呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病(VED)模型建立及G蛋白基因重组质粒免疫特征（可编辑）

呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病(VED)模型建立及G蛋白基因重组质粒免疫特征（可编辑） 浙江大学医学院 硕士学位论文 呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病(VED)模型建立及G蛋白基因 重组质粒免疫特征 姓名:余蓓蓓 申请学位级别:硕士 专业:病原生物学 指导教师:钱景;严杰 20091201 浙江人学硕I:学位论文 中文摘要 呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病VED模型 建立及G蛋白基因重组质粒免疫特征 浙江大学医学院 硕士研究生 导 师 病原生物学 余蓓 蓓 钱景副教授、严杰教授 中文摘要 目的 呼吸道合胞病毒respiratorysyncytialv rus，RSV是婴幼儿下呼吸道 感染的主要病原体，其感染引起婴幼儿毛细支气管炎和肺炎，并与儿童哮喘 的发 生发展有着密切关系。接种疫苗是预防和控制传染病最为有效的 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ，但RSV至 今尚无安全有效的疫苗产生。以福尔马林灭活RSV疫苗FI(RSV预防接种的婴 儿或学龄前儿童，自然感染RSV后反而导致更为严重的疫苗增强性疾病Vaccine enhanceddisease，VED的产生。有研究表明，生化方法提纯的RSVG蛋白免疫和 重组G蛋白免疫均有明显的诱导VED效应。另有研究者报道，尽管G蛋白和 FI(RSV在免疫病理学方面引起的免疫应答相似，但T细胞介导的应答却不同，即 两者引起疾病加重的机理不同。提示G蛋白与VED相关性有待于进一步研究。 本研究中我们通过建立福尔马林灭活RSVFI(RS?疫苗相关VED模型并定义 其主要特征，为相关免疫调控机理研究提供平台;构建编码RSVG蛋白基因的重 组质粒，观察其对RSV感染小鼠的保护性及特异性免疫效应，探讨表达的G蛋白 抗原与VED的相关性，为探索RSV疫苗接种后疾病加重的相关机制以及为研制 安全、有效的RSV疫苗提供线索和实验依据。 方法制备RSVAl型Long株FI(RSV疫苗;以FI(RSV免疫BALB,c小鼠后 以RSV攻击，收集攻毒前后肺组织、血清标本;采用荧光定量RT-PCR 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 肺组 织标本中病毒滴度，HE染色法检查肺组织病理改变;采用ELISA检测血清标本中 II 浙江人学硕l:学位论文 中文摘要 RSV特异性IgG水平。利用基因重组方法构建含RSVG蛋白编码基因的重组质粒， 测序和酶切鉴定，WestemBlot检测目的基因经体外表达后的免疫原性。重组质粒 免疫小鼠后以RSV感染，采用上述相同方法分别检测肺组织标本中RSV滴度、肺 组织病理改变和血清抗体水平，同时采用双抗体夹心ELISA测定肺泡灌洗液 BAL内Thl,Th2细胞因子表达量，流式细胞术检测BAL中T淋巴细胞亚群数 量及活化状态。 结果 与对照组相比，FI(RSV免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低， 但出现更为严重的肺组织病变，主要是以肺炎，间质性肺炎以及支气管周围炎为 主要特征的广泛炎症反应，伴有局部肺气肿。免疫小鼠血清RSV特异性IgG抗体 滴度增高，但感染RSV后其滴度明显降低。同时成功构建了编码RSVG蛋白 基因 的重组质粒pcDNA3(1G。WesternBlo 证实目的基因表达蛋白在体外具有免疫原性。 被免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低，肺组织中未见明显的炎性细胞浸润。 小鼠血清中产生较高滴度的抗RSV-GIgG。小鼠BAL细胞中CD4+CD25+T淋巴 细胞比例显著增加，并且IFN-丫Thl、IL(4Th2两类细胞因子表达显示平衡。 结论本研究成功地建立了FI(RSV免疫BALB,c小鼠感染RSV后VED模型， 其主要特征为肺组织中出现与病毒滴度、血清抗体水平不一致的严重病理改变; 编码呼吸道合胞病毒RSVG蛋白基因的重组质粒pcDNA3(1G能诱导产生 CD4+CD25+T细胞亚群，对小鼠具有明显的保护作用，而未见明显的VED现象产 生。 关键词 呼吸道合胞病毒;疫苗增强性疾病; G蛋白;重组质粒;免疫病理 特征;T淋巴细胞 III 浙江人学硕l:学位论义 英文摘要 EstablishamousemodeIofvaccine(enhanced diseaseVEDofrespiratorysync tialv rusRSVand defim。