MALDI-TOF（基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱）综述 基质辅助激光解析离子化用于飞行时间质谱的发展概况

MALDI-TOF（基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱）综述 基质辅助激光解析离子化用于飞行时间质谱的发展概况 基质辅助激光解析离子化用于飞行时间质谱的发展概况 摘要:扼要介绍了飞行时间质谱在分析合成高分子中的基本原理、主要优点及 存在的困难;详细分析了基质辅助激光解吸电离的基质、盐(阳离子)、pH和样 品制备方法、一些新的无机材料的应用、样品检测前脱盐处理等关键因素对实验 结果的影响;阐明了这一分析技术在合成高分子定量测定及其应用的研究及展 望。 关键词:基质辅助激光解析离子化(MALDI) 飞行时间质谱(TOF) 基质 样 品制备 pH值 Abstract: the basic principles, main advantages, and existing difficulties of TOF in analyzing synthesized macromolecule are introduced. The using of matrices, salts, and influnces caused by pH, sample preparations, new inorganic materials, desalting forehand detection are discussed in details. Finally, applications and prospects of MALDI-TOF in analyzing synthesized macromolecule are clarified. Keywords: MALDI TOF matrices sample preparation pH 1 飞行时间质谱(TOF-MS)概述 飞行时间质谱(Time-of-Flight Mass Spectrometry，TOFMS)分析是利用动 能相同而质-荷比不同的离子在恒定电场中运动，经过恒定距离所需时间不同的 原理对物质成分或结构进行测定的一种质谱分析方法。飞行时间质谱分析技术的 优点在于理论上对测定对象没有质量范围限制、极快的响应速度以及较高的灵敏 度。目前，TOFMS技术被应用于生命科学、分析化学、表面科学、原子物理学 及工艺过程监控等诸多领域，成为20世纪90年代以来应用最广的质谱分析技术 [1]之一。 1.1 TOF-MS分析方法的基本原理 TOF-MS分析方法的原理非常简单。样品在离子源中离子化后即被电场加 速，假设离子在电场方向上初始位移和初速度都为零，所带电荷数为q，质量数 为m，加速电场的电势差为V，则加速后其动能应为:mv2/2=qeV，其中，v为 离子在电场方向上的速度。离子以此速度穿过负极板上的栅条，飞向检测器。离子从负极板到达检测器的飞行时间t，就是TOFMS进行质量分析的判据。在传统的线性TOFMS，离子沿直线飞行到达检测器;而在反射型TOFMS中，离子经过多电极组成的反射器后反向飞行到达检测器，后者在分辨率方面优于前者，图一为常规线形TOF和反射式TOF图示。 图一 常规线形TOF和反射式TOF 1.2 TOF-MS技术及应用的发展历程 以离子的飞行时间作为判据进行质量分析的创意，是Stephensen在1946年提出来的。最初 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的是线性TOFMS。离子的飞行时间与其质量的平方根成正比。与其他类型的质谱仪相比，这种设计具有两个突出的优点:(1)到达检测器的所有离子都能在一张图谱中显示出来，而不需要进行任何电压或电流的扫描，这使快速测定成为可能，同时对被测对象没有质量数的限制;(2)离子运动中没有经过筛选，从而使离子源产生的离子绝大多数都可到达检测器，即离子传输效率很高，使高灵敏度成为可能。不过由此可能带来如下问题:离子在进入飞行区时的初始条件不可能完全一致，特别是与连续离子源如ESI，APCI等联用时，离子产生的位置、时间、初始动能及初始速度方向的差异，都会造成飞行时间的延长或缩短，导致质谱峰扩宽，分辨率下降。很长一段时间，分辨率低成了阻碍飞行时间质谱技术发展的主要因素。此外时间信号的接收与处理技术落后也影响了TOFMS的应用。 