腊肉从原料到餐桌的微生物检验

腊肉从原料到餐桌的微生物检验 腊肉从原料到餐桌的微生物检验 腌腊肉制品，一种传统的食品，也是一种传统的工艺。相对于现代人来讲，腌腊肉制品并非一种过时的食品，它依然是不可或缺的食品。 腊肉的加工工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 : 选料休整?配料?腌制?滚揉?绞切?搅拌?充填?烘烤?蒸煮?熏制?冷却?真空包装?成品 1、感官要求 按国标GB/T5009.44规定的方法检验 一级鲜度 二级鲜度 色泽鲜明，肌肉呈鲜红色或暗色泽稍淡，肌肉呈暗红色或咖啡色，脂肪呈色泽 红色，脂肪透明或呈乳白色 乳白色， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面可以有霉点，但抹后无痕迹 组织肉身干爽，结实 肉身稍软 状态 气味 具有广式腊味固有的风味 风味略减，脂肪有轻度酸败味 2、理化检验 (1)亚硝酸盐 按GB/T 5009.33规定的方法测定。 主要仪器:小型绞肉机、分光光度计 (2)水分 GB/T5009.3---2003 主要仪器:干燥箱，分析天平 (3)过氧化值 样品处理按GB/T 5009.44规定的方法操作，按GB/T 5009.37 规定的方法测定。 主要仪器:碱式滴定管、小型绞肉机 (4)铅 GB/T5009.12---2003 主要仪器:原子吸收分光光度计、马福炉或恒温干燥箱、瓷坩埚或压力消化器、微波消解装置、分析天平 (5)无机砷 GB/T5009.11—2003 主要仪器:可见分光光度计、测砷装置 (6)镉 GB/T5009.15---2003 主要仪器:马福炉、恒温干燥箱、瓷坩埚或压力消化器、可调式电热板、可调式电炉、原子吸收分光光度计。 (7)汞(以Hg计) GB/T5009.17---2003 主要仪器:双光束测汞仪、压力消化器、分析天平、恒温干燥箱。 (8)添加剂 符合GB2760 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 规定 a.护色剂:亚硝酸钠(钾)和硝酸钠(钾) GB/T5009.33—2003 主要仪器:分光光度计、组织捣碎机。 b.水分保持剂:磷酸钠、六偏磷酸钠和三聚磷酸钠 GB1890—2005 主要仪器:酸度计 :精度，0 2pH单位，配有饱和甘汞电极和玻璃电极，氟 电极电位计，磁力搅拌器。 c.增稠剂:明胶和卡拉胶 GB15044—1994 主要仪器:离心管、电炉、红外吸收光谱仪。 d.防腐剂:山梨酸GB/T5009.29—2003 主要仪器:分光光度计、组织捣碎机。 e.着色剂:高梁红GB9993—2005.红曲米GB4929—1985,红曲红GB15961 —2005 主要仪器:分光光度计、微量注射器或色素吸管、展开槽，25 X 6 x 4cm4、 层析缸、滤纸、中速滤纸，纸色谱用、薄层板:5 X 20em 、电吹风机 、水泵 3、微生物检验 (1)菌落总数 按GB/T 4789.2-2010规定的方法检 主要仪器:天平、培养箱、显微镜、均质器。 (2)乳酸菌 按GB/T 4789.35-2010规定的方法检 主要仪器:天平、培养箱、显微镜、均质器、水浴锅。 (3)大肠杆菌 按GB/T 4789.3-2010规定的方法检验 主要仪器:天平、培养箱、显微镜、均质器、水浴锅。 (4)沙门氏菌。按GB/T 4789.4-2010规定的方法检验 主要仪器:天平、培养箱、显微镜、均质器。 (5)志贺氏菌。按GB/T 4789.5-2011规定的方法检验 主要仪器:天平、培养箱、显微镜、均质器。 (6)金黄色葡萄球菌。按GB4789.10-2010规定的方法检验 主要仪器:天平、培养箱、显微镜、离心机、均质器。 (7)酵母菌和霉菌。按GB4789.15-2010规定的方法检验 主要仪器:天平、培养箱、显微镜、离心机、均质器。 4、检验指标和合格要求 项 目 指 标 水分(%) ?25 食盐(%，以NaCl计) ?10 铅(Pb)，mg/kg ? 0(5 无机砷，mg/kg ? 0(05 镉(Cd)，mg/kg ? 0(1 汞(以Hg计)，mg/kg ? 0(05 亚硝酸盐(以NaNO计)，mg/kg ? 30 2 过氧化值(以脂肪计)，g/100g ? 0(25 大肠菌群，MPN/100g ? 30 致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色不得检出 葡萄球菌) 注:净含量应符合国家质量监督检验检疫总局第75号令《定量包装商品计 量监督 管理办法 关于高温津贴发放的管理办法稽核管理办法下载并购贷款管理办法下载商业信用卡管理办法下载处方管理办法word下载 》的规定。 样品的菌落总数的检验 (一)选择检验方法: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 1 范围 本标准规定了食品中菌落总数(Aerobic plate count)的测定方法。 本标准适用于食品中菌落总数的测定。 2 术语和定义 2.1 菌落总数 aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后，所得每g (mL)检样中形成的微生物菌落总数。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 3.1 恒温培养箱:36 ??1 ?，30 ??1 ?。 3.2 冰箱:2 ?,5 ?。 3.3 恒温水浴箱:46 ??1 ?。 3.4 天平:感量为0.1 g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。 3.7 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶:容量250 mL、500 mL。 3.9 无菌培养皿:直径90 mm。 3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3.11 放大镜或/和菌落计数器。 4 培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基:见附录A 中A.1。 4.2 磷酸盐缓冲液:见附录A 中A.2。 4.3 无菌生理盐水:见附录A 中A.3。 5 检验程序 菌落总数的检验程序见图1。 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品:称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min,10000 r/min 均质1 min,2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min,2 min，制成1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个,3 个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 6.1.6 及时将15 mL,20 mL 冷却至46 ?的平板计数琼脂培养基(可放置于46 ??1 ?恒 温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 6.2 培养 6.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ??1 ?培养48 h?2 h。水产品30 ??1 ?培养72 h?3 h。 6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4 mL)，凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。 6.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units，CFU)表示。 6.3.1 选取菌落数在30 CFU,300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 7 结果与报告 7.1 菌落总数的计算方法 7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中菌落总数结果。 按下列公式计算: 7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时， ,CN,，，n，0.1nd12 式中: N——样品中菌落数; ΣC——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和; n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数; n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数; d——稀释因子(第一稀释度)。 示例: 稀释度 1:100(第一稀释度) 1:1000(第二稀释度) 菌落数(CFU) 232，244 33，35 C,232，244，33，35544N,,,,24727,2，，nnd,,，，，0.10.0222，0.1，2，1012 上述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5?104 7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.1.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。 7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU,300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.2 菌落总数的报告 7.2.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 7.2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数;也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采 用两位有效数字。 