提植物总RNA及去DNA和反转录标准方法(会给实验室一大笔提取试剂盒的经费)Trizol法提取植物总的RNA及反转录可用于RT-PCR
【中文版】
一、植物总RNA 的提取
抽提RNA 所用的研钵酒精灼烧5-10min或灭菌.,器皿均高温高压灭菌,以去除RNA 酶,所有试剂都保证没有RNA 酶污染。
1) 1.5ml 离心管,取0.1g 组织在液氮中研磨至粉末, 立即加入1ml Trizol,涡旋充分混匀后放置2min。
2) 加0.2体积(氯仿Chloroform),剧烈振荡15s(vortex),室温放置3min(或不放置,直接离心)。
3) 4℃,12000rpm 离心...
Trizol法提取植物总的RNA及反转录可用于RT-PCR
【中文版】
一、植物总RNA 的提取
抽提RNA 所用的研钵酒精灼烧5-10min或灭菌.,器皿均高温高压灭菌,以去除RNA 酶,所有试剂都保证没有RNA 酶污染。
1) 1.5ml 离心管,取0.1g 组织在液氮中研磨至粉末, 立即加入1ml Trizol,涡旋充分混匀后放置2min。
2) 加0.2体积(氯仿Chloroform),剧烈振荡15s(vortex),室温放置3min(或不放置,直接离心)。
3) 4℃,12000rpm 离心5min,样品会分成3 层,取上层水相,取上清。
4) 加等体积的异丙醇,混匀,4℃放置10min以上。或可以-80℃过夜。
5) 4℃,12000rpm 离心20min,4℃弃上清,管底管侧形成胶状沉淀(可看到白色沉淀)。
6) 加1ml 75%乙醇,充分溶解沉淀。4℃,12000rpm 离心5min。倒掉上清,用移液器吸干。
7) 晾干约10 min。(不要晾太长时间,看不到水就可以加灭菌水)
8) 加50μl灭菌的超纯水,65℃溶解,-20℃(最好-80℃)保存。(注:要是处理DNase就不能加这么多水。可以加5μl)
整个提取步骤最好咋在4℃或冰上完成
二、DNase I 处理消化植物总RNA 中的基因组DNA
1) 将上述全部提取的植物总RNA 5μl,然后顺序加入1μl 10×缓冲液,1μl DNase,3μl RNase-free
水,总体积10μl,充分混匀后,37℃温育30 min。
2)加入300ul 灭菌水提高体积,然后加入300ul PCI,vortex;4℃,12000rpm 离心5min;
3) 加入1/10 体积3M 醋酸钠(autoclaved) pH 5.2, 和2倍体积的100% EtOH;(-20℃, 10-30min或可以-80℃过夜)
4) 4℃,12000rpm 离心15min,
6)75% EtOH, 300ul, 12000 rpm 5min
7) dry (10-15min)and add 30-50 ul of ddH2O
三、反转录cDNA
1) 在上述总体积为11μl 反应液中加入1μl Oligo(dT)18 引物4μl 5×缓冲液,2 μl dNTP,
1μl 反转录酶,1μl RNase 抑制剂,总体积20μl,充分混匀后,42℃温育1-1.5hr。
2) 70℃温育10min,终止反应
RNA extraction from plants using TRIZOLand reverse transcription
【English vision】
RNA extraction from plants:
1. Prepare 1.5ml Safe-lock Eppendorf tubes and add 0.1g tissue of plant, grind in liquid nitrogen, Immediately add 1ml of TRIZOL to the homogenized tissue at RT for 2 min.
2. Add 0.2ml of chloroform per 1ml TRIZOL
10. Shake vigorously by hand for 15 seconds.
11. Incubate at RT for 3 min.
12. Centrifuge the samples at 13000 rpm for 15min at 4°C for phase separation.
13. Transfer the aqueous upper phase to new tubes (ca 50-60% of TRIZOL vol.)
14. Precipitate RNA by mixing with 0.5 ml isopropanol per 1ml TRIZOL
15. Incubate at RT for 10 minutes
16. Centrifuge the samples at 13000 rpm for 10min at 4°C to obtain pellets
RNA wash:
17. Remove supernatant and wash pellets with 1ml 75% EtOH (diluted with DEPC treated water).
18. Vortex once and centrifuge at 7500 x g for 5min at 4°C
19. Discard supernatant and dry pellets for 5 min at RT (or in speed-vac)
20. Dissolve pellets in DEPC treated water 21. Incubate at 55°C for 10 minutes. Store at –80°C until use.
3) 4 degree, 12000 rpm, 5min
4) add 1/10 volume of 3M Sodium acetate (autoclaved) pH 5.2, and 2 volume of 100% EtOH.
4) Store at -80 degree overnight or more longer.
5) 12000 rpm, 4 degree, 15min
6)75% EtOH, 300ul, 12000 rpm 5min
7) dry and add 30-50 ul of ddH2O
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