为了解决这个问题我们引入了MALDI技术，并且在TOF上引进了延迟引出等技术。离子延迟引出(Delay Extraction)即当激光照射靶的瞬间，若靶电极和与其相对的离子引出电极处于相同的电位，即在两电极之间形成无场区，那么被解吸的离子以不同的初始速度在无场区内运动，经过一段延迟时间后，速度高的离子离靶远，速度低的离子离靶近，然后以脉冲方式在瞬间使靶与引出电极处于不同电位，由此产生的电场把离子引出，经聚焦透镜后飞出离子源。离靶近的离子比离靶远的离子得到更大的加速(因而获得更大的动能)，适当选择延迟时间及靶与引出电极间电压差，可以有效地补偿离子的初始动能分散，从而显著地提高线性TOF质谱仪的分辨率，这一技术即为延迟引出技术或称为“脉冲离子引出” [1](Pulse Ion Extraction) 图二为连续引出和延迟引出技术比较。 图二 连续引出和延迟引出技术比较 2 MALDI概述 1988年，Karas等提出了基质辅助激光解吸电离技术，解决了高质量数生物分子的离子化问题。MALDI是一个非常复杂的过程，其中涉及到光学、力学现象及相变和电离的热力学、物理化学过程，下图三是基质辅助激光解析过程。 图三 基质辅助激光解析过程 由于MALDI技术采用紫外区的激光作激发光源得到了更好的灵敏度，而且可以显著增加对盐和常用缓冲液的包容性，使得样品的处理步骤能够更加简单快捷。而最早使用的连续照射激光器会导致大量的基质和样品分子迅速解吸，使速度、能量都比较分散，降低了质谱的分辨率。随后采用的脉冲激光、离子镜、反射式质谱及时间延迟聚焦技术都显著地提高了分辨率。作为一种生物大分子的电离技术，MALDI通常与无质量检测上限飞行时间质谱(TOF-MS)联用，直到现MALDI-TOF仍然广泛用于对蛋白质的分析、鉴定。随后，MALDI与FT-MS联用也被用于对大分子的研究。MALDI-FT-MS不仅能够获得更好的分辨率与质量准确度，而且还可以得到更多样品分子的结构信息。此后不久，MALDI与离子 [2]阱也得以成功地联用，并应用于生物大分子的分析。 MALDI-TOF与传统的磁式质谱相比，其特点有:?可实现纳秒量级的瞬时记录，经过多次瞬时记录累加得到的质谱图，其信噪比得到了极大的改善。?具有高的离子流通率，因而获得高的灵敏度，仅需约1 pmol的供试品即可测定，甚至能检测到离子化区的几个原子。?原则上没有分子量范围限制，目前可测定蛋白质的分子量已超过100 000 ?对固体、液体表面分析，可以很好地控制离子 ，[13]化的位置或深度，分析时间大大缩短，图四为最常见的MALDI-TOF联用结构。 图四 MALDI-TOF联用示意图 在MALDI-TOF联用普遍为人们所接受的同时，其本身也正受着诸多因素的限制，比如仪器复杂并且价格昂贵;在分析精密度，可靠性，分辨率等方面存在不足。 不同的目标分析物决定了要使用不同性质的TOF质量分析器与MALDI串联。如:一个简单的线型TOF适合分析大分子量的物质(完整蛋白质，寡核苷酸，多聚糖)，而反射型的TOF在小分子化合物的研究分析中，能够达到较好的分辨力。 在一些商业化仪器里，不同性质和功能的分析器往往被综合到一台仪器上，以削减成本。然而，这样带来的另一问题，就是复杂性提高，可靠性下降。 最近，人们正在逐步优化诸如仪器尺寸，最大加速电压，以及某些初始条件如初速度，离子初始位置的不确定性，从中 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 出的种种理论也在指导着新的技术的产生:如高速激光，快速数字转换器和在线叠加技术，快速高电压脉冲发生 [4]器以及计算机数字延迟发生器，以上这些构成了目前高效MALDI-TOF的来源。 3 MALDI基质的选择 基质作为MALDI研究的核心，左右着MALDI对分析物研究的发展。从大 、能体上来说，质谱的基质辅助激光解析离子化基质必须满足以下几个要求:1够嵌入并分散被测物(如:通过共结晶的方式);2、能与被测物共溶与合适的溶剂体系;3、在真空下能稳定存在;4、能吸收激光;5、在激光照射下，能与被 [5]测物共解析;6、能促进被测物离子化。离子化是一个复杂的过程，它决定于共结晶体系中样品和基质的物理化学性质。 3.1 常规基质的衍生化以测定特定衍生物 Thorsten Jaskolla， Beate Fuchs等人在测定脑磷脂氯胺时发现:常规基质如α-腈基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)和2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB)不能很好地用于其测定。