7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 7.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 7.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。 附录A(规范性附录) 培养基和试剂 A.1 平板计数琼脂(plate count agar，PCA)培养基 A.1.1 成分 胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 琼 脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.0?0.2 A.1.2 制法 分装试管或锥形瓶，121 ?高压灭菌15 min。 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。 A.2 磷酸盐缓冲液 A.2.1 成分 磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0 g 蒸馏水 500 mL pH 7.2 A.2.2 制法 贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化 钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。 稀释液:取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ?高压灭菌15 min。 A.3 无菌生理盐水 A.3.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.3.2 制法 称取8.5,氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ?高压灭菌15 min。 乳酸菌的检测 1 范围 本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(c acid bactelactiria )的检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日 期的版本 适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标 准。 3 术语和定义 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属 (Lactobacillus)、 双歧杆菌属(Bifidobacterium)和链球菌属(Streptococcus )。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 4.1 恒温培养箱:36 ??1 ?。 4.2 冰箱:2 ?,5 ?。 4.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 4.4 天平:感量 0.1 g。 4.5 无菌试管:18 mm?180 mm 、15 mm?100 mm 。 4.6 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL (具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 4.7 无菌锥形瓶:500 mL、250 mL。 5 培养基和试剂 5.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)培养基及莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良 MRS培养 基:见附录 A 中A.1。 5.2 MC培养基(Modified Chalmers 培养基):见附录A 中A.2。 5.3 0.5 %蔗糖发酵管:见附录 A 中A.3。 5.4 0.5 %纤维二糖发酵管:见附录 A 中A.3。 5.5 0.5 % 麦芽糖发酵管:见附录 A 中A.3。 5.6 0.5 % 甘露醇发酵管:见附录 A 中A.3。 5.7 0.5 %水杨苷发酵管:见附录A中A.3。 5.8 0.5 %山梨醇发酵管:见附录A中A.3。 5.9 0.5 %乳糖发酵管:见附录A中A.3。 5.10 七叶苷发酵管:见附录A中A.4。 5.11 革兰氏染色液:见附录A中A.5。 5.12 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin):化学纯。 6 检验程序 乳酸菌检验程序见图1 。 图1 乳酸菌检验程序图 7 操作步骤 7.1样品制备 7.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 7.1.2 冷冻样品可先使其在 2 ?,5 ?条件下解冻，时间不超过 18 h ，也可在温度不超过 45 ?的条件解冻，时间不超过15 min 。 7.1.3 固体和半固体食品:以无菌操作称取 25 g 样品，置于装有 225 mL生理盐水的无菌均质杯内， 于8000 r/min,10000 r/min 均质1 min,2 min，制成 1:10 样品匀液;或置于 225 mL生理盐水的无菌均 质袋中，用拍击式均质器拍打1 min,2 min 制成1:10 的样品匀液。 7.1.4 液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有225 mL 生理盐 水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。 7.2 步骤 7.2.1 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 7.2.2 另取1 mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做 10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1 次1 mL灭菌吸管或吸头。 7.2.3 乳酸菌计数 7.2.3.1 乳酸菌总数 根据待检样品活菌总数的估计，选择2 个,3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL样品匀液分别置于2 个MRS琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。36 ?1 ??，厌氧培养 48 h?2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min 内完成。 7.2.3.2 双歧杆菌计数 根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择 2 个,3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL样品匀液于莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良MRS琼脂平板，使用灭菌L 形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板。36 ?1 ??，厌氧培养 48 h?2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15 min 内完成。 7.2.3.3 嗜热链球菌计数 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2 个,3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL样品匀液分别置于2 个MC琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。36 ?1 ?， ?2 h 后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为:菌落中等偏需氧培养 48 h 小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2 mm?1 mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在15 min 内完成。 7.2.3.4 乳杆菌计数 7.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2 项双歧杆菌与7.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。 7.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units ，CFU )表示。 7.3.1 选取菌落数在 30 CFU,300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 7.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2 ，代表一个平板菌落数。 7.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 7.4 结果的表述 7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g (mL)中菌落总数结果。 7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1 )计算: „„„„„„„„„„„„„„„„(1) 式中: N ——样品中菌落数; ? C ——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和; n ——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数; 1 n——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数; 2 d ——稀释因子(第一稀释度)。 