PLFA分析方法土壤中PLFA的提取方法
1.0.15mol.L-1柠檬酸缓冲液
(1)0.15mol.L-1柠檬酸钠:4.41g柠檬酸钠溶解于100ml去离子水中
(2)0.15mol.L-1柠檬酸:6.3g柠檬酸溶于200ml去离子水中,混合100ml柠檬酸钠溶
液和150ml柠檬酸溶液,用柠檬酸溶液调pH到4
2.丙酮
3.正己烷氯仿混合液(正己烷:氯仿=4:1):40ml正己烷,10ml氯仿(建议一次性配75ml,即60ml正己烷,15ml氯仿)
4.甲醇甲苯混合液(甲醇:甲苯=1:1):50ml甲醇和50...
土壤中PLFA的提取方法
1.0.15mol.L-1柠檬酸缓冲液
(1)0.15mol.L-1柠檬酸钠:4.41g柠檬酸钠溶解于100ml去离子水中
(2)0.15mol.L-1柠檬酸:6.3g柠檬酸溶于200ml去离子水中,混合100ml柠檬酸钠溶
液和150ml柠檬酸溶液,用柠檬酸溶液调pH到4
2.丙酮
3.正己烷氯仿混合液(正己烷:氯仿=4:1):40ml正己烷,10ml氯仿(建议一次性配75ml,即60ml正己烷,15ml氯仿)
4.甲醇甲苯混合液(甲醇:甲苯=1:1):50ml甲醇和50ml甲苯
5.0.2 mol.L-1氢氧化钾甲醇溶液:0.56g KOH溶解在50ml甲醇中(需要当天配)
6.内标
7.1M冰醋酸(可用较长时间):2.9ml溶解在50ml水中
注:试剂1为每做一批配一批
Day1
1.称取3.0000g冷冻干燥土样于50ml玻璃离心管中或特氟龙离心管中
2.按顺序加入
3.2ml柠檬酸缓冲液,4ml氯仿,8ml甲醇
3.涡旋振荡
4.遮光下水平振荡2h (250 rpm)
5.离心(10min,1500rpm)
6.转移溶液至大号试管中
7.加入1.6ml柠檬酸缓冲液,2ml氯仿,4ml甲醇
8.涡旋振荡
9.遮光下水平振荡2h(250 rpm)
10.离心(10min,1500rpm)
11.转移溶液到步骤6试管中
12.加4.8ml柠檬酸缓冲液和6ml氯仿到步骤6试管中
13.盖好盖子,振荡1min,间隔放气
14.遮光隔夜静置,远离火源(4°冰箱保存)
Day 2
1.下层氯仿相转移到中号玻璃试管中(转移时小心不要把上层溶液吸入)
2.氮气吹干(温度不要超过40°,一般设为25-30°)
3.加1ml甲醇,涡旋振荡,使其充分溶解
4.氮气吹干
5.步骤3.4重复一次
6.准备好SPE柱
7.氯仿5ml洗柱(注:提前做好准备)
1
8.样品上柱:用氯仿0.5ml×3次溶解样品(用胶头滴管也可),并转移到SPE柱中
9.加10ml氯仿,洗中性酯
10.加10ml丙酮洗糖酯
11.倒掉SPE萃取装置内的废液
12.在SPE萃取装置内放置带试管的试管架
13.加8ml甲醇,洗磷脂入小号试管中。
14.收集物用氮气吹干
15.加200ul内标(涡旋振荡)
16.氮气吹干,零下保存
Day3.
17.加1ml甲醇甲苯混合液,溶解磷脂
18.加1ml 0.2 mol.L-1的氢氧化钾甲醇溶液
19.37°水浴15分钟
20.加2ml正己烷氯仿混合液
21.加0.3ml 1M的醋酸
22.加2ml去离子水
23.振荡分离(10min)
24.离心(3000rpm,5min)
25转移上层有机相到小号试管中
26.加2ml正己烷氯仿混合液到原试管中重复提取
27.振荡分离(10min)
28离心(3000rpm,5min)
29.转移上层有机相到同一小号试管中
30.氮气吹干
上机测定
1.用正己烷溶解磷脂脂肪酸甲酯(用枪)100ul (3次)
2.转移到GC内插管中
3.氮气吹干(若不能上机,则放在0°下保存)
4.加60ul正己烷
5.上机
配100ml需要称取内标纯品0.003100099887g (注:建议一次多配一些,比如500ml或者1000ml储存,这样可以增大称样量,减小误差)浓度31ppm?
注意:
1.每次做完实验后请将试管等物品洗净后放置。其中凡玻璃物品,需要洗净烘干后450℃烘烤4h;各种盖子应该丙酮:水(1:2)浸泡超声1h再洗去丙酮蒸馏水超声1h后洗净烘干。
2. 内标务必加准确,这关系到后续的计算;
3.承接甲醇滤液的小号试管应该事先选取确定不漏可以倒置,以免振荡液体流出;
4.每次氮吹之前都应该用即将吹去的溶液淋洗氮吹仪针,并保证一批样品氮吹位置固定。
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