necharacteristicsofplasmidDNAoeline lmmune o NA encodingGglycoproteinofRSV DepartmentofPathogenBiology CollegeofM dicalScience,ZhejiangUniversity Postgraduate Tutor YuBei(bei Prof(QianJ ng，YanJie Abstrsct ObjectiveRespiratorysyncytialv rusRSVisoneofthemostimportantc usesof virallowerrespiratorytractillnessininfantsandchildrenworldwide(I tcancause bronchiolitisandpneumonia,anditisrelatedothedevelopmentofchildhoodasthma( Vaccinationis hemosteffectivemeasuretopreventa dcontrolinfectiond sease(But SOfarnosecureandeffectivevaccinesavailableforprophylaxis(, nfantsandchildren whowereimmunizedwithFormalin?inactivatedRSVdevelopedvaccinee hanced diseaseVEDwhentheyinfectedbyRSV(Someres archindicatedthattheGproteinof RSVpurifiedbybiochemistryethodanrecombinatedGproteinbothCanleadto VEDeffect(Anotherresea chreportedthattheimmuneresponsemediatedbyT lymphocyteofGproteinandFI?RSVweredifferent， althoughtheyinducedsimilar immunopathology(Therelationbetw enGproteinandVEDshouldbemorestudied( Inthistudy，weestablishedavaccine-enhanceddiseaseVEDmodelinmouse immunizedwithformalin?inactivatedhum nrespiratorysyncytialvirusvaccine TV 浙江人学顾I:学位论义 英文摘要 FI-RSVandchallengedbyRSVinfection(WeconstructedaplasmidDNAencodi ngG glycoproteinfrespiratorysync tialvirusRSVandinvestigatedtheprotective immuneresponseagainstRSVinfectionoapproachtherelationbetweenGproteinand VEDeffect( MethodsFI-RSVvaccinewaspreparedfromRSVA1 longstraina dusedto intramuscularlyimmunizeBALB,cmice; samplesoflungandserawerecollected beforeandafterRSVchallenge; virustitrenlungwasdetectedbyfluorescencebased realtimeRT?PCR;sectionsofparaffinembeddinglu tissueswerestainedby haematoxylinandeosinH&Eforhistologicalanalyses; seraanti?RSVIgGlevelswere examinedbyELISA(RecombinantplasmidDNAofpcDNA3(1uWasconstructedby standardRT?PCRbasedcloningprocedure(TheimmunogenicityofrecombinantG proteintransientlyxpressedinHEK293cellswasdetectedbyWesternBlotti ng( BABL,cmicew reintramuscularlyimmunizedwithpcDNA3(1u Samplesoflung，sera, bronchoalveolaravagefuidBALwerecollect