【doc】坐骨神经生后发育过程中CNTF基因表达的研究

【doc】坐骨神经生后发育过程中CNTF基因表达的研究 坐骨神经生后发育过程中CNTF基因表达 的研究 ? 论着? 坐骨神经生后发育过程中CNTF基因表达的研究 曹铮姚登兵 (南通医学院神经科学研究所南通,226001) 【摘要】目的观察大鼠生长发育过程中外周神经组织cN1基因表达的变化.方法采用瑚PcR的方法,半定量 分析正常大鼠坐骨神经发育过程中cmIINA表达量.结果正常大鼠生后仅1d,其坐骨神经中即可见cNTFmlIJ~A表达. 但表达量较低;出生14d后,表达量明显增加;30d时表达量达高峰.60d时的表达量稍有下降趋势.结论大鼠出生后其坐骨 神经中c基因表达量随着周围神经的发育过程而有相应的变化.提示在周围神经生后发育过程中具有重要作用. 【关键词】l坐骨神经发育IE-F_~大鼠'.——'.—…—..'—'一一—— mstudy0fthe舭嘲矾oDi?thes(~Eici~ei'Yedu她developmenterratbLrth盘面啪,肺,‰晶哪, Yao帆6.1nsm'u.Fec.?M船口fe.Jvd,22f~01 【A王糟ct】蜢e甜To.bsem廿p唧i叽.fciliryNcm,'Ctmlal~cF吕渐(cF)r.e.mthe 暑c;cn~rveduringdIqm眦 polymerasednIe已Icli叽(瑚PcR)眦,翘artheraIbirth.Methodsngthe肼etmmefp6on- aI瑚吐哼a豁町,themRNA expressionlevelsofCNTFthescla~ier嘲:啦developra~ntofratem6gt 甜.ResultsTheTTIRNA~xpressio~ofCNTF.msciatic |rapFeam~dt}Ialowerle'.~elintheI时dayerratbffth~Itinere~eddgnificandy011the14thdays~'lZemRNAextmmslonlevelofCN 'I~ reachedthepearOtlthe30thdays;AnditbeI;a|ItOdecrease? tEm60thda.Omduslon~xpressionlevelsofl:csses~the changeablecharacterduringseladeIIeedevelopmentafterralNah.hmayanimpoct~.mmlein pcfphcral developmenterb. 【lWords】c汀Fm~LNAsciaticneedevelopmcraRT-PCRmI 神经营养因子是指能够促进神经细胞存活,生 长,分化的一类蛋白质因子….睫状神经节营养园 子(CiliaryNe~mtmphlcFactor,crcr~)最初由Barbin等 人在小鸡眼的抽提物中纯化得到并发现其具有促 进鸡胚睫状神经节神经元存活的作用,故而得名J. 近年来的研究发现,CM|F还能促进多种神经细胞的 存活,在神经系统的发育,分化和损伤的修复过程中 也具有重要的作用J.但关于大鼠外周神经发育过 程中CNTF基因表达的变化方面的研究甚少.为 此,我们采用RT-PCR的方法,半定量分析太鼠生后 发育的不同时期坐骨神经CNTF基因表达的变化. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 I.I材料 健康sD大鼠,由本院实验动物中心提供.Tlaq DNA聚台酶,Tr~ol试剂,SIlpe【spPreamlification SystemforFirstStrandeDNASynthesisKit购自Gibco. BRL公司.一般化学试剂购白上海试剂公司. 国家杰出青年科学基金赞肪(.39425006) 江苏省霄蓝工程资助 1.2引物合成 按CNTF基因序列'4J,由中科院上海植物生理 研究所合成两个寡核苷酸引物,引物序列为:引物 l:5'.CCTCTAGcn1?GcAGAGCAAACA3';引 物2:5'.CCI?TAGACA1=1TrCCCCOC.3'. 其编码区为78—98和677—698,预期扩增产物长度 620bpo 以G3PD(甘油醛.3.磷酸脱氢酶)作为内参,引 物序列为:引物l:5'.C.GN~AA~CAAC-3'; 引物2:5'.1,rccCATI?TcAGCCrI~AC.3'.预期扩增 产物长度为200bp. I.3总RNA提取 分别取生后1d,14d,3od,60d太鼠的坐骨神经 组织100rag,采用Tfizol试剂提取组织中总RNA.每 个样品均经甲醛变性胶电泳检测其RNA完整性. 紫外分光光度计检测各样品中总RNA的含量. I.4eDNA的合成 分别取生后ld,14d,30d,60d大鼠坐骨神经总 RNA5p.g,加入10tanololigo()1Blp.1,DEPE水适 量,使总体积达I2,于7022加热l0mjn,冰浴 2min.再依次加入:10×PCRbul/er2,25mmolMg. 懿制学研究1999年第2【遣莹2j—l^n,J,l塑!!!! cb2I,10?noIdNTPmix(含dATP,dCTP,dGI"P, dnP各10n01)l1,0.1molDDT2l.轻轻混匀后 于42~C孵育5wAn.再加入Supemeript1I反转录酶1 FI(2U/F1),于42~C孵育50rI1in.70~C加热15n终 止反应.