7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU ，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.4.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。 7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU,300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU 时，则以最接近30 CFU或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.5 菌落数的报告 7.5.1 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 7.5.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用0 代替位数;也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 7.5.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。 8 结果与报告 根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g (mL)表示。 9 乳酸菌的鉴定(可选做) 9.1 纯培养 挑取3 个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于 MC琼脂平板，乳杆菌属接种于 MRS琼脂平板，置 36 ??1 ?厌氧培养 48 h 。 9.2 鉴定 9.2.1 双歧杆菌的鉴定按 GB/T 4789.34 的规定操作。 9.2.2 涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为 0.5 μ m,2.0 μ m，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。 9.2.3 乳酸菌菌种主要生化反应见表 1 和表2 。 附录 A (规范性附录) 培养基及试剂 A.1 MRS培养基 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温80 1.0 mL K HPO ?7HO 2.0 g 2 42 醋酸钠?3HO 5.0 g 2 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO4?7HO 0.2 g 2 MnSO4?4HO 0.05 g 2 琼脂粉 pH 6.2 15.0 g A.1.2 制法 将上述成分加入到1000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后 121 ?高压灭菌 15 min ,20 min 。 A.1.3 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良MRS培养基 A.1.3.1 莫匹罗星锂盐( Li-Mupirocin)储备液制备:称取 50mg 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)加入到50 mL 蒸馏水中，用0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌。 A.1.3.2 制法 将A.1.1 成分加入到 950 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后于121 ?高压灭菌 15 min ,20 min 。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至48 ?，用带有 0.22 μm 微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)储备液加入到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗 星锂盐(Li-Mupirocin)的浓度为50 μg/mL。 A.2 MC培养基 A.2.1 成分 大豆蛋白胨 5.0 g 牛肉粉 3.0 g 酵母粉 3.0 g 葡萄糖 20.0 g 乳糖 20.0 g 碳酸钙 10.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000 mL 1 ,中性红溶液 pH6.0 5.0 mL A.2.2 制法 将前面7 种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节 pH，加入中性红溶液。分装后 121 ?高 压灭菌15 min,20 min 。 A.3 乳酸杆菌糖发酵管 A.3.1 基础成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 吐温80 0.5 mL 琼脂 1.5 g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL 蒸馏水 1 000 mL A.3.2 制法 按0.5%加入所需糖类，并分装小试管,121 ?高压灭菌 15 min ,20 min 。 A.4七叶苷发酵管 A.4.1 成分 蛋白胨 5.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 七叶苷 3.0 g 柠檬酸铁 0.5 g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL 蒸馏水 100 mL A.4.2 制法 将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，121 ?高压灭菌 15 min,20 min。 A.5革兰氏染色液 A.5.1 结晶紫染色液 A.5.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95,乙醇 20 mL 1 ,草酸铵水溶液 80 mL A.5.1.2 制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.5.2 革兰氏碘液 A.5.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.5.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。 A.5.3 沙黄复染液 A.5.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95,乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.5.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.5.4 染色法 A.5.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min，水洗。 A.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。 A.5.4.3 滴加 95 ,乙醇脱色，约 15 s ,30 s ，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 A.5.4.4 滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。 大肠菌群的检验 (一)、大肠菌群的生物学特性 1.形态与染色:革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。 2.发酵乳糖产酸产气 3.培养特性:在伊红美兰琼脂(,,,)上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形， 稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽; 在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。 (二)、大肠菌群检验方法及操作方法 国家标准: 三步法:乳糖胆盐发酵试验?分离培养?证实试验(乳糖发酵试验、革兰氏染色) (三)餐具大肠菌群快速检验(纸片法) 使 用 方 法 : 1. 采样6—10份。 碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，30秒后取下，置于原塑料袋内。筷子以5只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端(约5cm)抹拭两张，放入原塑料袋内。 2.将已采样的纸样置于37?C培养15小时. 纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格。 沙门氏菌的检验 1、地位:是肠杆菌科、埃希氏菌族、沙门氏菌属中的细菌 2、定义 是肠杆菌科中形态和培养特征，生化反应及抗原结构相似，被O1噬菌体裂解的一群革 兰氏阴性杆菌。国家标准GB 4789.4-2003 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验 (一)、形态与染色: 革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。 (二)、培养特性 1、需氧或兼性厌氧，最适温度37?，PH7.2~7.4。 2、对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37 ?