缺血药物后处理对离体大鼠心肌线粒体功能

缺血/药物后处理对离体大鼠心肌线粒体功能及心磷脂的影响摘要目的：本研究采用Langendorff离体灌注建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察缺血后处理(IPostC)和线粒体钾通道开放剂二氮嗪（DZ）药物后处理对缺血再灌注损伤大鼠心功能、心肌酶学、心肌氧自由基、心肌线粒体膜电位、心肌线粒体呼吸功能及心磷脂的影响，并探讨KATP通道开放剂在缺血/药物后处理心肌保护中的作用。方法：采用Langendorff装置建立大鼠离体心肌缺血再灌注模型，将SD大鼠随机分为续灌组（C）、缺血再灌注损伤组（CON）、二氮嗪后处理组（DZ）、5-羟葵酸拮抗二氮嗪后处理组（5-HD+DZ）、缺血后处理组（IPO）、5-HD拮抗缺血后处理组（5-HD+IPO）组，每组8例。C组：在Langendorff灌注平衡20min后续灌70min；CON组：平衡20min，缺血前灌注4℃ST.Thomas停跳液，全心缺血40min，复灌30min；DZ组：平衡20min，全心缺血40min，缺血后给予含二氮嗪（50µmol/L）的K-H液灌注5min后，然后再用K-H液复灌注25min；5-HD+DZ组：二氮嗪后处理之前先给予含5-羟葵酸（100µmol/L）的K-H液灌注5min，再用K-H液复灌注20min；IPO组：平衡20min，缺血前灌注4℃ST.Thomas停跳液，全心缺血40min，采用恢复灌注10s、全心停灌10s，连续6次循环(共计2min)，然后再用K-H液复灌注28min,；5-HD+IPO：缺血后处理之前先给予含5－羟葵酸（100µmol/L）的K-H液5min，再用K-H液复灌注23min。观察：1.平衡末及再灌注末各组不同时间心功能及心肌酶学的变化；2.平衡末及再灌注末取心肌并分离、制备线粒体，观察线粒体膜电位及氧自由基的变化；3.平衡末及再灌注末取心肌并分离、制备线粒体，观察线粒体呼吸功能的变化；4.平衡末及再灌注末取心肌并分离、制备线粒体，提取线粒体总磷脂，观察各组线粒体心磷脂含量的变化。结果:1.心功能（HR、CF、LVDP、LVEDP）、心肌酶学（LDH、CK）、线粒体膜电位（Δψ）：各组内再灌注末的心功能、心肌酶学及线粒体膜电位与平衡末比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；再灌注末：CON组与C组比有极显著差异(P<0.01)；DZ组与IPO组的心功能、心肌酶学、线粒体膜电位优于CON组(P<0.01)，但不及C组(P<0.05或P<0.01)；5-HD+DZ组与CON组比无明显差异，而与C组、DZ组及IPO组比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。5-HD+IPO组与CON组及IPO组比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。2.线粒体ROS及呼吸功能（3态呼吸、RCR、P/O）：各组内再灌注末的ROS及呼吸功能与平衡末比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；再灌注末：CON组与C组比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；再灌注末以琥珀酸为底物时DZ组及IPO的线粒体ROS生成减少及呼吸功能明显优于CON组(P<0.01)，但不及C组(P<0.05)；5-HD+DZ组与CON组比无明显差异，而与C组、DZ组比有显著性差异(P<0.01)；再灌注末以苹果酸/谷氨酸为底物时DZ组与5-HD+DZ组及CON组比没有明显差异，IPO组再灌注末的ROS及呼吸功能与CON组及C组比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；5-HD+IPO组与C组、CON组和IPO组比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；再灌注末：以维生素C/TMPT为底物时，DZ组的呼吸功能（3态呼吸、RCR）与5-HD+DZ组及CON组比没有统计学差异，但5-HD+IPO组与C组、CON组和IPO组比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。3.线粒体心磷脂含量：各组内再灌注末与平衡末比均有极显著差异（P<0.01）；再灌注末：CON组心磷脂与C组比有极显著差异（P<0.01）；DZ组与IPO组的心磷脂明显高于CON组（P<0.01），但低于C组（P<0.01）；5-HD+DZ组与C组及DZ组有显著性差异（P<0.01,P<0.05），与CON组没有统计学差异，5-HD+IPO组与C组、CON组和IPO组比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。结论：1.IPostC和DZ能改善缺血再灌注大鼠心脏的心功能、保护线粒体膜电位、减少线粒体ROS的产生、保护线粒体呼吸链及心磷脂含量，产生心肌保护作用。2.选择性线粒体ATP敏感性钾通道拮抗剂5-HD能够完全拮抗DZ的心肌保护作用，部分抵消IPostC的心肌保护作用。3.IPostC和DZ通过激活ATP敏感性线粒体钾通道产生心肌保护效应，ATP敏感性线粒体钾通道是产生心肌保护的效应器。4.线粒体ATP敏感性钾通道的开放与保护线粒体膜电位、减少线粒体ROS的产生、保护线粒体呼吸链及心磷脂含量，可能是IPostC、DZ后处理产生心肌保护作用的机制之一。