至消失. 24h内血压可略有下降,少数病人出现嗜睡.多于24h后恢 复正常.注射后2天测眼压,平均为52.6mmHg,比注射前 眼压平均下降12.6mmHg,但仍高于正常.注射后1,3 天,患者绝对期青光眼的症状逐渐好转,最终得到完全控制. 8例随访了6,24个月.平均13.6个月,患者均无不适主 诉. 2讨论一般认为,眼压控制中枢在问脑,下丘脑.所以凡 是可以麻醉问脑及下丘脑者,均可以降眼压.氯丙嗪可以通 过麻醉眼压控制中枢间脑及下丘脑,使眼压下降;而普鲁卡 因通过阻滞睫状神经节,使血管舒缩反射生理阻滞.释放二 乙烷胺基乙醇,使血管扩张,房水生成减少,以达到降眼压的 作用.我院治疗的8例中,治疗前眼压平均为65.2mmHg, 治疗后眼压平均为52.6mmHg,较注射前平均下降了13. 6mmHg.在降眼压的同时,氯丙嗪及普鲁卡因可阻滞睫状 神经节,故可达到解除疼痛的目的,所以注射后虽然眼压部 分下降,但仍高于正常,然而患者已无眼痛等不适症状. 治疗绝对期青光眼主要是解除疼痛,以往多采取眼球摘 除术,而普鲁卡因加氯丙嗪球后注射既可降低眼压,又可解 除疼痛,同时保留了患者眼球._由于绝对期青光眼无保护视 功能的问题,且剂量不大,故较为安全.除了短暂的局部反 应,暂时性血压下降及镇静嗜睡外,未有其他明显副作用. 对伴有全身疾病的老年体弱不能耐受手术者及不愿作眼球 摘除的其他患者,均较适用,本法简便,易行,经济,是减少患 者痛苦的一种理想方法.应注意的是:?注射前需行普鲁卡 因皮试过敏者禁用.?注射后24h内需观察血压,神志情 况,注射后要静卧2,3h,以避免直立性低血压.?操作轻 巧,切忌进针过猛过深,抽无回血后,方可缓慢推注,观察反 应,如有不良反应,终止操作,对症处理.?严格掌握适应 症,对非绝对期青光眼或尚有视力者,禁用此法. 收稿日期:2001—12—30作者简介:过钦群(1973一),女,苏州市人.NeCe~~,住院医 师,从事眼科临床工作