，24h，能形成菌落中等大小，直径2, 3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落 3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。 依据 GB 4789.4—2010《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 1 范围 本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。 本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 2.1 冰箱:2 ?,5 ?。 2.2 恒温培养箱:36 ??1 ?，42 ??1 ?。 2.3 均质器。 2.4 振荡器。 2.5 电子天平:感量0.1 g。 2.6 无菌锥形瓶:容量500 mL，250 mL。 或微量移液器及吸头。 2.7 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)2.8 无菌培养皿:直径90 mm。 2.9 无菌试管:3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。 2.10 无菌毛细管。 2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 2.12 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水(BPW): 见附录A 中A.1。 3.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见附录A 中A.2。 3.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见附录A 中A.3。 3.4 亚硫酸铋(BS)琼脂:见附录A 中A.4。 3.5 HE 琼脂:见附录A 中A.5。 3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见附录A 中A.6。 3.7 沙门氏菌属显色培养基。 3.8 三糖铁(TSI)琼脂:见附录A 中A.7。 3.9 蛋白胨水、靛基质试剂:见附录A 中A.8。 3.10 尿素琼脂(pH 7.2):见附录A 中A.9。 3.11 氰化钾 (KCN) 培养基:见附录A 中A.10。 3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基:见附录A 中A.11。 3.13 糖发酵管:见附录A 中A.12。 3.14 邻硝基酚β-D 半乳糖苷(ONPG)培养基:见附录A 中A.13。 3.15 半固体琼脂:见附录A 中A.14。 3.16 丙二酸钠培养基:见附录A 中A.15。 3.17 沙门氏菌O 和H 诊断血清。 3.18 生化鉴定试剂盒。 4 检验程序 沙门氏菌检验程序见下图。 5 操作步骤 5.1 前增菌 称取25 g(mL)样品放入盛有225 mL BPW 的无菌均质杯中，以8 000 r/min,10 000 r/min 均质1 min,2 min，或置于盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min,2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH 值，用1 mol/mL 无菌NaOH 或HCl 调pH 至6.8?0.2。 无菌操作将样品转至500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 ??1 ?培养8 h,18h。如为冷冻产品,应在45 ?以下不超过15 min,或2 ?,5 ?不超过18 h 解 冻。 5.2 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB 内，于42 ??1 ?培养18 h,24h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC 内，于36 ??1 ?培养18 h,24 h。 5.3 分离 分别用接种环取增菌液1 环，划线接种于一个BS 琼脂平板和一个XLD 琼脂平板(或HE ?1 ?分别培养18 h,24 h (XLD 琼脂琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于36 ? 平板、HE 琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板) 或40 h,48 h (BS 琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。 选择性琼脂平板 沙门氏菌 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色，BS琼脂 有些菌株形成灰绿色的‎‎菌落，周围培养基不变 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色，有些菌株为黄色，中心黑HE琼脂 色或几乎全黑色 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中XLD琼脂 心，或呈现全部黑色的菌落，有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心 沙门氏菌属显色培养基 按照显色培养基的说明‎‎进行判定 表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 5.4 生化试验 5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 ??1 ?培养18 h,24 h，必要时可延长至48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。 三塘铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养‎‎基 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 ，(,) ，(,) ， 可疑沙门氏菌属 K A ，(,) ，(,) , 可疑沙门氏菌属 K A ，(,) ，(,) ， 可疑沙门氏菌属 A A ，/, ，/, , 非沙门氏菌 A A ，/, ，/, ，/, 非沙门氏菌 K K 注:K:产碱;A:产酸;，:阳性;,:阴性;，(,):多数阳性，少数阴性;，/,:阳性或阴性 表2 沙门氏菌属在三塘铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 (供做靛基质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 ??1 ?培养18 h,24 h，必要时可延长至48 h，按表3 判定结果。将已挑菌落的平板储存于2 ?,5 ?或室温至少保留24 h，以备必要时复查。 反应序号 硫化氢(HS) 靛基质 pH 7.2尿素 氰化钾(KCN) 赖氨酸脱羧酶 2 ， , , , ， A1 ， ， , , ， A2 , , , , ，/, A3 注:，:阳性;,:阴性;，/,:阳性或阴性 表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 5.4.2.1 反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项中有1项异常，按表4 可判定为沙门氏菌。 如有2 项异常为非沙门氏菌。 赖氨酸脱羧pH 7.2尿素 氰化钾(KCN) 判定结果 酶 甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结, , , 果 , ， ， 沙门氏菌?或?(要求符合本群生化特性 ， , ， 沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果) 注:，:阳性;,:阴性 表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 5.4.2.2 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 5.4.2.3 反应序号A3:补做ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 5.4.2.4 必要时按表5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。 项目 ? ? ? ? ? ? 卫矛醇 ， ， , , ， , 山梨醇 ， ， ， ， ， , 水杨苷 , , , ， , , , , ， , ， , ONPG 丙二酸盐 , ， ， , , , , , , ， ， , KCN 注:，:阳性;,:阴性 表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别 5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.4.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.5 血清学鉴定 5.5.1 抗原的准备 一般采用1.2,,1.5,琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 (如2,,3,) 培养基上再检查;如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O 凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在0.55,,0.65,半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有0.3,,0.4,半固体琼脂的小玻管1 次,2次，自远端取菌培养后再检查。 