关键词：心磷脂；线粒体功能；二氮嗪；后处理；缺血再灌注损伤；心肌保护AbstractObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofisolatedratmyocardialmitochondriafunctionandcardiolipinbyischemic/pharmacological（diazoxide）postconditioningduringischemia/reperfusionwiththeLangendorffapparatusandtoconsidertheroleofopeningthemitochondrialATP-sensitivepotassiumchannel(mitoKATP)inmyocardialprotectionduringischemic/ischemic.MethodsLangendorffapparatuswereusedtoestablishthemodelofmyocardialischemiareperfusioninjury.Sprague-Dawleymaleratswererandomizedintosixgroupsof8each:continuousgroup(C)、controlgroup(CON)、diazoxidepostconditioninggroup(DZ)、5-hydroxydecanoate(5-HD)plusdiazoxidegroup(5-HD+DZ).Ischemicpostconditioning(IPO)and5-HDplusIPOgroup(5HD+IP).HeartsisolatedfromSDratsweremountedonaLangendorffapparatusandstartedwitha20-minperfusionforequilibration.Cwentonperfusionforanother70minutesafterequilibration.CONunderwent40minutesglobalischemiaandfollowedby30minutesreperfusion.DZstartedwith20-minperfusionforequilibration，underwent40minutesglobalischemia，DZ(50μmol/L)earlyirrigationrehabilitationtreatmentafter5min，andreperfusion25min;5-HD+DZwasperfusedwith5-HD（100μmol/L）beforeDZandthesameprocedurewascarriedoutinDZgroup.IPOstartedwith20-minperfusionforequilibration，underwent40minutesglobal，perfusion10secnds,underwent10secnds,continuoussixsecondarycyclesandperfusion28minute.5-HD+IPOwasperfusedwith100μmol/L5-HDbeforeIschenmicpostconditioningandthesameprocedurewascarriedoutinIPOgroup.Thefollowingparametersweresmeasured:1.Therecoveryofmyocardialfunction:heartrate(HR)、Coronaryflow(CF)、leftventricularend-diastolicpressure(LVEDP)、leftventriculardevelopedpressure(LVDP)、andmeasuredactivityofactatedehydrogenase(LDH)andcreatinekinase(CK);2.reactiveoxygenspecies（ROS）productionrateandmitochondrialmembranepotential(MMP);3.mitochondrialrespiratoryfunction;4.mitochondriallipidswereextractedandcardiolipinweredeterminedwithHPLC.Results(1)WhenDZandIPOcomparedwithC,therewasworsemyocardialfunction、myocardiumcreataseandMMPattheendofreperfusion(P<0.01).Therefore,WhenDZ、IPO、5-HD+IPOcomparedwithCON,myocardialfunction、myocardiumcreataseandMMPwasimprovedsignificantly(P<0.05orP<0.01)).WhenDZcomparedwith5-HD+DZandIPOcomparedwith5-HD+IP,therewerealsosigni-ficantdifferencesinmyocardialfunction、myocardiumcreataseandMMP(P<0.01).