而在此之前，氯胺衍生物的测定也只在ESI-MS中成功测定。作者通过研究发现利用基质与氯胺基团的反应，以及激光下使氮氯键断裂可以解决这一问题。同时，作者发现，4-氯-α-腈基肉桂酸(ClCCA)可以胜任氯胺类化合物的基质。它能使磷脂在气相中发生分子内重组，从而暴露乙醇胺的基团，为MALDI所检测。但是，此离子化反应具体的机理至今不明，唯一可以确定的是，氯胺衍生物只有在类似ClCCA等合适的基质下才能很好的测定，因此基质 [6]的选择对MALDI的推广和普及尤为重要。 3.2 二元基质的互补使用 糖蛋白其大分子量特性使得我们选则基质时有了一定困难。正确选用基质，是研究大分子加合物的关键。 一般，2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB)和α-腈基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)能够顺利使分子量小于5000的糖肽离子化。对于完整的糖蛋白(分子量往往在5000以上)，我们一般会采用芥子酸(SA)，2-(-4-羟基苯偶氮)苯甲酸(HABA)，2，5-二羟基苯乙酮(DHAB)，或2，4，6-三羟基苯乙酮(THAP)。 应用二元基质是一种能够提高质谱行为的有效途径，Karas等人通过2，5-DHB和2-羟基-5-甲基苯甲酸联用提高了糖和糖蛋白的质谱分辨率。在2，5-DHB中加入1-羟基异喹啉，可以提高质谱对缓冲溶液和其它污染的耐受性。利用CHCA/2，5-DHB二元基质能很好地解决多肽质谱成像和完整的糖蛋白分析。CHCA和9-氨基吖啶混合基质在分析小分子物质时能显著减少背景干扰。 本文作者选用了2，5-DBH/CHCA;2，5-DBH/THAP;2，5-DBH/DHAP;2，5-DBH/SA;THAP/CHCA;THAP/SA这六种基质组合形式研究了各自制备的样品的质谱行为，并使用核糖核酸酶B(RNase B)这个常用的标准物来检测这些 混合基质，在此基础上进一步分析优化质谱参数和试验条件。选用的参数有:信噪比，峰强，对RNase B单个糖型的分辨率。较好的基质组合应该能有高的质谱分辨，色谱图上能显示出5个尖锐的色谱峰，各峰对应的质谱分子量各自相差162(一个甘露糖单元)。通过试验发现2，5-DHB/CHCA和2，5-DHB/SA显示的结果最好。用这两种混合基质得到的色谱峰清晰尖锐，分辨率高，重现性好。同时，2，5-DHB/CHCA在较低的激光能流下也能达到好的离子化效果，从而保 [7]护了仪器并减少离子污染。 4 MALDI样品的制备 样品的制备方法有很多种，常用的有:1、微滴干燥技术(Dried-droplet technique)，2、快速蒸发技术(Fast-evaporation technique)，3、电喷物沉积技术(Electrospray deposition)，4、非溶剂样品制备技术(Solvent-free sample preparation)等等。在样品准备以及分析人工合成高分子化合物这一环节，很多人做出了不懈的努力，如:电喷雾沉积和真空沉积能制备出均一的样品，提高分 [8-11]析物响应值。 在传统基质中加入硝酸纤维，利用气体喷雾技术(aerospray) [12-13]产生的均一薄基质层在多次激光脉冲激发中有很高的重现性。与电喷雾沉积相比，用升华法沉积基质，可以用较少的碱性加合物达到较高的信号响应。 [14]Michael Karas等人用一些特有的理化参数对DD法和升华法进行了比较，说明了升华法的优越性。使用的基质即最常用的CHCA及其适宜作基质的CHCA衍生物。具体通过:1、通过扫描电子显微技术对两法制备的结晶大小进行比较，2、热重量分析(Thermogravimetric Analysis， TGA)，3、质谱强度、激发初始速度的比较，4、分析物结合深度评价。实验表明，升华法得到的基质斑沉积在疏水的表面时，疏水作用引起的横向聚集使得分析物以很小的液滴存在，另外，表面预处理技术(surface preparation)使得分析物在纵向上富集在基质表面，小的结晶颗粒和富集作用提高了分析物-基质比，从而在一次激光激发过程中有可能产生更多的离子化的分析物，这能让其拥有液滴干燥法(DD法)无法媲美的良 [15-17]好的灵敏度。 