5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定 在玻片上划出2 个约1 cm×2 cm 的区域，挑取1 环待测菌，各放1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1 滴多价菌体(O)抗血清，在另一区域下部加入1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定 同5.5.2。 5.5.4 血清学分型(选做项目) 5.5.4.1 O抗原的鉴定 用A,F 多价O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。 被A,F 多价O 血清凝集者，依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2 和O11 因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O 群。被O3、O10 血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19 单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个O 抗原成分的最后确定均应根据O 单因子血清的检查结果，没有O 单因子血清的要用两个O 复合因子血清进行核对。 不被A,F 多价O 血清凝集者，先用9 种多价O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O 群血清逐一检查，以确定O 群。每种多价O 血清所包括的O 因子如下: O 多价1 A，B，C，D，E，F，群 (并包括6,14 群) O 多价2 13，16，17，18，21 群 O 多价3 28，30，35，38，39 群 O 多价4 40，41，42，43 群 O 多价5 44，45，47，48 群 O 多价6 50，51，52，53 群 O 多价7 55，56，57，58 群 O 多价8 59，60，61，62 群 O 多价9 63，65，66，67 群 5.5.4.2 H 抗原的鉴定 属于A,F 各O 群的常见菌型，依次用表6 所述H 因子血清检查第1 相和第2 相的H 抗原。 O群 第1相 第2相 无 A a g，f，s 无 B i，b，d B 2 k，v，r，c 5，Z15 C1 b，d，r 2，5 C2 D(不产气的) 无 d D(产气的) g，m，p，q 无 b，v 6，w，x E1 g，s，t 无 E4 E4 i 表6 A,F群常见菌型H抗原表 不常见的菌型，先用8 种多价H 血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H 因子血清逐一检查，以第1 相和第2 项的H 抗原。8 种多价H 血清所包括的H因子如下: H 多价1 a，b，c，d，i H 多价2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51 H 多价3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40 H 多价4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6 H 多价5 z4z23，__________z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38 H 多价6 z39，z41，z42，z44 H 多价7 z52，z53，z54，z55 H 多价8 z56，z57，z60，z61，z62 每一个H 抗原成分的最后确定均应根据H 单因子血清的检查结果，没有H 单因子血清的 要用两个H 复合因子血清进行核对。 检出第1 相H 抗原而未检出第2 相H 抗原的或检出第2 相H 抗原而未检出第1 相H 抗原的,可在琼脂斜面上移种1,2 代后再检查。如仍只检出一个相的H 抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。 位相变异试验方法如下: 小玻管法: 将半固体管(每管约1 mL,2 mL) 在酒精灯上溶化并冷至50 ?，取已知相的H因子血清0.05 mL,0.1 mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1:200,1:800 的量加入。 小倒管法:将两端开口的小玻管 (下端开口要留一个缺口，不要平齐) 放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50 ?，挑取因子血清1 环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1,软琼脂斜面，于37 ?培养后再做凝集试验。 简易平板法:将0.35,,0.4,半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1 环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。 5.5.4.3 Vi 抗原的鉴定 用Vi 因子血清检查。已知具有Vi 抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。 5.5.4.4 菌型的判定 根据血清学分型鉴定的结果，按照附录A 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。 6 结果与报告 综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。 附录A(规范性附录) 培养基和试剂 A.1 缓冲蛋白胨水(BPW) A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠(含12 个结晶水) 9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.2?0.2 A.1.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 ?，15min。 A.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液 A.2.1 基础液 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 3.0 g 碳酸钙 45.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.0?0.2 除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌1 21 ?，20 min。 A.2.2 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠(含5 个结晶水) 50.0 g 蒸馏水 加至100 mL 高压灭菌121 ?，20 min。 A.2.3 碘溶液 碘 片 20.0 g 碘化钾 25.0 g 蒸馏水 加至100 mL 将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后 加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。 A.2.4 0.5,煌绿水溶液 煌绿 0.5 g 蒸馏水 100 mL 溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。 A.2.5 牛胆盐溶液 牛胆盐 10.0 g 蒸馏水 100 mL 加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121 ?，20 min。A.2.6 制法 基础液 900 mL 硫代硫酸钠溶液 100 mL 碘溶液 20.0 mL 煌绿水溶液 2.0 mL 牛胆盐溶液 50.0 mL 临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加 入另一种成分。 A.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液 A.3.1 成分 蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 磷酸氢二钠 10.0 g 亚硒酸氢钠 4.0 g L-胱氨酸 0.01 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.0?0.2 A.3.2 制法 除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55 ?以下，以无菌 操作加入亚硒酸氢钠和1 g/L L-胱氨酸溶液溶液10 mL(称取0.1 g L-胱氨酸，加1 mol/L 氢 氧化钠溶液15 mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至100 mL 即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍)。摇匀，调节pH。 A.4 亚硫酸铋(BS)琼脂 A.4.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 葡萄糖 5.0 g 硫酸亚铁 0.3 g 磷酸氢二钠 4.0 g 煌 绿 0.025 g 或5.0g,L 水溶液5.0mL 柠檬酸铋铵 2.0 g 亚硫酸钠 6.0 g 琼 脂 18.0 g,20 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.5?0.2 A.4.2 制法 将前三种成分加入300 mL 蒸馏水(制作基础液)，硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20 mL 和30mL 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20 mL 和30 mL 蒸馏水中，琼脂加入600 mL 蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80 ?