dbeforeandafterRSVchallenge; virustiterinlungwasdetectedbyrealtimeRT?PCR; sectionsofparaffinembedding lungtissuesw restainedbyhaematoxylinandeosinHEforhistologicalanalyses;sera anti-RSVIgGlevelswereexaminedbyELISA;Thl, Th2cytokineweredetectedby ELISAkit，theTlymphoeytesubs tsofBALwasdeterminedbyimmunefluorescence stainingfollowedbyflowcytometry( ResultsAfterchallenge，FI?RSVimmunizedmicepresentedel vatedl velsof peribronchiolitis，bronchitis，alveolitisandin erstitialpneumon tisaswellaspulmonary emphysemainspiteofreducedlungviraltitres;thosemicd velopedRSVspecificIgG insera,butdramaticallydroppeddownafterviruschallenge(PlasmidDNAof pcDNA3(1 u Wasuccessfullyconstructed(Thexpressedtargetproteinpossesses immunogenicity(Afterchallenge，pcDNA3(1 uimmunizedmicepresentedrelieved pathologicalchangesinlungaswellasreducedlungviraltiters(TheRSVsp ecificIgG Wasdetectedinseraofimmunizedmice(ThereWasignificantlyincreasednumberof V 浙江人学硕lj学位论文 英义摘要 CD25+CD4+TcellsinmiceBAL( ConclusionWehaveestablishedamousemodeIofFI?RSVvaccinationenha cedRSV infectionwhichischaracterizedbyincreasinginperibronchiolitis， bronchiolitistogether withalveolitisandnterstitialpneumonitis(WeconstructedapcDNA3(1 G plasmidDNA vaccinationwhichaninduceevidentprotectivecellularimmunityagainstR SV infectioninmicewitht eincreasednumberofCD25+CD4+Tcellsubpopulation，andit havenotinduceVEDeffect( [Keywordsl Respiratorysync tialv rus;Vaccine?enhanceddisease;Gglycoprotein; RecombinantplasmidDNA;Immunopathology;Tlymphocyte VI 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝坚太堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:念稚蕊 签字日期:妒D年弓月V日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 逝婆太堂 有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阕。本人授权逝婆太堂可以 将学位论文的全部或部分 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名:像蒋掣毛 导师签名: 触磐 签字日期:?,勺年 ?月1日 签字日期: 力啤 乡月y日 浙江人学硕Ij学位论文 致谢 致 谢 衷心感谢我的导师钱景和严杰教授两年多来给予的精心指导和和严格要求，他 们深厚的学术造诣、敏捷的思维、渊博的知识和严谨的工作态度使我终生受益! 衷心感谢毛亚飞、彭惠琴、李立伟、潘建平、罗依惠、林旭暧等老师的悉心指 导! 真诚地感谢浙江大学医学院病原生物学教研室全体同学!尤其是李世军、廖苏 梅、金丹丹、董海燕、王学海、张迪亚、王江、姜久昆、秦妍妍和徐韩飞等 师兄 师姐们，以及同窗张磊、张皓、李志峰和赵金方等在我的实验和生活中给予很大 的帮助和关心，在此致以深深的谢意! 