置一20~C保存备用. 1.5PCR 以第一链cDNA21A为模板,依次加入cN1下引 物(10pmo1)各1,2n~nol(INFix(含dATP,dCTP, dGTP,TP各2retoo1)2,10×PCR13ti~er5,水 34.,95qc预变性3min后,加入TaqDNA聚台酶 0.5t.a(su/,A),反应总体系为50,~1.PCR反应条件 为:95?变性50s,57?退火45s,72?延伸50s,循环 3O次.每个反应体系中,均加入G3PD的一对引物 (10pmo1)各Il作为PCR扩增的内参.以1.5%琼 脂糖凝胶电泳检测c扩增产物(620bp)和c3PD 扩增产物(200bp).经凝胶图像分析系统,对RT- PCR产物的电泳条带进行密度分析. 1.6统计分析 采用stata统计分析软件,对实验结果进行方差 分析.为了减少误差.将各年龄组CNTF的PcR产 物量与G3PD的PCR产物量之比值来比较. 2结果 正常太鼠生后仅ld,其坐骨神经中即可见 0mragNA表达,但表达量较低;出生14d后,表达 量明显增加;30d时的表达量达高峰,60d时的表达 量稍有下降趋势,方差分析结果表明,生后ld坐骨 神经组织中CNTFmRNA表达量明显低于其它各年 龄组(P均<0,OI);生后14d表达量明显高于Id,但 低于30d和6oa(p均'O.01);30d时表达量明显高 于id,14d(P均<O,01);60d时的表达量虽有下降趋 势,怛与30d相比无显着性差异(P)0,05).结果见 图1和图2. 2.5 2 l,5 l 图1大鼠坐骨神经生后发育过程中cNtaRNA的表达 3讨论 近年来的体内外研究表明,cN1F能够促进神经 细胞的存活,生长,分化和再生,具有广泛的生物活 性-6J.与此形成鲜明对比的是,CNTF在体内的分 布却十分局限.在神经系统中,c限仅存在于周围 的雪旺氏细胞和中枢神经的星状胶质细胞中,轴突 及髓鞘中不存在. Ree等的免疫组织化学研究观察到,在神经 内膜中没有CNTF免疫阳性反应细胞_7J.因而 c嗣[F很可能是由雪旺氏细胞自身台成的.c嗣[F与 神经生长因子不同,为胞质蛋白,其碳端缺乏疏水基 团,一般认为不能自细胞中以分泌方式释放J,可能 通过一种目前尚未了解的机制分泌到细胞外L9J.因 而关于CNTF如何发挥生理作用的学术推论不一, 有学者认为一旦神经损伤发生,雪旺氏细胞中的 c嗣[F得以释放,从而发挥其生物学作用Ll口J.也有 报道.轴突中的CNTF可以通过逆向转运到达胞体, 当神经受损后,感觉神经和运动神经由轴突逆向转 运到达胞体的cM[F大量增加_1【l. Dobrea[佣免疫组织化学法发现,CNTF于生后 8d才出现于大鼠坐骨神经纤维周边的雪旺氏细胞 胞浆内.第4w时达成年动物水平:Stoeki[等用 Noem脚ot法在生后4d的大鼠坐骨神经中检测到 c嗣[FmRNA;而rD等_l用NorthernBlot法在15d胚 龄大鼠体内检测到CNTFmRNA;严志强等?用免 疫组织化学法研究发现,生后1d龄鼠的坐骨神经中 已有CNTF的表达.本研究用敏感的RT-PCR法显 示了太鼠生后ld,其坐骨神经组织中即可见CN'W mRNA的表达.因此可以推论,在新生鼠的坐骨神 经中有低水平的CNlY基因表达.本研究还表明, 幼年时随鼠龄的增加C"IFmRNA的表达量也相应 增加,至30d时达高峰,60d时稍有下降趋势,这表 明新生鼠外周神经组织中C]gI'F基因已开始表达, 随周围神经髓鞘的形成与发育成熟,c嗣[F基因表达 量也相应从{氐至高发生着动态变化;大鼠成年后,其 周围神经生后发育已成熟,0m基因表达量基本维 持在一定的水平,这也反映了在神经生长发育的不 同时期对cNrF的需求量是不相同的. 参考文献 1,BanG,MamhorpM,V~zonS,eta1.Pu曲c口tion0fdck edK8lyne哪pf~lot,】Nou~hem,1994;43(5):1468 解制学研究1999年第2l卷第2}啊mRes,December.I艘!.I..! 一 1478. 2AdlerRciliaryneuro~op[cfactorasOdluryfaet,c~Curtopin inNeumbid.1993;3(5):785,789 3.SendtnerM,Sk~kliKA,Tt-oerlerlH,eta1.Syn【}峨出andlocal? izafiouofciliaryneutotrophicfactorinthesciaticreofthe adidirat丑fIerlesionandduringr8en?60nJCellBid,1992; 118(1):l39 4Stoekli.KA.,LeltspeiehF,~%mdmetM,e【a1.Mdeeular doning,expressionaMrondistribution0fratciliaryrIeu- rel/~ncfnctor.Rature.1989;324(6252):920 5DaviesAM.Rde0fneurom~icfactorsindevelopmentTre~s Genet.1988;4(5):139,143. 6顾晓松,严志强,范明等.Clgl'F和NGF在损伤变性神经组 织中的表达与分布.