左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中， 加入煌绿溶液，充再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50 ?,55 ?。 分混匀后立即倾注平皿。 注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48 h 会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。 A.5 HE 琼脂(Hektoen Enteric Agar) A.5.1 成分 蛋白胨 12.0 g 牛肉膏 3.0 g 乳糖 12.0 g 蔗糖 12.0 g 水杨素 2 .0 g 胆盐 20.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 18.0 g,20.0 g 蒸馏水 1 000 mL 0.4,溴麝香草酚蓝溶液 16.0 mL Andrade 指示剂 20.0 mL 甲液 20.0 mL 乙液 20.0 mL pH 7.5?0.2 A.5.2 制法 将前面七种成分溶解于400 mL 蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600 mL 蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50 ?,55 ?倾注平皿。 注:?本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。 ?甲液的配制 硫代硫酸钠 34.0 g 柠檬酸铁铵 4.0 g 蒸馏水 100 mL ?乙液的配制 去氧胆酸钠 10.0 g 蒸馏水 100 mL ? Andrade 指示剂 酸性复红 0.5 g 1mol/L 氢氧化钠溶液 16.0 mL 蒸馏水 100 mL 将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液 1mL,2 mL。 A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂 A.6.1 成分 酵母膏 3.0 g L-赖氨酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 去氧胆酸钠 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 硫代硫酸钠 6.8 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 酚红 0.08 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.4 0.2 A.6.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加 入600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50 ?,55 ?倾注平皿。 注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温 暗处。 本培养基宜于当天制备，第二天使用。 A.7 三糖铁(TSI)琼脂 A.7.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 5.0 g 乳 糖 10.0 g 蔗 糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亚铁铵(含6 个结晶水) 0.2 g 酚 红 025 g 或5.0 g/L 溶液5.0 mL 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 0.2 g 琼 脂 12.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.4?0.2 A.7.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2 mL,4 mL，高压灭菌121 ? 10 min 或115 ? 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。 A.8 蛋白胨水、靛基质试剂 A.8.1 蛋白胨水 蛋白胨(或胰蛋白胨) 20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.4?0.2 将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121 ?高压灭菌15 min。 A.8.2 靛基质试剂 A.8.2.1 柯凡克试剂:将5 g 对二甲氨基甲醛溶解于75 mL 戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25 mL。 A.8.2.2 欧-波试剂:将1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于95 mL95,乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。 A.8.3 试验方法 挑取小量培养物接种,在36 ??1 ?培养1 d,2 d，必要时可培养4 d,5 d。加入柯凡克试剂约0.5 mL，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。 注:蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。 A.9 尿素琼脂(pH 7.2) A.9.1 成分 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 5.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 0.4,酚 红 3.0 mL 琼 脂 20.0 g 蒸馏水 1 000 mL 20%尿素溶液 100 mL pH7.2?0.2 A.9.2 制法 除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装，121 ?高压灭菌15 min。冷至50 ?,55 ?,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2,。分装于无菌试管内，放成斜面 备用。 A.9.3 试验方法 挑取琼脂培养物接种,在36 ??1 ?培养24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。 A.10 氰化钾 (KCN) 培养基 A.10.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸二氢钾 0.225 g 磷酸氢二钠 5.64 g 蒸馏水 1 000 mL 0.5,氰化钾 20.0 mL A.10.2 制法 将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121 ?高压灭菌15 min。放在冰箱内使其充分冷却。每100 mL 培养基加入0.5,氰化钾溶液2.0 mL(最后浓度为1:10 000)，分装于无菌试管内,每管约4 mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4 ?冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。 A.10.3 试验方法 将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1 环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取1 环接种于对照培养基。在36 ??1 ?培养1 d,2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制)，经2 d 细菌不生长为阴性(抑制)。 注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。 A.11 赖氨酸脱羧酶试验培养基 A.11.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 蒸馏水 1 000 mL 1.6,溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0 mL L-赖氨酸或DL-赖氨酸 0.5 g/100 mL 或1.0 g/100 mL pH 6.8 0.2 A.11.2 制法 除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100 mL，分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按0.5,加入，DL-赖氨酸按1,加入。调节pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管0.5 mL，上面滴加一层液体石蜡，115 ?高压灭菌10 min。 A.11.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36 ??1 ?培养18 h,24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。 