最后特别感谢我的亲人朋友在我繁忙的学习、科研中给予的理解、支持和帮助。 浙江人学硕l:学位论文 呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病VED模型 建立及G蛋白基因重组质粒免疫特征 浙江大学医学院 硕士研究生 导 师 病原生物学 余 蓓 蓓 钱景副教授、严杰教授 引言 1(1研究背景 呼吸道合胞病毒Respiratorysyncytialv rus，RSV是引起婴幼儿呼吸道感染 最常见病原体，老年人及免疫功能低下人群感染后则导致严重呼吸道病变。与其 它流感等常见呼吸道病毒感染性疾病比较，RSV感染引起的毛细支气管炎、 肺炎 往往较为严重，尤其是婴儿、免疫功能低下患儿，病死率高达20,左右，并易发 展为支气管哮喘【11。 众所周知，接种疫苗是预防和控制传染病最为有效的措施。然而，Rosenberg 等指出，RSV自1957年获得分离鉴定以来，至今仍然未有安全有效的疫苗【21，究 其原因主要是以往研究的RSV疫苗存在严重的安全问题。Kim等首先发现，福尔 马林灭活RSV疫苗FI(RSV预防接种的婴儿或学龄前儿童，自然感染RSV后 较之未接种疫苗感染者表现出更为严重支气管痉挛性肺炎的临床表现‘31。此现象分 别在小鼠及其他动物中被反复证实【4‘8】。目前将此类因疫苗免疫接种使相应病原微 生物感染时致病作用增强的疾病或现象，称之“疫苗增强性疾病”Vaccineenhanced disease，VED。VED虽非普遍现象，但仍可见于不少病原微生物疫苗中，如前述 的RSV以及HIV、SARS冠状病毒、肺炎支原体、沙眼衣原体死疫苗或亚单位疫 苗。例如，Robbins等 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 ，某些HIV病毒蛋白抗原免疫动物后，可直接引 起T 细胞病变，削弱了机体抗感染能力【91。Yang等发现，SARS冠状病毒临床分离株s l 浙江人学硕l:学位论文 蛋白所产生的机体特异性免疫，可明显增强病毒对细胞的毒性作用，全病毒死疫 苗VED更为严重fm】。VED的存在，导致一些病原微生物难以采用目前仍作为疫 苗主流的常规死疫苗或组分疫苗进行预防接种，这对相关疾病的有效预防和控制 带来极大的困难。 T细胞免疫应答是多克隆T细胞参与、受多因素调控的复杂过程。已知T细 胞被激活后成为效应T细胞，根据其分化方向差异，可分为Thl和Th2型，各自 分泌的细胞因子有所差异。业已发现，RSV感染小鼠诱发的免疫应答，主要是T 细胞Thl途径相关细胞因子IL一2、IFN-7分泌增加;但FI(RSV免疫小鼠感染RSV 发生VED后，T细胞Th2途径相关细胞因子IL(4、IL一5、IL(10分泌增加[4-6,s,131， 提示FI(RSV疫苗VED主要涉及Th2型T细胞。目前研究认为，与FI(RSV 疫苗 VED相关的抗原分子主要是病毒包膜糖蛋白G。Hancock等报告，生化方法提纯 的RSVG蛋白免疫小鼠后用RSV攻击，表现出与FI(RSV疫苗接种后类似的症状 和肺部病理改变，重组G蛋白免疫也有明显的诱导VED效应【51，但其它病毒蛋白 无此生物学活性【15】。Tebbey等报道，G蛋白分子中184?198位氨基酸序列是激活 Th2型CD4+T细胞的功能表位，因而与VED有关【61。但Srikiatkhachom等和Johnson 等发现，G蛋白183(197位氨基酸序列可同时被Thl和Th2型CD4+T细胞识别 [8,16,171，提示G蛋白与VED相关性有待于进一步研究。 T细胞亚群除了人们熟知的CD4+T细胞和CD8+T细胞外，还有近年颇受重 视的yST细胞和调节性T细胞Treg等。CD4+T细胞和CD8+T细胞抗原受体 TCR主要为0【D。yST细胞TCR是丫6，具有不受MHC约束的杀伤病毒感染细 胞及肿瘤细胞的细胞毒作用。调节性T细胞是新近发现的负调控细胞免疫应答T 细胞亚群，CD4+和CD25+为其表面标志f18,19]。众所周知，通常灭活病毒疫苗非 VED相关病毒疫苗激活机体CD4+T细胞产生抗感染免疫。但Sandbulte等报道， 接种甲醛灭活牛呼吸道合胞病毒疫苗FI(CRSV的幼牛，CD8+T细胞被活化， 提示FI(CRSV含有激活CD8+T细胞的抗原表位‘20】。H?研究中也发现，CD8+、 Y6和调节性T细胞均参与了病毒致病及VED相关免疫病理过程[21-23】。如前所述， CD4+T细胞与FI(RSV疫苗VED有关，但CD8+、扣和调节性T细胞是否参与 2 浙江人学硕I:学位论义 弓l言 FI(RSV疫苗VED目前尚无文献报道。 综合分析上述资料，我们作出如下推测:RSVG蛋白分子中可能存在不同的抗 原表位，可分别或同时激活不同T细胞亚群;活化的T细胞亚群不同甚至活化程 度差异，可能决定了诱导VED或正常抗感染细胞免疫。 