(2)WhenDZandIPOcomparedwithC,therewasworsemitochondrialrespiratoryfunctionandincreaserateofgenerationofROS(P<0.01).Therefore,WhenDZ、IPO、5-HD+IPOcomparedwithCON,improvedrespiratoryfunctionanddecreaserateofgenerationofROSwassignificantasSuccinatesubstrate(P<0.05orP<0.01).WhenDZcomparedwith5-HD+DZandIPOcomparedwith5-HD+IPO,therewerealsosignif-icantdifferencesin(P<0.01).mitochondrialrespiratoryfunctionandrateofROSgeneration(P<0.01).ButwhenIPOcomparedwithCONand5-HD+IPO,therewasbettermitochondrialrespiratoryfunctionanddecreaserateofgenerationofROSasmalate/Glutamatesubstrate(P<0.05orP<0.01),andtherewasbettermitochondrialrespiratoryfunctionasvitaminC/TMPTsubstrate(P<0.05orP<0.01).(3)Thecardio-lipincontentinDZandIPOarehigherthanthatofCON、5-HD+DZand5-HD+IPO(P<0.01),butworsethanthatofCgroup(p<0.01).5-HD+IPOgroupweresignifica-ntlyhigherthaninCONgroup(P<0.01).Conclusions:1.Diazoxideprostconditioningandischenmicpostconditioningcouldimprovemyocardialfunctio、decreasemyocardiumcreatase、decreaserateofgenerationofROS、maintainingMMP、preservingmitochondrialfunctionandmyocardialmitochondrialcardiolipin,whichinvolvedinbettercardioprotection.2.AsamitochondrialATPsensitivepotassiumchannelantagonist,5-hydroxydecanoatecouldabolishabsolutelythediazoxidepostconditioningcardioprotectioneffectsofafterend-reperfusion,butonlyabolishpartlyischenmicpostconditioningcardioprotection.3.DiazoxidepostconditioningandischenmicpostconditioningactivesmitochondrialATPsensitivepotassiumchannelandprotectstheratheartagainstischemia-reperfusioninjury，whilemitochondrialATPsensitivepotassiumchannelsmayactastheeffectorsofcardioprotection.TheopeningofmitochondrialsensitivechannelsanddecreaserateofgenerationofROS、maintainingMMP、preservingmitochondrialfunctionandmyocardialmitochondrialcardiolipinanddecreaserateofgenerationofROS、maintainingMMP、preservingmitochondrialfunctionandmyocardialmitochondrialcardiolipinmaybeoneofthecommonmechanismsagainstmyocardialischemia/reperfusioninjury.Keywords:ischemiareperfusioninjury;postconditioning;Diazoxide;cardiolipin;mitochondriafunction;myocardialprotection前言 随着心外科手术、心肺分流术（cardopulmonarybypass,CPB）、冠状动脉旁路移植术（coronaryarterybypassgrafting,CABG）、心血管栓塞再通、心脏移植及经皮冠状动脉介入治疗(percutaneoustransluminalcoronaryintervention，PCI)等术后均涉到心肌缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,IRI)。Jennings首先于1960年提出IRI，系指心肌遭受一定时间缺血、缺氧以后，在恢复血流与氧供时，受损心肌功能不但不能得以恢复，反而发生更为严重甚至是不可逆的损伤。因此，如何减轻IRI具有重要临床意义与社会效益，IRI成为心肌保护的研究热点。1986年Murry[2]等通过对犬心脏研究发现，经过短暂几次缺血再灌注处理，机体对随后缺血损伤的耐受性增强， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现为心律失常减少，心肌收缩力增加，心肌梗死面积下降，此现象称之为缺血预处理(ischemicpreconditioning,IP)。