A.12 糖发酵管 A.12.1 成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢二钠(含12 个结晶水) 2.0 g 0.2,溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL 蒸馏水 1 000 mL pH 7.4?0.2 A.12.2 制法 A.12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节pH。按0.5,加入葡萄糖，分装于有一个倒 置小管的小试管内，121 ?高压灭菌15 min。 A.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100 mL，121 ?高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10,溶液，同时高压灭菌。将5 mL 糖溶液加入于100 mL 培养 基内，以无菌操作分装小试管。 注:蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。 A.12.3 试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36 ??1 ?培养,一般2 d,3 d。迟 缓反应需观察14 d,30 d。 A.13 ONPG 培养基 A.13.1 成分 邻硝基酚β-D 半乳糖苷(ONPG)60.0 mg 0.01mol/L 磷酸钠缓冲液(pH7.5) 10.0 mL 1,蛋白胨水(pH7.5) 30.0 mL A.13.2 制法 将ONPG 溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管0.5 mL，用橡皮塞塞紧。 A.13.3 试验方法 自琼脂斜面上挑取培养物1 满环接种于36 ??1 ?培养1 h,3 h 和24 h 观察结果。如果β- 半乳糖苷酶产生，则于1 h,3 h 变黄色，如无此酶则24 h 不变色。 A.14 半固体琼脂 A.14.1 成分 牛肉膏 0.3 g 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 0.35g,0.4 g 蒸馏水 100 mL pH 7.4?0.2 A.14.2 制法 按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH。分装小试管。121 ?高压灭菌15 min。直立凝固备用。 注:供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验等用。 A.15 丙二酸钠培养基 A.15.1 成分 酵母浸膏 1.0 g 硫酸铵 2.0 g 磷酸氢二钾 0.6 g 磷酸二氢钾 0.4 g 氯化钠 2.0 g 丙二酸钠 3.0 g 0.2,溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL 蒸馏水 1 000 mL pH 6.8?0.2 A.15.2 制法 除指示剂以外的成分溶解于水，调节pH，再加入指示剂，分装试管，121 ?高压灭菌15 min。 A.15.3 试验方法 用新鲜的琼脂培养物接种，于36 ??1 ?培养48 h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。 志贺氏菌的检验 一、生物学特性 (一)、形态与染色 革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无鞭毛 (二)、培养特性 1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37?，PH7.2~7.4 2、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在 中等大小的菌落 3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫 瑰红色。 4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。 (三)、生化反应 1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏菌外，均不发酵乳糖。 2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。 3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性，不能利用柠檬酸盐。 4、甲基红阳性。 (四)、抗原结构 1、抗原构成: O抗原: 群特异性抗原:A、B、C、D K抗原:除B群外，一般有K抗原 2、志贺氏菌的分群与血清型 志贺氏菌分为四群: A群(痢疾志贺氏菌):1~10型 B群(福氏志贺氏菌):1~6型+X、Y两个变种， C群(鲍氏志贺氏菌 ):1~15型 D群(宋内氏志贺氏菌) :1个型 志贺氏菌属抗原的分类 菌 名 血 清 分 类 生 化 特 性 群 型 亚 型 甘露醇 鸟氨酸脱羧酶 志贺氏菌 — — A 1~10 福 氏 菌 1~6X、Y变1a、1b、2a — B + 种 2b、3a、3b、 3c、4a、4b 鲍 氏 菌 — C 1~15 + 宋内氏菌 D 1 + + 3、属内外抗原关系 (1)群内抗原关系: A群:2与10型，具有密切关系 C群:1与4和11型，10与11相关 B群:群抗原是B群各型之间的共同抗原 (2)群间抗原关系: C群17型与A群3型相关 C群18型与A群11型相关 (3)属外抗原关系: 贺氏菌与艾希氏菌属的O抗原关系非常密切，除A群9型和D群宋氏菌与埃氏希菌的O抗原关系未见报道外，每一个型都与一定的艾希氏菌的O抗原有关。 4、K抗原对O抗原血清学试验的影响 可阻碍O抗原的血清学凝集试验，煮沸处理即可。 (五)志贺氏菌的抵抗力 志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。 一般在潮湿土壤中能存活34天，37?水中存活20天，在粪便内(室温)存活11天。日光直接照射30分钟，56-60?10分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。 (六)志贺氏菌的致病性 致病因素:侵袭力、菌体内毒素、外毒素 二、微生物检验 依据GB/T 4789.5-2003食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验标准进行检验 (一)检验步骤(程序) 检样?样品处理?增菌培养?SS、EMB平板分离培养?初步生化鉴定?最后血清学鉴定?报告 (二)检验操作要点 志贺氏菌在常温中生存的时间较短，应尽快进行试验。 如24h内不能检验，样品应在冰箱内 长时间不能检验，放在低温冰箱内。 1、增菌培养 培养基:GN增菌液 在36?1? 6—8h，当培养液出现轻微混浊即中止培养。 2、分离培养 强选择性平板:SS或HE、WS 弱选择性平板:EMB或麦康数 在工作中36?1?培养 18—24h， 菌落特征:无色透明，中等大小，光滑圆形菌落 3、初步生化鉴定 从平板上挑取3—4个可疑菌落，接种于TSI和葡萄糖半固体培养基各一管，36?， 18—24h， 志贺氏菌在TSI生长的结果(现象): (1)斜面产碱仍为红色或粉红色; (2)底层产酸不产气，变黄色; (3)不产H2S，不出现黑色。 志贺氏菌在半固体培养基生长:沿线生长，无动力。 在志贺氏菌检验中可弃去的培养物: (1)在TSI表面上呈现蔓延生长的培养物 24h发酵乳糖、蔗糖的培养物 (2)在18~ (3)不分解葡萄糖，只在半固体培养基表面生长的培养物。 (4)产气的培养物 (5)有动力的培养物 (6)产H2S的培养物 4、血清学试验和生化鉴定试验 (1)血清学分型: 凡凝为志贺氏菌，挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价 血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查;如果呈现凝集， 则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血 清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再 根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集 的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1,15各型因子血清检查。如果鲍氏 多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3,12型多价血清及各型因子血清检查。 试验 (2)进一步的生化 葡萄糖铵 - 西蒙氏柠檬酸盐 - 赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶 - pH7.2尿素 - KCN生长 - 水杨苷和七叶苷的分解 - (3)生化分群 五项生化试验:乳糖、甘露醇、棉子糖、甘油发酵、靛基质试验 5、结果报告: 综合生化血清学试验结果判定菌群，菌型，并做出报告。 金黄色葡萄球菌的检测 2 引用标准 GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 3 设备和材料 3.1 显微镜。 3.2 温箱:36?1?。 3.3 离心机。 3.4 灭菌吸管:1mL、10mL。 3.5 灭菌试管。 3.6 灭菌平皿。 3.7 均质器。 3.8 载玻片。 3.9 L型涂布棒。 3.10 酒精灯。 3.11 接种环。 4 培养基和试剂 4.1 胰酪陈大豆肉汤:按GB 4789.28中4.59规定。 4.2 7.5%氯化钠肉汤:按GB 4789.28中4.61规定。 4.3 血琼脂平板:按GB 4789.28中4.6规定。 4.4 Baird,Prker琼脂平板:按GB 4789.28中4.60规定。 4.5 肉浸液肉汤:按GB 4789.28中4.1规定。 4.6 灭菌盐水。 4.7 兔血浆:按GB 4789.28中4.63规定。 