鉴于上述分析，本研究中，我们:1通过制备FI(RSV疫苗，建立BALB,c小 鼠FI(RSV相关VED模型，定义其病毒滴度、抗体水平以及病理诊断特征，旨在 为相关免疫调控机理研究提供平台;2利用基因重组方法构建了编码RSVG蛋白 基因的重组质粒pcDNA3(1G，以此免疫BALB,c小鼠，通过肺组织标本病毒滴度、 病理改变和血清抗体水平验证其免疫保护效果，采用ELISA和流式细胞技术分析 T淋巴细胞亚群分布及活化状态，旨在通过对RSVG蛋白抗原基因在机体内表达 后诱导的特异性免疫应答情况及其保护效应的分析，探讨RSVG蛋白抗原与VED 的关系，为探索RSV疫苗接种后疾病加重的相关机制以及为研制安全、有效的RSV 疫苗提供线索和实验依据。 1(2研究内容 1、RSVAl型Long株病毒的增殖培养 2、FI(RSV疫苗的制备及VED模型的建立 3、编码RSVG蛋白基因重组质粒pcDNA3(1G的构建与鉴定 4、pcDNA3(1G经体外表达后的免疫原性鉴定 4、小鼠pcDNA3(1G免疫模型建立及病毒攻击试验 5、确定pcDNA3(1G对小鼠免疫保护作用 6、T细胞亚群活化及Thl厂rh2细胞因子表达分析 1(3技术路线 1、 RSVAl型Long株病毒培养 l 空斑形成试验测定病毒滴度 上 福尔马林灭活制备FI(RSV 浙江人学颂l:学位论义 0J言 4 小鼠免疫及病毒攻击建立VED模型 从血清特异性IgG水平、肺组织病毒滴度和病理学改变三方面定义其特征 RSVAl型Long株病毒培养 病毒RNA提取 RT-PCR扩增G蛋白基因 T-A克隆、测序获得序列正确的G蛋白基因克隆 亚克隆构建编码RSVG蛋白基因的重组质粒pcDNA3(1G Westernblot鉴定体外表达目的蛋白免疫原性 建立小鼠免疫模型及病毒攻击试验 从血清特异性IgG水平、肺组织病毒滴度和病理学改变三方面确定免疫保护 性 检测不同T细胞表面标志以及IL(4、IFN7表达水平， 以确定CD4+、CDS+T细胞亚群以及Thl和,或Th2途径 浙江人学硕I:学位论文 第一部分 福尔马林灭活RSV疫苗增强忤疾粕模型 建院及特征 第一部分福尔马林灭活RSV疫苗增强性疾病模型建立及特征 第一节福尔马林灭活RSVFI(RSV的制备 1 实验材料 1(1主要仪器和设备 超净工作台GEM(SH(01 C02细胞培养箱 生物安全柜 超速冷冻离心机 台式高速低温离心机1(15K型 超低温冰箱 电热恒温水浴箱DK(8D型 微量移液器 1(2主要试剂和材料 浙江医科大学净化设备厂 Thermo Bio(Rad SIGMA SIGMA Thermo 上海精宏实验设备有限公司 EppendorfResearch MEM、DMEM、胎牛血清FCS、PBS均为GIBCO公司产品;0(25,胰酶 消化液购自碧云天Beyotime;琼脂糖agarose、氢氧化铝凝胶Aluminum hydroxideGel、福尔马林溶液、青霉素、链霉素均为Sigma公司产品;细胞 培养 瓶、细胞培养板均为BD公司产品。 1(3主要溶液配制 1(3(1 细胞培养液:DMEM+10,v，v胎牛血清+1,V,VL(谷氨酰胺+1,v,vYX 抗青霉素、链霉素 1(3(2 细胞维持液:DMEM+2,v,胎牛血清+1,v,VL(谷氨酰胺+1,v,vSg抗 青霉素、链霉素 1(3(3 覆盖胶:O(3,w,v琼脂糖溶于DMEM中，充分混匀后，45"C预热备用。 1(3(4 0(05,中性红溶液:0(05,、?,v中性红溶于PBS中，充分混匀后，0(221xm 过滤除菌。 5 浙江人学颐lj学位论义 第一部分福尔马林灭活RSV疫苗增强住疾稍模型建讧及特征 1(4细胞与病毒 Hep(2细胞ATCCCCL(23和RSV-A1Long病毒株ATCCVR(26均由本 实验室传代保存。 2实验方法 2(1 Hep(2细胞培养 2(1(1细胞的复苏 从液氮中取出一支冻存的Hep(2细胞，迅速置于37。C水浴箱中快速解冻，待 完全解冻后，1000rpm离心5-8分钟，弃上清并加入新鲜培养液，轻轻吹打混匀后， 转移到培养瓶中，补加适量培养液，置37"C、5,C02培养箱中培养过夜后换液一 次。 2(1(2细胞传代培养 待细胞长成单层后及时传代，倾去原培养液，PBS清洗2遍;加入适量25, 胰酶，均匀覆盖细胞，显微镜下观察消化情况，待细胞圆缩、相邻细胞分隔开时， 除去胰酶，及时加入新鲜培养液终止消化反应;轻缓吹打细胞，使之脱离细胞瓶 并分散形成单个细胞悬液;分装于新的细胞瓶，并补加培养液至10mL左右，置于 37。