随后在不同种属、器官和细胞水平的研究也证实IP具有明确的心肌保护作用。目前，人们对IRI发生的机制及如何预防、减轻IRI进行了大量的实验研究。喻田等[13]报道CPB时犬心ATP敏感性钾通道(KATP)的开放，能诱导超极化停搏产生心肌保护效果。傅小云等[14]报道MitoKATP早期开放参与超极化停搏，其作用可能通过保护再灌注后的线粒体呼吸功能，减轻线粒体的氧化损伤，为再灌注心肌提供较好的能量供应，从而使缺血再灌注后的心肌收缩功能得到一定的恢复。季勇[15]认为缺血及药物（二氮嗪）预处理能够开放MitoKATP，保护细胞“能量工厂”线粒体的结构和功能，对IRI大鼠心肌产生保护作用，充分说明预处理与线粒体及KATP在IRI中的作用与地位。但由于这种预处理需在缺血前实施,故使其临床应用价值受限。Zhao[16]等动物模型,于再灌注开始时,连续给予3次,每次30s再灌注,30s闭塞,发现其同缺血预适应一样可减轻再灌注损伤。并首先提出了缺血后处理的概念:再灌注早期,重复给予几次短暂冠脉闭塞与再通,可明显减轻再灌注损伤。随后的研究证明,缺血后适应可减少再灌注心律失常的发生[17]。Staat等[18]多次将缺血后适应用于临床,其选择接受PCI和支架治疗的患者,给予重复4次冠脉再灌注闭塞,每次1min并以酶的释放作为心肌梗死严重程度的指标,发现缺血后适应可使心肌梗死程度减轻。缺血后处理主要作用于心肌再灌注早期,与缺血预处理对再灌注后心肌具有类似的保护效果。一、后处理研究现状后处理包括缺血后处理(ischemicpostconditioning,IPostC)和药物后处理。药物后处理的发展起源于对IPostC机制的深入研究，并支持IPostC的ATP敏感性钾通道学说。研究发现IPostC与KATP活化机制可能存在密切联系。Yang[19]等在兔在体心模型研究中，给缺血后处理组分别加入非选择性KATP抑制剂格列苯脲和选择性mitoKATP抑制剂5-羟基葵酸盐(5-HD)，发现均能抵消IPostC的心肌保护作用，证实IPostC与KATP的开放有关，KATP的开放可能既是终末效应机制之一,又是信号传导的成份之一。二、线粒体与缺血再灌注损伤线粒体呼吸链由一系列的酶和辅酶组成，从呼吸底物产生的化学还原当量（即氢原子和它的电子）通过酶和辅酶的氧化还原作用在呼吸链上进行传递，在传递中形成三次重要的还原电位的降低，每次均使质子泵出到线粒体膜间隙，从而形成了跨线粒体内膜质子电化学梯度H，H驱动质子顺浓度梯度返回线粒体基质时，释放的能量用ADP磷酸化合成ATP，同时，电子被传递给氧最终生成水。生理情况下，H大部分(约99%)以膜电位Δψ的形式存在，Δψ是促使核基因编码复制的线粒体呼吸链成分和ATP合酶亚单位能顺利穿过线粒体膜进入线粒体[19]内的动力，也是线粒体摄入呼吸底物和磷酸化以及ADP与ATP进行正常交换的先决条件。跨膜电位内室为负,外室为正。正常的线粒体跨膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的先决条件,是保持线粒体功能所必需的[20]。线粒体是生物能量代谢的重要场所,为细胞的各种生命活动提供基础能量,但线粒体同时也是自由基产生的主要来源[21],线粒体受到损害时会产生大量的自由基，自由基和钙超载是引起IRI的主要原因[22]，心肌细胞内钙超载可引起线粒体通透性转换孔(mtochondirialpermeabilitytransitionpore,MPTP)开放[23]。Kin等证实IPostC可减少活性氧族（reactiveoxygenspecies,ROS）和丙二醛(Malondi-aldehyde,MDA)生成量，缓解细胞内和线粒体内钙超载。此外,线粒体磷脂中含有较大量的多不饱和脂肪酸。线粒体的这种结构特点决定线粒体极易受到自由基的损伤,致使线粒体功能受损,细胞死亡和凋亡的发生。线粒体呼吸分为5种状态,其中3、4态意义较大。呼吸3态为线粒体中加入ADP和底物时的快速氧化期；当ADP耗尽时为4态呼吸，主要反映膜的通透性。3与4态的比值即为呼吸控制率(respiratorycontrolratio,RCR),它的下降表示线粒体氧化磷酸化能量生成偶联松弛。此外,有研究表明mitoKATP开放剂的细胞保护作用的另一种可能机制是减少线粒体中自由基的产生[24]。三、心磷脂与缺血/再灌注损伤磷脂作为膜磷脂双层分子的基本结构之一，IRI时含量明显减少，并且与线粒体呼吸功能及ROS关系密切。最近在离体兔或鼠心中发现，缺血或缺血再灌注后，线粒体心磷脂（cardiolipin,CL）含量减少，细胞色素C(cytochromeC,cyt-c)丢失，呼吸链复合体I[25]、细胞色素C氧化酶(cytochromeCoxidase,Cyt-OX)活性均降低[26]，从而影响线粒体的呼吸功能。心肌缺血30min～45min后可导致肌纤维膜下线粒体（SSM）内CL选择性耗竭，CL含量的减少与Cyt-OX功能降低的程度及发生的时间相一致[27]，加入外源性CL后，IRI或老龄心肌内Cyt-OX的电子传递活性可完全恢复，加入其它磷脂或氧化心磷脂（CLOOH）则不能产生此作用[28]。以复合体Ⅰ抑制剂鱼藤酮（rotennone）抑制电子传递活性使ROS生成增加，出现复合体Ⅲ的活性及CL含量平行下降，以超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）减少ROS或加入外源性CL均可预防ROS导致的复合体Ⅲ的失活。由此可见CL的减少成为缺血期间线粒体呼吸功能的损害和再灌注期间线粒体来源的氧化损伤的相关因素[29]。综上所述，缺血后处理已成为心肌保护的新策略，但其保护机制，以及与KATP的关系等还需进一步研究。