5 检验程序 6 操作步骤 6.1 增菌培养法 6.1.1 检样处理 称取25g固体样品;吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或 置均质器中制成混悬液。 6.1.2 增菌及分离培养 吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤50mL培养基内，置36?1?温箱培养24h，转种血平板和Baird,Parker平板，36?1?培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 6.1.3 形态 本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较 1μm。 小，直径约为0.5, 6.1.4 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird,Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2,3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 6.1.5 血浆凝固酶试验 吸取1?4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36?1?温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 6.2 直接计数方法 6.2.1 吸取上述1:10混悬液，进行十倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀 分别加入三块Baird,Parker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、释液1mL， 0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在36?1?温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置36?1?温箱培养。 6.2.2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36?1?24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。 6.2.3 菌落计数:将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球 菌数。霉菌、酵母菌计数 1 范围 本标准规定了食品中霉菌和酵母菌(moulds and yeasts)的计数方法。 本标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 2.1 冰箱:2 ?,5 ?。 2.2 恒温培养箱: 28 ??1 ?。 2.3 均质器。 2.4 恒温振荡器。 2.5 显微镜: 10? ,100?。 2.6 电子天平:感量 0.1 g 。 2.7 无菌锥形瓶:容量500 mL、250 mL。 2.8 无菌广口瓶:500 mL。 2.9 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL( 具0.1 mL 刻度) 。 2.10 无菌平皿:直径 90 mm 。 2.11 无菌试管: 10 mm?75 mm。 2.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 3 培养基和试剂 3.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基:见附录 A 中A.1。 3.2 孟加拉红培养基:见附录 A 中A.2。 4 检验程序 图1 霉菌和酵母计数的检验程序 5 操作步骤 5.1 样品的稀释 5.1.1 固体和半固体样品:称取25 g 样品至盛有 225 mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10 稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。 5.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 5.1.3 取1 mL 1:10稀释液注入含有 9 mL无菌水的试管中, 另换一支 1 mL无菌吸管反复吹吸, 此液为1:100 稀释液。 5.1.4 按5.1.3 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次1 mL无菌吸管。 5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个,3 个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于2 个无菌 。同时分别取1 mL样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。 平皿内 5.1.6 及时将15 mL ,20 mL 冷却至46 ?的马铃薯- 葡萄糖- 琼脂或孟加拉红培养基( 可放置于46??1?恒温水浴箱中保温) 倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 5.2 培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，28??1?培养5d ，观察并记录。 5.3 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位(colony forming units ，CFU )表示。 选取菌落数在10 CFU,150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。 6 结果与报告 6.1 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 6.1.2 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU ，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍6.1.3 若所有平板上菌落数均小于 10 CFU， 数计算。 6.1.4 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算;如为原液，则以小于1计数。 6.2 报告 6.2.1 菌落数在 100 以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。 6.2.2 菌落数大于或等于 100 时，前 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数来表示结果;也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入” 原则修约，采用两位有效数字。 6.2.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。 附录A (规范性附录) 培养基和试剂 A.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂 A.1.1 成分 马铃薯(去皮切块) 300 g 葡萄糖 20.0 g 琼脂 20.0 g 氯霉素 0.1 g 蒸馏水 1000 mL A.1.2 制法 将马铃薯去皮切块， 加1000mL 蒸馏水，煮沸10 min ,20 min 。用纱布过滤，补加蒸 馏水至1000 mL 。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121 ?灭菌 20 min 。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中 A.2 孟加拉红培养基 A.2.1 成分 蛋白胨 5.0 g 葡萄糖 10.0 g 磷酸二氢钾 1.0 g 硫酸镁(无水) 0.5 g 琼脂 20.0 g 孟加拉红 0.033 g 氯霉素 0.1 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 上述各成分加入蒸馏水中，加热溶化，补足蒸馏水至1000 mL ，分装后，121?灭菌20 min 。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。 附录B (资料性附录) 霉菌直接镜检计数法 常用的为郝氏霉菌计测法，本方法适用于番茄酱罐头。 B.1 设备和材料 B.1.1 折光仪。 B.1.2 显微镜。 B.1.3 郝氏计测玻片:具有标准计测室的特制玻片。 B.1.4 盖玻片。 B.1.5 测微器:具标准刻度的玻片。 B.2 操作步骤 B.2.1 检样的制备:取定量检样, 加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447 ,1.3460 (即浓度为7.9%,8.8%)，备用。 B.2.2 显微镜标准视野的校正:将显微镜按放大率 90,125 倍调节标准视野，使其直径为 1.382 mm。 B.2.3 涂片:洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。 B.2.4 观测:将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样观察50 个视野，同 一检样应由两人进行观察。 B.2.5 结果与计算:在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野(1.382mm )的 1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6(即测微器的一格)时即为阳性(+ )，否则为阴性(- )，按100 个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。