C、5,C02培养箱中培养， 2(2病毒培养 待Hep(2细胞长成单层后弃去细胞瓶中培养液，用预温的PBS清洗2遍，以 去除死亡细胞和牛血清;分别取1001(tL已连续培养3代以上的RSV病毒原液和 5009L维持液DMEM(2,FCS加入细胞瓶中，使之均匀覆盖细胞，置于37"C吸 附1(2小时，其间每隔15分钟摇动一次，使病毒充分感染细胞;再71、加8,10mL 维持液至细胞瓶中并摇匀，置37"C、5,C02培养箱中培养，每天观察细胞病变 CPE情况;当CPE达到80,tj(Z上时，收集病毒，置于(80。C冰箱反复冻融3次 后，4"C、3000rpm离心15分钟，收集上清于(80*2冰箱中保存备用。同时设立正 常Hep(2细胞对照，按同样方法处理。 2(3空斑形成试验测定病毒滴度 6 浙江人学硕I:q-:位论文 第一部分福尔马林灭活RSV疫苗增强性疾病模型建沈及特征 Hep(2细胞用5,FCS(DMEM调整浓度至1(5x106,mL，3mL,ffl(,]JIJ至6孔板中， 37。C、5,C02培养箱中培养过夜;用含2,胎牛血清的维持液将RSV作10倍系统 稀释10一,10击;吸弃6孔板中培养液，用PBS洗涤2遍后，分别取1001(tL各稀 释度病毒液和400pLPBS加至细胞单层，每个稀释度做3个复孔，摇匀，使 其布 满细胞层，置37。C孵育2小时，每隔15分钟轻轻摇晃一次;然后吸弃孔中病毒液， 再次用PBS洗涤2遍，每孔加入3mL预先配制并温浴的覆盖胶，室温待凝固后， 将细胞面朝上，倒置于37。C、5,C02培养箱中培养7,8天，每天观察细胞病变情 况;待病变明显时，每孔加入2mLl,甲醛，37。C固定过夜;小心剔除覆盖胶，用 蒸馏水轻轻冲洗3遍后，加入2mL0(05,4性红溶液，室温避光染色2小时以上或 过夜;吸弃孔中染液，用蒸馏水轻轻冲洗后，开始观察空斑数，并按下列公式计 算空斑形成单位。 空斑形成单位PFU,mL每一稀释度的平均空斑数×病毒稀释度的倒数,每 孔病毒接种量mL 2(4福尔马林灭活RSV 取足量RSV，按1:4000“v比例加入福尔马林溶液，置于37?水浴摇床 100rpm灭活3天;再用0(221(tm过滤器将灭活后的病毒过滤去除杂质，4。C、18000rpm 超速冷冻离心l小时，弃上清;在RSV沉淀中加入1,25原体积的无血清MEM重 悬，吹打混匀;然后按4mg,mL、?,v浓度加入氢氧化铝凝胶，室温沉淀30分钟 至l小时或过夜后，4"C、10009约3000rpm离心30分钟，弃上清;在沉淀中 加入1,4体积1,100原体积的无血清MEM重悬，4。C保存备用。 3实验结果 以RSVA1Long标准株接种Hep(2细胞，传代3次，获得稳定细胞病变:细 胞在感染后5天出现融合、形成合胞图1。以空斑形成试验图2测定病毒 滴度为lxl07PFU,mL。通过超速离心法浓缩病毒，使其滴度成为108PFU,mL。 浙江夫颇l位论女 第一部分?尔马林火括RSV瞳苗蜡性性疾|内模型建t,特机 A 田lRSV接种Hep-2细胞出现细胞病变效应 Fig-1cytopathiceffectCPEofHep?2cellsinfectedbyRSV 注A:正常Hep-2细胞;B:感染RSV的Hep-2细胞 围2空斑形成实验结果 Fig(2Theresultorplaqueformationassay 注:左:感染孔:右对照孔 第二节BALB,c小鼠VED模型建立及其特征 1实验材料 I(1病毒和实验动物 RSV-AILong病毒株ATCCVR一26由本实验室传代保存，6?8周龄、雌性 8 浙江人学顾(1:学位论文 第一部分福尔马林灭活RSV疫苗增强件疾痫模型 建t及特征 的SPF级BALB,c小鼠购自浙江大学实验动物中心。 1(2主要仪器和设备 超净工作台GEM(SH?01 浙江医科大学净化设备厂 C02细胞培养箱Thermo 超低温冰箱Thermo 生物安全柜 Bio(Rad 台式高速低温离心机1(15K型 SIGMA 电热恒温水浴箱DK(8D型 上海精宏实验设备有限公司 实时荧光定量PCR仪Option2 MJResearch 酶标仪 Bio(Rad 荧光显微系统 德国蔡司 1(3主要试剂、材料和试剂盒 RPMI1640、DMEM、胎牛血清FCS、PBS均为GIBCO公司产品;poly?L?lysine 为华美生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 公司产品;ELISA用显色液TMB、终止液2NH2S04均购自 珠海海泰生物制药有限公司;HRP标记羊抗鼠IgG为Beyotime公司产品; HRP标 记羊抗兔IgG为Jackson公司产品;ReansyMini试剂盒购自Qiagen公司; Titan? OneTubeRT-PCRSystem试剂盒为TaKaRa公司产品;组织研磨棒，96孔酶标板， 各种型号细胞培养板。 