目前，抗心肌IRI的研究主要集中在缺血预处理与mitoKATP方面，而对mito-KATP通道后处理与心肌保护之间的呼吸功能、膜电位与CL的关系以及是否参与心肌保护作用鲜有报道。本研究拟采用Langendorff离体心脏灌注技术模拟临床IRI，应用IPostC与特异性mitoKATP通道开放剂二氮嗪（diazoxide,DZ）药物后处理及其特异性mitoKATP通道拮抗剂5-羟葵酸(5-hydroxydecanoate,5-HD)，观察对缺血再灌注心脏功能、心肌酶学、线粒体呼吸功能、膜电位和心磷脂的影响，为临床心肌保护作用提供进一步的理论依据。第一部分二氮嗪后处理对离体大鼠心肌线粒体功能和心磷脂的影响应用Langendorff离体心脏灌注技术，常温缺血再灌注，模拟临床缺血再灌注损伤实验，观察各组再灌注末离体大鼠心脏功能、心肌酶学、线粒体氧自由基、线粒体膜电位、线粒体呼吸功能及线粒体心磷脂的变化。观察二氮嗪后处理对离体大鼠心肌线粒体功能和线粒体心磷脂的影响，探索二氮嗪后处理对心肌线粒体功能及心磷脂是否具有保护作用，并推测其作用位点可能是线粒体ATP敏感性钾通道。一、二氮嗪后处理对离体大鼠心功能及心肌酶学的影响1.试验材料1.1实验动物清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠64只，(体重250～350g)（第三军医大学试验动物中心）。动物证书号：SCXK-（军）2007-017。1.2 主要试剂： 二氮嗪（DZ）（美国Sigma公司） 5-羟葵酸（5-HD）（美国Sigma公司） 肌酸激酶（CK）试剂盒（南京建成生物技术研究所） 乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成生物技术研究所） 其余试剂为国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯1.3主要配液 Kerbs-Henseleit缓冲液（成分单位：mmol/L）NaCl：118.00，KCl：4.75，CaCl2：2.50，NaHCO3：24.80，MgCl2•6H2O：1.19，KH2PO4：1.19，glucose：11.1。灌注前用95%氧和5%二氧化碳平衡10min，pH=7.35-7.45、PO2≥80KPa、PCO24.6-5.8KPa. ST.Thomas停跳液（成分单位：mmol/L）NaCl：110.00，KCl：16.00，CaCl2：1.20，MgCl2：16.00，NaHCO3：10.00pH7.8. 所有Kerbs-Henseleit缓冲液及ST.Thomas停跳液均经过0.22uM微孔滤膜过滤，用95%氧和5%二氧化碳平衡前负压脱气10min。1.4主要仪器 Langendorff离体心脏灌注模型（西班牙，PanLab公司） Powerlab/8SP实验数据采集系统（澳大利亚，ADInstrument公司） DU800紫外分光光度计（弗科斯科技有限公司，美国） 213型pH计（北京哈纳科仪科技有限公司，罗马利亚） BS224S电子天平（北京赛多利思仪器系统有限公司，德国） S-Ⅲ型循环水浴真空泵（上海） 420型电热恒温水温箱（国产，全坛市富华公司） 5804R型Eppendorf台式高速冷冻离心机（德国，Eppendorf公司） DIG-303A型艾柯超纯水器（成都唐氏康宁科技发展有限公司，中国）2.试验方法2.1离体大鼠Langendroff全心缺血/再灌注模型的建立 麻醉与抗凝：腹腔注射异戊巴比妥钠（40mg*kg-1）、肝素（250u*kg-1）。 手术：麻醉后迅速剑突下沿着肋缘剪开腹壁，打开膈肌，沿着两侧腋前线剪开胸壁并上翻头侧，于心脏根部保留主动脉3-4mm剪下心脏，立即放入预冷的K-H液（4℃），轻轻挤压心脏洗清残留血液。 心脏灌注：液面下主动脉插管，固定置于Langendorff灌注管口。用37℃预先氧平衡的K-H液心脏逆行灌注（灌注压力75-85mmHg），心脏跳动后于左心耳剪一小口，将带有乳胶水囊的测压管经二尖瓣插入左心室，连接Powerlab/8SP生物机能试验压力换能器系统，调节水囊使LVEDP为4-8mmHg。2.2动物分组将64只SD大鼠随机分为4组：续灌组（C）、对照组（CON）、二氮嗪后处理组（DZ）、5－羟葵酸拮抗二氮嗪后处理组（5-HD+DZ）。2.3灌注 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载  选择心脏标准：离体心脏37℃的K-H液平衡灌注20min，平衡后HR>250次/分、LVSP>10Kpa、室性早搏〈2个/分，未达条件舍弃。 处理方式：C组平衡后无处理续灌70min；CON组平衡20min,常温下缺血40min，再次灌注37℃含氧灌注液30min；DZ组于缺血后主动脉逆灌二氮嗪5min，再次灌注37℃含氧灌注液25min；5-HD+DZ组于缺血后主动脉逆灌主动脉灌注5-HD100µmol/L持续5min，然后再灌注50µmol/L二氮嗪5min，再次灌注37℃含氧灌注液20min。 停跳与再灌注：灌注4℃ST.Thomas停跳液10ml/Kg，继之停止灌注泵造成全心缺血，所有心脏在常温下缺血40min后，再次灌注37℃含氧灌注液30min。◆ 各组灌注方案：T1：平衡20min末T2：再灌注30min末 数据采集：于T1、T2采集各项观察指标。2.4心脏功能测定 数据采集：分别于T1、T2采集心脏功能参数。 参数测量和计算：记录心率（HR）、冠状动脉流量（CF）和左心室舒张末压（LVEDP）及左心室发展压（LVDP）。2.5心肌酶学 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 标本的收集各组T1、T2时刻收集冠脉流出液2ml，用于LDH及CK的检测。