动物实验设计
口服避孕药预防化疗对大鼠卵巢损伤的研究
研究背景
卵巢早衰(premature ovarian failure POF)系指妇女在40岁以前绝经，常表现为雌激素水平降低引起的月经紊乱、不孕、围绝经期综合征等一系列症状。POF病因复杂，目前仍不清楚，化疗远期毒副作用是其中之一。随着化学毒性药物在肿瘤及自身免疫疾病的广泛应用，其导致的性腺功能损害成为研究新热点，其中以环磷酰胺(cyclophosphamide，crx)为代表的烷化剂引起的卵巢功能损害研究较多，但其作用机制仍不清楚。一些研究显示，CTX可直接损伤卵巢颗粒细胞，并主要作用于有丝分裂活跃的卵泡，而静止的生殖细胞呈低度敏感。另有学者提出，化疗期间应用口服避孕药抑制卵泡发育，能够减少化疗对卵巢的损害，依据是化疗药物损伤卵巢的机制和口服避孕药的作用机理，即通过雌孕激素负反馈抑制下丘脑(垂体一卵巢轴，从而抑制卵泡发育，储存原始卵泡，保护卵巢储备功能，减少卵巢损伤。相关研究也证实口服避孕药能够降低及预防化疗对卵巢的损伤，促进化疗后卵巢功能甚至是生殖功能的恢复。但也有学者持不同观点，结论尚有争议。本研究旨在探讨化疗期间应用口服避孕药能否保护卵巢功能，以确定口服避孕药的有效性。
目的
本文采用阴道涂片法监测大鼠动情周期，放射免疫法和组织切片法，检测大鼠血清雌二醇(E2)水平、卵泡刺激素(FSH)水平、卵巢重量及卵泡数量，并通过统计学
分析
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，比较实验前后各组实验指标变化，探讨口服避孕药在化疗期间有否起到保护卵巢的作用及其相关机制。
材料与方法
1(SPF级近交系雌性Wistar大白鼠，3月龄，体重1 809,2009。喂食SPF级鼠饲料及净化水，室温20?~25?，相对湿度450,0-(55,，每日光照12h，饲养1周熟悉环境后，每日清晨9:00行阴道细胞涂片，显微镜下观察动情周期，选用有正常动情周期的大鼠进入实验。口服避孕药(OC>(—-(达英一35(35pg炔雌醇,2mg醋酸环丙孕酮)。环磷酰胺(CTX)，规格0(29x10支。
2(动物实验:75只Wistar雌性大鼠随机分为5组:
?空白对照组:不予任何药物处理;
?CTx组:负荷剂量50 mg,kg腹腔注射，之后8 mg,(kg?d)腹腔注射，连续14d;
?oc组:8(7599炔雌醇,0(5mg醋酸环丙孕酮(溶于lml生理盐水)，灌胃，连续25d;
?联合治疗I组:同时给予CTX和OC，连续15d，给药方法同?、?组;
?联合治疗II组:先连续10d给予OC灌胃，用药剂量同?组;第11d起加用CTX，给药方法、时间及剂量同?组。 3(采用阴道涂片法监测大鼠动情周期，放射免疫法测定E2、FSH浓度。所有卵巢标本均经石蜡包埋，连续切片，苏木素(伊红(HE)染色。
从实验开始到结束，各组大鼠每天行阴道涂片，并于给药结束前，每隔5天(相当于大鼠1个正常动情周期)，于动情间期测定各组E2、FSH浓度;停药后第15、30天(相当于3及6个正常动情周期)，测定各组E2、FSH浓度。另外，停药当天、第15、30天，分别处死各组1,3大鼠，比较卵巢重量、卵泡数量变化。
4(统计学处理采用SPSSl0(0软件包检验分析，数据以均数士
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
差表示，采用的具体统计学方法有单向方差分析、重复测量、析因分析，两两比较采用SNK及LSD法，所有结果均P<0(05具有统计学意义。 数据记录与结果分析
1(各组大鼠E2、FSH浓度及动情周期变化
(1)大鼠E2、FSH行重复测量分析，分别比较各组、各时间点E2、FSH，分析差异是否有统计学意义，实验分组和时间是否有交互作用。
(2)空白对照组: 于动情间期测定E2和FSH。观察阴道涂片是否呈正常大鼠的动情周期改变。 (3)CTX组:观察从给药第5天至实验结束，E2和FSH的变化情况，与同期其余4组E2、FSH分别比较，并分析计算差异是否有统计学意义。记录阴道涂片该组大鼠在给药的第几天出现持续不排卵现象，停药多少天后恢复正常动情周期。
(4)OC组:观察并比较从给药第5天至停药第15天，以及停药第30天，该组E2、FSH浓度与同期空白对照组的高低，计算差异是否有统计学意义。记录阴道涂片该组大鼠在给药的第几天出现持续不排卵现象，停药多少天后恢复正
常动情周期。
(5)联合治疗I组:分别记录在联合给药第5天、第10天、停药当天、以及第15天，停药第30天，E2和FSH分别与上述各组进行比较，并分析差异是否有统计学意义。记录阴道涂片该组大鼠在给药的第几天出现持续不排卵现象，停药多少天后恢复正常动情周期
(6)联合治疗II组:?比较先给予OC药物的前10天，E2、FSH与同期OC组的大小;
?比较在联合给药第5天，E2、FSH与CTX组及联合治疗I组、空白对照组的大小。
?比较联合用药第10天、停药当天、15天，E2、FSH与CTX组、空白对照组的大小。
(7)比较联合治疗I、II组的E2浓度
2(各组大鼠卵巢重量的变化
(1)大鼠卵巢重量行析因分析。
(2)记录空白对照组大鼠卵巢重量。
(3)记录OC组和联合治疗I、II组，在停药当天，大鼠卵巢重量的变化，分别与空白对照组比较，分析差异是否有统计学意义。
(4)CTX组按时间依次测定卵巢重量，分别与同期
其余各组比较并分析差异是否有统计学意义俨。
4(各组大鼠卵泡数量的变化
(1)各组大鼠卵泡总数及各期卵泡数目分别行析因分析。
(2)记录空白对照组大鼠卵泡总数为，原始卵泡个数，初级卵泡个数，次级卵泡个数，成熟卵泡个数。 (3)记录OC组和联合治疗I、II组每次测定的卵泡总数，分别与空白对照组比较。分析差异是否有统计学意义 (4)记录CTX组在停药当天至第30天，卵泡总数及各期卵泡数量的变化，分别与其余各组比较，分析差异是否有统计学意义
讨论
1(环磷酰胺对大鼠各期卵泡的影响,
2(口服避孕药通过雌孕激素负反馈作用，对大鼠卵泡发育和生长起促进作用还是抑制作用， 是否对卵巢储备功能具有保护作用,
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