1(4 ELISA用试剂配制 1(4(1包被缓冲液:PBS或o(5MNa2C03一NaHC03，pH9(6 1(4(2洗涤液PBST:PBS+0(05,Tween20，pH6(8 1(4(3样品稀释液:PBST+I,BSA 1(4(4封闭液:PBS+0(05,Tween20+1,BSA 1(4(5显色液:TMB海泰生物 1(4(6终止液:2NH2S04海泰生物 9 浙江人学颂t-q:位论文 第一部分福尔马林灭活RSV疫苗增强傩疾稍模型建t及特征 2实验方法 2(1动物免疫 SPF级BALB,c小鼠，雌性，6,8周龄或14(16周龄，体重分布21(239，由浙 江大学动物实验中心提供。将6-8周龄雌性BALB,c小鼠随机分为3组，每组6只， 1PBS对照组;2FI-Hep2对照组;3FI(RSV免疫组。各组小鼠分别经肌肉注 射509LPBS、FI(Hep2或FI(RSV，每隔2周加强免疫一次，共免疫3次。末次免 疫后2周，各组处死2只，经眼球采血分离血清，并摘取肺组织。其余小鼠进行 病毒攻击实验。 2(2病毒攻击实验 攻击实验用的病毒如前1(2(1在Hep一2细胞上培养获得1×107PFU，将其经 50，000×g，4。C超速离心lh后，10倍浓缩为1×108PFU。末次免疫后2周，以0(06 mg,kg腹腔注射1,戊巴比妥钠麻醉后进行病毒攻击，每只小鼠经鼻腔滴入50?L 5x106PFURSV悬液。感染5d后分别处死，收集血清及肺组织标本。同时设立14(16 周龄雌性小鼠为正常对照，以等量Hep一2细胞裂解液鼻腔滴入。 2(3样品的处理 2(3(1 血清的分离:采血后一旦血清析出，应立即将血清与血细胞分离，否则细 胞将溶解而释放出蛋白水解酶，降低效价。血液置室温中凝固1小时，然后46C过 夜，使血块收缩，将血块自容器壁分离，再4。C2000rpm离心10分钟，取上清液 一20。C保存。 2(3(2肺组织标本 2(3(3(1肺组织块:取小鼠右肺分离右下叶，PBS漂洗后作病理学切片用。 2(3(3(2肺匀浆上清:将小鼠剩余右肺称重后，用剪刀剪碎，置匀浆器中，加lmL 细胞维持液，在冰浴中匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清(80。C保存备用。 2(4 ELISA检测血清IgG抗体滴度 1包被抗原:以紫外灭活RSV1:5稀释，2×105PFU,孔作为抗原，1009l 每孔加入96孔酶标板孔中，4。C包被过夜; 2洗去多余抗原:倒去孔中多余液体，多层吸水纸上拍打几次，加PBST3001aL, 10 浙江大学顾(1:学位论文 第一部分福尔马林灭活RSV疫苗增强性疾病模型建一及特征 孔，摇晃酶标板，轻轻摇动3分钟，再在吸水纸上拍打数下至完全无剩余液体， 重复操作3次; 3封闭:每孔加入200pl封闭液，37。C放置2小时; 4洗去多余封闭液:方法同上，重复3次 5加一抗血清样品:将待测血清从1:20开始作lO倍系列稀释至1:2000000， 共6个稀释度，每孔加入1009l，每个稀释度作2复孔，37"C放置2小时; 6洗去为结合的一抗:重复4次 7加二抗:用PBS现配适当稀释度的二抗HRP一山羊抗小鼠IgG，l:250， 每孔加入100yL，37?作用l,2小时; 8洗去为结合的二抗:重复4次 9显色:每孔分别滴加显色液A和B海泰生物各1滴约509L，避光 显色10分钟; 10终止反应:每孔滴加一滴约5091终止液2MH2S04，海泰生物，轻 轻混匀; 11读板并记录结果:立即在酶标仪上450nm处测定OD值A值，打印结 果。 2(5荧光定量RT-PCR检测小鼠肺组织病毒RNA水平 1RNA提取:取小鼠肺匀浆上清，用ReansyMini试剂盒提取病毒RNA，操 作按照试剂盒说明书进行，最后以509L无菌去离子水洗脱。 2RealtimeRT-PCR:采用Tit矗刑OneTubeRT-PCRSystem试剂盒，在MJ Option2荧光定量PCR仪上进行反应。反应体系:5x缓冲液5pL，dNTPmixeach 2(5mmol,L29L，DTT1(251aL，RNaseInhibitor0(51(tL，Enzymemix0(59L，20pmol 的上下游引物各lgL，探针0(7pL，RNA109L，加双蒸水至259L。反应条件: 50*C30min，94。C2min后94。C5s，51?1min，扩增40个循环，每个循环结束时进 行荧光检测。荧光定量PCR引物探针序列参考Dewhurst(MaridorG等【24】合成。同 时制备标准品建立标准曲线，根据标准品拷贝数的对数和循环阈值ct值生成 标准曲线。 浙江人学硕I:学位论文 第一部分福h;-5林灭活RSV疫苗增强件疾病模型建征及特征 2(6小鼠肺组织病理学检查HE染色 取右肺下叶置于10,福尔马林中固定，常规石蜡包埋，做成4“m厚度的切片， 用HE染色。显微镜下通过对肺脏炎性细胞浸润和肺泡壁厚度分析以评估肺组织病 理学情况。 2(7统计学处理 使用SPSSl2(0软件进行统计学分析，数据以均数土标准差表示，组件比较采 用t检验方法，P0(01表示具有统计学显著性差异。 