2.5.1LDH检测： 操作步骤按试剂盒说明进行。蒸馏水调零，440nm处1cm光径比色，测各管吸光度（OD值）。 计算方法：LDH活力(U/ml)＝× 定义：1000ml标本37℃时与基质作用15min，产生1μmol丙酮酸为l个单位。2.5.2CK的测定 操作步骤按试剂盒说明进行。蒸馏水调零，660nm处1cm光径比色，测各管吸光度（OD值）。 计算方法：CK活力(U/ml)＝×标准品的酶活力 （标准品浓度为4mg/ml，1mg的酶活力为35活力单位。）3统计学方法：所有数据用均数±标准差(±s)表示，各组间数据计量 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 用SPSS17.0统计软件行单因素方差(ANOVA)分析，组内比较采用重复测量数据的方差分析，P<0.05时认为有统计学意义。4结果4.1心功能的变化四组离体鼠心平衡T1、T2：HR、CF、LVDP、LVEDP结果如下：T1所有指标组间及组内比较没有显著差异；T2与T1均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；T2：CON组的HR、CF、LVDP、LVEDP与C组比有极显著差异(P<0.01)；DZ组的HR、CF、LVDP、LVEDP优于CON组(P<0.01)但不及C组(P<0.05或P<0.01)；5-HD+DZ组与CON组比无明显差异，而与C组、DZ组有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。（见表一～二；图一～四）表一各组缺血前后离体心脏心脏HR和CF的变化(n=8,±s)组别T1T2HR CF(beats/min)(ml/min)HRCF(beats/min)(ml/min)C330.00±41.7518.88±2.84292.25±23.67d′15.13±1.83d′CON332.88±40.6118.69±3.50183.50±18.54ad7.00±0.89adDZ329.50±32.2819.00±4.24247.50±26.59abd12.00±1.54a′bd5-HD+DZ329.38±34.8818.81±4.17190.13±18.98acd7.94±1.27acdT2：与C组比aP<0.01,a′P<0.05；与CON组比bP<0.01，b′P<0.05；与DZ组比cP<0.01；与T1比dP<0.01，d′P<0.05。图一：各组缺血前后离体心脏HR的变化T2：与C组比＃P<0.01；与CON组比﹡P<0.01；与DZ组比△P<0.01；与T1比＆P<0.01，§P<0.05。图二：各组缺血前后离体心脏CF的变化T2：与C组比＃P<0.01，※P<0.05；与CON组比﹡P<0.01；与DZ组比△P<0.01；与T1比＆P<0.01，§P<0.05。表二各组缺血前后离体心脏心脏LVEDP和LVDP的变化(n=8,±s)组别T1T2LVEDPLVDP（mmHg）（mmHg）LVEDPLVDP（mmHg）（mmHg）C7.71±0.1997.35±9.7611.38±1.20d79.32±1.83d′CON7.79±0.2098.00±13.9133.18±5.62ad42.63±5.85adDZ7.81±0.2096.68±7.6022.27±3.13abd61.89±5.80abd5-HD+DZ7.80±0.2195.33±9.5732.73±4.48acd45.90±4.54acdT2：与C组比aP<0.01；与CON组比bP<0.01；与DZ组比cP<0.01。与T1比dP<0.01。图三：各组缺血前后离体心脏LVEDP的变化T2：与C组比＃P<0.01，※P<0.05；与CON组比﹡P<0.01；与DZ组比△P<0.01；与T1比＆P<0.01。图四：各组缺血前后离体心脏LVDP的变化T2：与C组比＃P<0.01；与CON组比﹡P<0.01；与DZ组比△P<0.01；与T1比＆P<0.01，§P<0.05。4.2心肌酶学的变化四组离体大鼠心脏T1及T2心肌酶（LDH及CK）结果如下：T1心肌酶组间及组内比较无明显差异；各组内T2与T1有极显著差异（P<0.01）；T2：CON组LDH、CK与C组比有极显著差异(P<0.01)；DZ组LDH、CK明显优于CON组(P<0.01)，但不及C组(P<0.01)；5-HD+DZ组与CON组无统计学差异，而与C组、DZ组有极显著差异(P<0.01)。（见表三、图五～六）表三各组缺血前后离体心脏LDH和CK的变化(n=8,±s)组别T1T2LDHCK(U/ml)(U/ml)）LDHCK(U/ml)(U/ml)）C22.33±0.6884.12±3.0328.72±5.35d104.44±21.87d′CON22.80±2.9282.06±6.0753.01±5.78ad172.71±10.66adDZ22.29±0.6985.35±5.3835.44±6.81abd127.11±12.00abd5-HD+DZ21.48±2.3085.54±4.6450.23±5.34acd168.34±17.75acdT2：与C组比aP<0.01；与CON组比bP<0.01；与DZ组比cP<0.01；与T1比dP<0.01。图五：各组缺血前后离体心脏LDH的变化T2：与C组比＃P<0.01，※P<0.05；与CON组比﹡P<0.01；与DZ组比△P<0.01；与T1比＆P<0.01。图六：各组缺血前后离体心脏CK的变化T2：与C组比＃P<0.01；与CON组比﹡P<0.01；与DZ组比△P<0.01；与T1比＆P<0.01，§P<0.05。