与DD法相比，升华法提高了分析物激光解析的稳定性。使其激发后将能量 更多地转化为较高的初速度，降低了离子的内能。作者还发现升华法制备的样品在激发时表面温度明显高于DD法，这也许是因为细小的基质颗粒能更显著的阻断热传导。这样，激光的激发效率就会明显增加。同时，基质的准备和点样过程也可以省略，这将极有利于高通量分析中缩减样品制备工作的时间。更重要的是，升华过程纯化了基质混合物，纯化的基质能够更广泛、均匀的覆盖样品斑。更小的基质结晶展现出更好的样品相容性和均一性，在多次不同点位的激光激发中可 [18]以达到良好的重现。而DD法制备的样品这一性质明显不足，使得其样品分析中有必要进行个别晶体的选择，或者让激光束在样品斑上随机走动以弥补局部不均。这样，DD法制备的样品在没有基质覆盖或部分覆盖的样品斑点区所耗的分析时间和激光激发次数明显增加。升华法的这些优点结合上其他的固有性质，如:精确的斑点大小，形状，位置等等使得样品制备条件大大同化，得到了良好的重 [19]现性。 然而，升华对基质性质的影响及其详细机理并没有完全明确;并且，较强的离子化条件容易造成分析物离子化过程产生过多碎片。因此，升华法还需要进行进一步研究和探讨和优化。 5 pH值对MALDI的影响 自基体辅助激光解吸电离质谱法(MALDI)面世不久，人们即发现基体溶液的pH值对测定结果有影响，基体在辅助激光解吸电离样品过程产生质子转移的作 [20]用机理已得到了普遍的认同，因此人们都倾向于选用pH值偏于酸性的基体， [21][22]并往往在配制蛋白质溶液时使用0.1%三氟醋酸水溶液 。Ehring等认为MALDI法只能在基体化合物溶液的等电点或酸性情况下才能进行，如果基体溶液的pH值高于pKa值时，基体将以阴离子存在，在溶剂挥发后，就形成了相应的盐而不能起辅助解吸电离的作用。 最近研究发现，利用2，5-二羟基苯甲酰肼衍生化试剂引入碳纳米管材料(CNT)后可作为MALDI基质和PH值调节剂，2，5-二羟基苯甲酰肼衍生化试剂能在CNT表面引入酚羟基和苯基，前者能提供可变的表面电荷和质子来源;后者可成为强烈的自外激光吸收体。并且衍生化后的CNT在pH为10.5的条件 下能较充分的舒展，比表面积增大，从而为吸附痕量的多肽提供了很大的空间。而在pH为5的条件下，吸附了样品的CNT开始沉积，与样品溶液达到完美的分离。这为快速分离和提取技术的发展提供了有力的支持，克服了早期CNT材料在样品提取和富集方面的不足，很大程度上提高质谱离子化效率和检测限，用于痕量多肽的研究。 实验表明，通过如上的pH调节，当被测物浓度达到0.01pg/μL时，仍能通 [23]过此法达达检测要求。 6 MALDI中金属离子的引入 与MALDI分析生物分子相比，合成高分子的离子化在多数情况下是金属离子阳离子化而不是质子化。因此，仅仅优化基质是不够的。而应该与金属离子同时考虑。对于相对于极性较大的高分子，在MALDI分析中一般是钾离子化或钠 [24] 离子化。 金属离子的引入，在大分子化合物分析中往往能提供特征化的碎片离子，在化合物结构确定，特征离子的选择，目标物定量分析中有着重要的作用。 David H. Russell等人报道了一种新的含铜离子的基质，能让被测物产[M+xCu-(x-1)H]+ (x=1-6)离子——α-腈基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)铜离子复合物[(CHCA)4Cu2]。(CHCA)4Cu2可由CHCA和氧化亚铜反应得到。作者发现，激光解析后产生的加合离子丰度明显高于普通基质产生的[M+Cu]+离子，同时这为人们研究铜离子与肽结合并在气相中的相互作用提供了可靠依据和有 [25]效途径。其反应机理有待于进一步研究。 7其他添加剂及无机材料的应用 7.1碳纳米管在MALDI-TOF检测中的应用 碳纳米管自从1991年被Iijima[21，22]发现以来，因为其独特的结构，电学和机械特性使得在MALDI技术里引入碳纳米管作为基质添加剂和离子化辅助剂 [26-28]已逐渐成为一种新的方法。很多已发表的工作都利用其本身以及衍生化材料和技术对小分子中性物质进行分析和检测。 [29]有人报道利用碳纳米材料的疏水性，在样品溶液中加入10μL碳纳米管甲 醇(50%，vol/vol)悬浊液，将分析物提取到碳纳米管表面，经过离心，碳纳米管沉积到试管底部。除去上清液，加入分散剂使其再次悬浮，利用吸量管直接将其定量转移至样品靶作进一步分析。