3实验结果 3(1感染肺病毒含量 末次免疫后2周后，以50I(tL5x106PFURSV滴鼻感染小鼠，5d后提取肺匀浆 上清中病毒RNA，采用荧光定量RT-PCR检测小鼠肺组织病毒滴度结果表明:PBS 对照组小鼠感染RSV即单纯RSV感染小鼠5d后，肺组织标本病毒含量为 3(49士0(19109TCID50?g-1;FI(Hep2对照组小鼠感染后的肺组织标本病毒滴度为 2(63+0(29109TCID50?g-1;FI-RSV免疫小鼠感染后其肺组织标本病毒含量为 0(96士0(16l0910TCID50?g-1。和PBS对照小鼠以及FI?Hep2对照小鼠相比，FI(RSV 免疫小鼠肺组织病毒滴度平均值分别降低了2(53IogTCID50及1(67109TCID50 P0(01，图3。 12 A 浙江人学烦l:学位论文 第一部分福尔马林灭活RSV疫苗增强件疾痫模型建沈及特征 B E a o ? o U 卜 口 o ? 皇 卜 瓣 ， 三 图3荧光定量RT-PCR检测小鼠肺组织病毒滴度结果 Fig(3RSVtitresinmicelungdetectedbyreal-timeRT-PCR 注:a(:FI?RSV免疫小鼠感染RSV后，肺匀浆荧光定量RT-PCR扩增的标准曲线。b:RSV病毒 滴度比较，幸与PBS、FI(Hep2对照组相比，P0(01。 3(2病理学检查结果 显微镜下观察经HE染色肺病理切片，结果显示:正常对照小鼠肺泡结构完整、 肺泡壁、细支气管壁正常，仅见少量炎性细胞图4a,b。其余小鼠经RSV攻击后， PBS对照组以细支气管周围炎为主要表现，细支气管周围可见炎性细胞浸润，肺 泡壁正常，未见增厚图4c，d;FI?Hep2对照组小鼠肺部病理改变与PBS对照组 类似，以支气管周围淋巴细胞浸润为主要表现图4e，f;FI(RSV免疫组表现为比 单纯RSV更为广泛的肺部炎症病变，肺泡壁和细支气管周围均有大量淋巴细 胞浸 润，此外亦有中性粒细胞，包括少量嗜酸性细胞浸润，肺泡壁及气管壁明显增厚， 局部出现肺气肿图49，h，i,j。 浙?^?"?l学位论女 ?一部H楫皋q林^活RSV擅*增?件瘴稿接型建t盐特缸 圈4FI?RSV免疫小鼠密荣RsV后胂蛆轵病理表现髓染色，x100a南e盛i或x400b,d,f,h,j( Fi94PathologyofFI-RSVimmunizedBalb,CmicechallengedbyRSV(H&Eslain，×100a(c(e， g，1orx400h，d，‘h，1 注:a,b正常对照c,dPBs对照g，hH?Hep2j十Ne,f,i,jR-Rsv免疫箭头所指为嗜酸性粒细 胞 浙江人学硕lj学位论文 第一部分福尔马林灭活RSV疫苗增强性疾炳模型建t及特征 3(3血清抗(RSVIgG抗体水平 以紫外灭活RSV为抗原，ELISA结果显示:PBS对照组小鼠体内无抗(RSV IgG，经RSV攻毒5d后抗RSVIgG水平略有升高;FI(Hep2对照组小鼠体内有一 定量抗体，与PBS免疫小鼠相比无明显差异P0(05，随着RSV感染其滴度亦 略有升高;FI?RSV免疫小鼠产生大量抗(RSVIgGPO(01，但经RSV攻毒5d 后， 其抗体水平显著下降P0(01图5。 塞 麓 》 ? 兰 援 瘟 C m 蓑 唁 8 “m emuol,PS$FI"H绅Z fl't琶V ?aA珂矗黜啪旧靠谴酬醯啡 口l|翰确融啡 图5 ELISA检测免疫小鼠RSV感染前后血清抗RSVIgG抗体水平 Fig(5AntibodyproductionofBalb, cmiceimmunizedbyFI?RSVandafterRSVchallenge( DatapresentedasmeanadsorptionvalueatOD450withstandarder or( 注:数据以平均值士标准差表示，与PBS、FI(Hep2对照组相比，P0(01; 8与RSV攻击后相 比，P0(01 15 6 4 2 l 霉 6 4 2 O l 1 l O 霉 O 霉 浙江人学颀l:学位论义 第二部分呼吸道合胞瘸毒G蛋[J壤I大l重组质 粒免疫特征 第二部分呼吸道合胞病毒G蛋白基因重组质粒免疫特征 第一节RSVG蛋白基因重组质粒的制备 1 实验材料 1(1主要仪器和设备 超净工作台GEM(SH(01 浙江医科大学净化设备厂 生物安全柜 Bio(Rad 台式高速低温离心机1(15K型 SIGMA 电热恒温水浴箱DK(8D型 上海精宏实验设备有限公司 生化培养箱LRH(250(A型 广东省医疗器械厂 PCR扩增仪GeneAmpPCRSystem2400PerkinElmer 水平式电泳槽 上海天能科技有限公司 电泳仪DYY-6C 北京市六一仪器厂 紫外投射分析仪WFH(202 上海精科实业有限公司 凝胶成像系统IS1000 Bio(RadLaboratoriesItalyviaCellini 紫外分光光度计GeneQu