二、二氮嗪后处理对离体大鼠心肌线粒体膜电位、活性氧的影响利用Langendorff离体心脏灌注模型，用二氮嗪后处理进行常温缺血再灌注离体心脏实验，比较不同组再灌注末离体大鼠心肌线粒体膜电位、活性氧的变化。1.试验材料1.1实验动物：同第一部分实验一。1.2主要试剂 HEPES（华美生物，中国） Trhalos（中诺生物工程有限责任公司，中国） AmplexRed（Invitrogen公司，美国） 辣根过氧化氢酶（华美生物，中国） TMPD（Sigma公司，美国） 琥珀酸（华美生物，中国） 苹果酸（华美生物，中国） 谷氨酸（华美生物，中国） 维生素C（华美生物，中国） EGTA（华美生物，中国） EDTA（华美生物，中国） BSA（华美生物，中国） FCCP（Sigma公司，美国） 罗丹明123（Rhodamine123）（Sigma公司，美国） Bradford蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所，江苏）1.3主要液体配制 线粒体分离液（成分单位mmol/L）Trhalos：300，HEPES：10，KCl：10，EGTA：1，EDTA：1；BSA1%，pH7.4。 线粒体H2O2测定介质（成分单位mmol/L）sucrose：250，MOPS：10；KH2PO4：5，AmplexRed：0.05，辣根过氧化氢酶：0.2U/mL，pH7.4。 线粒体膜电位测定介质（成分单位mmol/L）KCl：130，KH2PO4：5，MOPS：20,EGTA：2.5，Succinate：5，BSA0.1%，pH7.15。 所有液体均经过0.22uM微孔滤膜过滤，用95%氧和5%二氧化碳平衡前负压脱气10min。 其余配液同第一部分实验一1.4主要仪器 荧光分光光度计（Eclipse，Varian公司，美国） 内切式速高速均质器（T8，IKA公司，德国） 高速冷冻离心机（Eppendorf5804R，Eppendorf公司，德国）； 酶标仪（ELX800宝特BIO-TEK美国）； -80℃低温冰箱（捷克） 其余仪器见第一部分实验一2.试验方法2.1离体大鼠Langendroff全心缺血/再灌注模型的建立、动物分组、灌注方案：均同第一部分实验一。数据采集：于T1及T2取下心脏，提取心肌线粒体，测定线粒体膜电位、活性氧。2.2心肌线粒体提取于T1及T2取心脏标本，参照Yamaguchi等[1]的方法，适当修改，进行心肌线粒体提取。提取过程简述如下：各灌注终点取心脏后，立即将心脏在4℃线粒体分离液（10ml/g心肌组织）中剪碎，内切式速高速均质器匀浆（破碎头8G，设置6，时间5秒），600g离心10min，取上清，3600g离心15min取沉淀，取等量分离液将沉淀重新分散悬浮，1000g离心5min，取上清，5500g离心10min，取沉淀，再次分散于适量分离液中。2.3线粒体蛋白定量2.3.1线粒体蛋白定量测定原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合[2]。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。2.3.2线粒体蛋白定量方法：参照Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书，简述如下：1.完全溶解蛋白标准品，取10μL稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。2.将标准蛋白按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。3.加3uL线粒体悬浮液到96孔板的样品孔中，加纯水稀释液到20μL。4.各孔加入200μLG250染色液，室温放置4min。5.用酶标仪测定A595。6.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。2.4线粒体膜电位（Δψ）测定2.4.1测定原理：线粒体膜电位由三部分组成[3]：1.根据Mitchell化学渗透学说，线粒体呼吸链在电子传递的过程中，同时发挥着质子泵的作用，将H+泵出膜外形成线粒体能化态的膜电位差；2.生物膜对离子的通透性差异而产生的扩散电位，但是在线粒体中由于有平衡离子的补偿，扩散电位是瞬息的；3.当膜对平衡离子完全不通透的情况下，线粒体内部蛋白及磷脂头部的固定的负电荷会形成“静息的Donnan电位”；4.阳离子荧光探针Rhodamine123在电化学梯度的驱动下进入线粒体，形成线粒体内外的浓度差[4,5]；加入氧化磷酸化解偶联剂（FCCP）后，线粒体膜电位消失，Rhodamine123再次进入测定介质，用荧光分光光度计可测出此浓度，根据Nernst方程：Δψ＝59.5lgXin/Xout可计算出线粒体的膜电位。2.4.2具体方法简述如下[6]：线粒体膜电位测定介质预热至37℃，取2mL转移至3mL石英杯反应体系，放入磁力转子，50％最大转速，调零；加入Rhodamin12310uL，至终浓度约50nM，测定Rhodamin123的荧光强度，根据Rhodamine123的标准曲线，计算反应体系中Rhodamine123的总量；加入一定量的线粒体悬液，至终浓度为0.2mg/mL，可观察到荧光强度的迅速下降（线粒体对荧光强度的吸收作用）后紧跟着缓慢下降（Rhodamne123随线粒体膜电位的建立而缓慢进入线粒体内），1～2min后荧光强度稳定，线粒体建立了稳定的膜电位，随即加入羰基氰酯-3-氯苯基腙（carbonyl-cyanide3-chlorophenylhydrazone,FCCP），膜电位消失，线粒体内Rhodamine123重新回到反应介质，荧光强度再次增强，1～2min后稳定（图七）。