中华显微外科杂志,1998;21(2):121 7.RendaM.MulrD,PatodahtiE,eta1.Immurm]c~allzafioaofell- iaryneurotropklcfactorinadultratsciaticnerve.Gila,.1992~5 (1):25. 8.IpNY,yancopoulomGDGiliaryrteurottophfofactorandits cep~rcomplexGFactorRe3,1992;4(2):139 9.MeyerM.MatsuokaI,WetmoreC,cta1B?edsyathesisof braidevedneurelrophicfactorinthelesionedpedplmml nervedifferentmechasfisamareresponsibleford】e~eg,lation0f BDNFandNGFw.P~XA.JCellBiofogs,l,ll9(1):45 10.SendnerM.S~orkliKA.TtLoetaenHSyatheslsandk~alization0f ciliaryrteurotropNcfactorrnthesdiatfonei~'e0ftheaduhrataf- terlesionanddur;ngregenemtionJCallBiology. 11CurtisR,A岫,ZhuYreta1.Neurotr~cfactorisin- creasedbyPI,eralIleniry.Nature,1993;365(6443): 253. 12DalxeaGM,Unnemtall皿,RaoMS.Theexpre.zsiort0fCIglF mew,ageandi删HunoavityinthecentralandpIIene VOU5system0ftheratDecBtalnResl992;66(2):209. 13StoekliKA,LouspichF,setn_rM.ela1.Moleculardotting? pre.~'onanddls~bufian0fmtci~atyactu'otropkicfac- tor.Nature,1989;342(6252):920. 14.IpNYrMcClainJ,BarmzaetaNX,eta1.The2componeat0fthe CI',,TFreceptorisre捌forsignalinganddefinespotential a唧targetsintheadultanddurmgdevelotm~entNeuron, 1993:10(1):89. 15.严志强,曹铮,顾晓橙等.睫状神经节营养因子在大鼠坐 骨神经生后发育中的表达.免疫组织化学研究.解剖学 报,l995;26(1):19. 中国解剖学会2000年学术年会征稿通知 庆祝中国解剖学会成立?周年大会暨2O0O年学术年会定于2OO0年10月在北 京召开,现将学术年会的征稿要求通知如 , 一 ,各省,市,自治医学会一定要将征得的论文组织专家评审接专业(人粪学,人体解剖学,神经解剖学,组胚胎学,断层 影像解剖学)分为一类( 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 或墙报),二类(刊登 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 目),并将分好类的论文统一于2000年4月15日(以自5戳为准)以前寄往: 北京东四西大街42号中国解剖学会办公室(邮编1oo7m>. 二,每篇论文摘要收处理费3o元,刊登费5o元(退稿的退还刊登费).请各省市自治区解剖学会在寄论文摘要的同时将 全部费用寄往中国解剖学办公室. 三,论文摘要的具体要求:(1)总字数:限600字.(2)格式;(用16开403字稿纸)?第一行空二格写论文题目;?论文题目 后空一格写作者姓名(二个以上作者,在作者与作者之间空一格不要用逗号);@作者后空一格写单位(学校教研室,科学院 研究所);?单位后空一格写单位所在省,市,自治区;?省,市,自治区后空一格写邮编(二个以上单位的邮编只写主要单位 的.仅跟在主要单位所在省,市自治区之后);@邮编后空一格写摘要内容.(3)摘要内不要附图,表,参考文献.(4)茼化字以 1964年国务院公布的J』J准.(5)计量单位一律使用l984年2月国务院公布的法定计量单位.(6)人体解剖学名词以全国科学 名词审定委员会1991年公布的为准.(7)组织学名词,胚胎学名词以垒国科学名词审定委员告1993年公布的为准(s)隐国 际公认的规范化名词,可用标准的缩略词外.均不得使用自创的缩略词.若涉及大鼠中枢神经专业名词必须使用缩写词时, 可采用(大白鼠中枢神经系统解剖学名词缩写字表)(中国解剖学会神经解剖学专业委员会编写).(9)论文摘要用l6开403 字稍纸打印(不接受手抄搞).(10)凡不符合前连要求或个^直接寄交中国解剖学会,专业委员会或(解剖学杂志)编辑部的稿 件,审稿时一概不予受理(11)凡购".0D年学术年会论文摘要汇编((解剖学杂志>2ooo年23卷增刊)者,可与上悔第二军医 大学<解剖学杂志)编辑部(邮编200433)黄瀛教授联系. 中国解剖学会 1999萆lO月 *举例如下: 三角肌前,后部的运动神经元许家军党瑞山黄赢第二军医大学解剖学教研室上悔200043三伯肌前部的 运动……