事实证明，对于小分子物质的分析，用碳纳米管作为基质，样品的离子化效率和峰分辨率明显高于活性炭。在此之前的方法，仅仅将样品沉积在单层碳纳米材料表面，没有萃取的过程;而在这整个分析过程中，碳纳米管发挥了双重作用:前处理过程中的固相萃取剂和MALDI分析的基质。 作者在此选用了B-Arg(N-苯甲酰-L-精氨酸), BAEE(N-苯甲酰-L-精氨αα 酸乙酯), propranolol(普奈洛尔), quinine(奎宁), Leu-Tyr(亮氨酸-酪氨酸二肽), Leu-Met(亮氨酸-甲硫氨酸二肽)几种小分子， 比较了使用碳纳米管和活性炭各自的峰强度，信噪比以及分辨率见表一。碳纳米管有着比活性炭更小的体积，并且在结构上，碳纳米管外侧有很多共轭的电子，可以很好地吸收和传递紫外光的能量，而活性炭却无法通过共轭电子流畅地将能量传递给被测物，因此从下表我们可以看出，所有的参数，碳纳米管都优于活性炭。 表一 碳纳米管(CNTs)与活性炭(AC)各参数比较(N代表未检出) 同时作者在实验中发现，分析物的信号存在时间较短，碳纳米管在真空中由于溶剂的挥发很难固定在样品靶上，容易脱离。而在分散剂中加入甘油和蔗糖添加剂，分辨率可以得到提高同时减少可能的离子源污染。这一思路来源于SALDI(表 面增强激光解析离子化)的应用。笔者深信，碳纳米管等无机材料鼻尖得到广泛的应用，并在小分子的检测中发挥重要的作用。 7.2对样品靶的预覆盖 [30]目前有一种新的实验设计对样品进行预处理，即在利用MALDI-TOF对样品进行快速、高质量分析之前，将不锈钢样品板用以下三种物质之一进行涂渍覆盖:矿物油，甘油，或者凡士林，并且对降血钙素，胰岛素等多肽及其混合物在未覆盖以上三种物质之一的样品板以及覆盖了的样品板上的分析进行比较。发现，覆盖之后，样品的信号强度和检测限都有所提高。同时，作者用Sephadex LH-20微柱处理后的人血清蛋白检验了此法的精密度和重现性，结果发现，覆盖后的样品板在分析时，能够测出更多痕量物质，从而说明了该法优越性。作者认为，这种把微柱分离技术和此法结合，已可直接用于对生物体液进行检测。 另外，作者检验了覆盖样品板对盐的耐受性，所用物质为氯化钠和尿素浓缩物。测试发现，覆盖处理后，样品对盐的耐受有所增强，特别是稀释后的样品。作者也通过靶上冲洗的方法对样品进行脱盐处理，所采用的清洗溶液可以是1%的三氟醋酸(TFA)或用蒸馏水。处理后比较两种样品板发现，未进行涂渍处理的板，由于没有涂渍物的固定吸附作用，样品会先从板上流失，损失很大，达不到脱盐的效果。而覆盖后，由于涂渍物与样品的作用，样品不容易被冲洗掉，从而在尽量减少样品丢失的情况下，使得脱盐效率显著提高。此外，处理后的样品板装载样品检测使质谱强度大大提高，这有利于MALDI-TOF对大分子检测。 此法简单易行，耗时短，重现性、灵敏度高，对盐耐受性高，样品板便于清洗，同时一定程度下能减少基质效应，不失为一种较好的样品处理技术。 8 结论与展望 20世纪70年代以来，利用质谱来测定多肽、蛋白质、人工合成高聚物等已经取得了长足的进步。而这很大程度上要归因于先进的离子化技术的发展，如: SELDI等。换句话说，这些新技术为我们在分析这些大分子化MALDI，APPI， 合物时，保证了良好的分辨率和准确度。如今，痕量(fmol级别)的多肽和蛋白质的分析鉴定已经日趋成熟，而蛋白质质谱成像和结构确定也变得非常简单。 我们都知道凝胶电泳在分子生物学相关分析中的重要地位，同时，我们也可以断 定，质谱法凭借着它的高灵敏度，高精确性和准确度以及高通量的优势迅速成为 独树一帜的分析方法，以上的应用只是质谱MALDI的应用的一小部分，我们相 [31]信，这些方法和技术在不久的将来会不断完善，同时，新的样品预处理方法， 新脱盐试剂的应用以及新基质的发现，必将把MALDI-TOF的应用推上一个新的 台阶。 参考文献: [1] 飞行时间质谱分析技术的发展 赵冰 沈学静Modern Scientific Instruments 2006 ,4 30-33 [2] 蛋白质组学中基质辅助激光解吸电离的基质研究进展 许亚伟 陆豪杰 杨芃原 分析化 学评述与进展 第35卷 第3期 2007年3月 455,460 [3] Hillenkamp F, KarasM, Beavis RC, et al. 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