线粒体密度是1.09g/mL，线粒体蛋白占线粒体总重量的25％，线粒体基质中的水空间为线粒体总体积的65％。由此可得到线粒体膜电位计算公式：1）当线粒体存在稳定的膜电位Δψ时，线粒体外反应介质Rhodamne123浓度（Rhodamne123外）=R123×F1÷F2；2）线粒体基质水体积（Mitio）=线粒体蛋白百分比×反应体系体积÷线粒体密度×线粒体基质水体积百分比；3）线粒体中Rhodamne123总量=反应体系总量－反应基质总量=（R123-R123×F1÷F2）×反应体系体积；4）根据Nerst方程：Δψ＝59.5lgXin/Xout=2.4.3Rhodamine123浓度测定原理根据Lambert-Beer光吸收定律：A＝－lgT＝εbc，即吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。制定标准曲线，得到浓度吸光度曲线方程：C=9.521×A-0.014，证实Rhodamine123浓度在10-6－10-7时符Lambert-Beer光吸收定律。2.4.4线粒体膜电位的变化线粒体膜电位测定介质中加入适量Rhodamin123后，有显著的荧光强度改变。加入线粒体后，随线粒体呼吸，膜电位的逐步建立，Rhodamin123进入线粒体，荧光强度逐渐下降，1～2min后达到稳态；加入FCCP，线粒体膜电位消失，Rhodamin123迅速从线粒体内释放进入测定介质，荧光强度迅速增强。图七：离体心肌线粒体膜电位2.5线粒体活性氧测定2.5.1基本原理线粒体活性氧生成速率采用荧光探针法测定。线粒体生成的ROS通过生成的可以通过线粒体外膜的电压门控通道（voltage-dependentanionchannels，VDAC）进入反应介质，在非酶促反应的作用下生成H2O2（加入超氧化物歧化酶不能增加H2O2的生成速率，说明非酶促反应催化生成H2O2已足够的迅速而且完全），H2O2在辣根过氧化氢酶的作用下，与荧光探针AmplexRed反应，生成荧光物质resorufin，其最大激发波长和发射波长分别是571nm，585nm。2.5.2具体方法方法依照参考文献[7]，稍作改进，简述如下。线粒体H2O2测定介质预热至37℃，取2mL转移至3mL石英杯反应体系，放入磁力转子，50%最大转速。标准曲线采用在测定介质中加入已知量的H2O2绘制。线粒体H2O2测定介质加入线粒体10uL，线粒体蛋白终浓度0.05mg/ml，调零；随即加入反应底物（琥珀酸或者苹果酸/谷氨酸）5uL，终浓度分别为5mM或者2.5mM和5mM，记录30min内的荧光强度变化（图八）；在不加入线粒体的条件下重复一次，做为背景荧光扣除。2.5.3计算H2O2的生成速率根据标准曲线转换为H2O2含量，计算H2O2的生成速率（nM·30min-1·mg-1pro）。线粒体H2O2测定介质的荧光强度在加入线粒体后稳定、匀速的增加。图八：离体大鼠心肌ROS的变化3.结果3.1线粒体膜电位的变化四组离体大鼠心脏T1及T2的Δψ结果如下：T1的Δψ组间及组内比较无明显差异；各组内T2与T1均有极显著差异（P<0.01）；T2：CON组的Δψ与C组比有极显著差异(P<0.01)；DZ组Δψ明显优于CON(P<0.01)组，但不及C组(P<0.01)；5-HD+DZ组与CON组没有统计学差异，而与C组、DZ组有极显著差异(P<0.01)。（见表四、图九）表四各组缺血前后离体心肌线粒体膜电位的变化(n=8,±s)组别Δψ（mv）T1T2C190.87±6.07163.93±11.10dCON187.16±4.19103.31±17.86adDZ187.22±6.64132.19±14.11abd5-HD+DZ189.41±13.68100.97±14.93acdT2：与C组比aP<0.01；与CON组比bP<0.01；与DZ组比cP<0.01；与T1比dP<0.0。图九：各组缺血前后离体心肌线粒体膜电位的变化T2：与C组比＃P<0.01；与CON组比﹡P<0.01；与DZ组比△P<0.01；与T1比＆P<0.01。3.2离体大鼠心肌线粒体ROS的变化四组离体大鼠心肌T1、T2ROS结果如下：T1组间及组内比较无明显差异；各组内T2与T1有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；T2：CON组与C组比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；T2以琥珀酸为底物时DZ组明显优于CON组(P<0.01)，但不及C组(P<0.05)；5-HD+DZ组与CON组无统计学差异，而与C组、DZ组有极显著性差异(P<0.01)；T2以苹果酸/谷氨酸为底物时DZ组与5-HD+DZ组及CON组无统计学差异。（见表五、图十～十一）表五各组离体大鼠心肌ROS的变化(nM·30min-1·mg-1pron=8±s)组别时间ROS(nM·30min-1·mg-1pro)苹果酸/谷氨酸琥珀酸CTIT225.93±3.3833.12±3.53d′35.07±3.4945.30±6.91d′CONTIT225.11±5.3657.14±6.56a′d34.63±2.4569.27±5.78adDZTIT224.83±1.6357.73±7.27ad33.58±5.3353.66±16.94a′bd5-HD+DZT1T225.04±4.5654.71±8.54ad34.45±3.6169.69±9.98acdT2：与C组比aP<0.01，a′P<0.01；与CON组比bP<0.01；与DZ组比cP<0