骨碎补对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶和糖苷酶活性的抑制作用

骨碎补对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶和糖苷酶活性的抑制作用 骨碎补对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶和 糖苷酶活性的抑制作用 第26卷第lO期 2008年10月 中华中医药学刊 CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE Vo1.26No.1O Oct.2OO8 骨碎补对牙龈卟啉单胞菌胰酶样 蛋白酶和糖苷酶活性的抑制作用 左渝陵,陈果 (成都中医药大学附属医院,四川成都610075) 摘要:目的:观察骨碎补水提物对牙龈卟啉单胞茵胰酶样蛋白酶和糖苷酶活性的影响.方法:通过利用荧 光分光光度计检测荧光底物的降解来测定酶活力.结果:骨碎补各浓度均可不同程度抑制P异产生的胰酶样蛋白 酶和糖苷酶活性,终浓度为1.2#L的骨碎补液可抑制50%的TLP活性,而终浓度为1.3g/L的骨碎补液可抑制 50%的糖苷酶活性.结论:骨碎补水提物能有效抑制牙龈卟啉单胞茵胰酶样蛋白酶和糖苷酶的活性. 关键词:骨碎补;牙龈卟啉单胞茵;胰酶样蛋白酶;糖苷酶 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编 号:1673—7717(2oo8)10—2195—02 nhibitionofTrypsin——likeProteaseandGlycosidicEnzymeActivityof PorphyromonaGingivalisbyRhizomaDrynariaconExtract ZUOYu—ling,CHENGGuo (TheHospitalAffiliatiedtoChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,Sichuan,China) Abstract:Octive:AqueousextractofRhizomadrynariaconWastesteditsabilitytOinhibittrypsin—likeproteasey— cosidicenzymeactivityofPorphyromonagingivalis(Pg).Methods:ThedegradationofN一仅一benzoyl—L—arginine—AMC andN—CBZ—Gly—arg—AMCwasdeterminedbymeasuringthereleaseo fAMCwiththespectroflurophotometer.Results :Theextractconcentrationof1.2g/Linhibited50%degradationofthesubstrateoftrypsin—likeproteaserespectivelyand theextractconcentrationof1.3g/Linhibited50%degradationofthesubstrateofglycosidicenzymerespectively.Conclu— sion:AqueousextractofRhizomadrynariaconinhititedtrypsin—likeprotea seandglycosidicenzymeactivityeffectively. Keywords:Rhizomadrynariaeon;Porphyromonagingivalis;trypsin—like protease;glycosidicenzyme 牙龈卟啉单胞菌(Porph)romonasgingivalis,Pg)是公认 的引起慢性牙周炎的主要致病菌之一,能够产生蛋白水解 酶和糖苷酶,抑制这些胞外酶的活力则有可能降低它们在 口腔内的毒力,减缓细菌生长和菌斑形成. 骨碎补是牙周病治疗中常用中药,具有良好的临床疗 效.目前研究主要关注于骨碎补对牙周组织细胞的作用, 但是,将骨碎补应用于牙周致病菌,观察其对牙周致病菌胞 外酶的作用还未见报道.本文探讨骨碎补水提取物对 产生的胰酶样蛋白酶(trypsin—likeprotease,TLP)和糖苷酶 活性的作用. 1材料和方法 1.1菌液制备 将牙龈卟啉单胞菌PgATCC33277(四川大学口腔疾 病研究国家重点实验室)接种于改良GAM血液琼脂培养 基(北京新明生物技术研究所),置厌氧罐(80%N,,10% HE,10%CO2)37?复苏培养48h.收集细菌,用Tris—HCI 缓冲液(50mmol/LpH7.5)洗涤2次,一20~(2储存.使用 收稿日期:2008—05—17 基金项目:四川省科技攻关项目(2006Z09—024) 作者简介:左渝陵(1975一),男,重庆人,副主任医师,博士,研究方 向:口腔内科学. 时解冻,用Tris—HC1缓冲液将细菌制成波长62Onto处吸 光度值为0.1的细菌悬液. 1.2骨碎补提取物的制备 将粉碎的骨碎补和蒸馏水1:10(W:V)混合,沸水回 流5h.收集提取液,粗滤后残渣再次沸水回流3h.合并两 次提取液,旋转蒸发浓缩,所得为骨碎补水提物.使用时取 适量骨碎补提取物,溶于Tris—HC1缓冲液,配制成呈二倍 递减浓度的骨碎补液:64,32,16,8,4,2,1g/L,另设一组阴 性对照组. 1.3底物溶液的制备 用最小量二甲基亚砜溶解胰酶样蛋白酶底物N一一 benzoyl—L—arginine—AMC和糖苷酶底物N—CBZ—Gly— arg—AMC(Sigma公司)上述底物各取适量,Tris—HC1缓冲 液稀释为1001xg/mL底物液. 1.4酶活力测定由 实验组:细菌悬液各5001~L与各浓度骨碎补液250txL囊 混合;对照组:细菌悬液各5000.L与50mmol/LTris—HC1:: 缓冲液250IxL混合,在37?恒温中放置15min使二者充分2195 作用,随后分别加入1001xI_./mL荧光底物液250iLL,此时骨学 碎补液的终浓度为16L一0.25g/L,摇匀,37~C,20min后刊 应用RF一5000荧光分光光度计(13本岛津公司)在激发波 长380nm,发射波长460nm处测定各混合物的荧光强度. 第26卷第lO期 2008年10月 中华中医药学刊 CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE VD】.26No.1O Oct.2008 设立空白以排除骨碎补所致的荧光熄灭和底物本身的非生 物分解对实验结果的干扰. 根据荧光底物的降解,即荧光物质AMc的释放情况测 定骨碎补提取物对牙龈卟啉单胞菌产生的胞外酶活性的影 响,计算底物降解程度相对对照组的百分比及能降低50% 和9o%酶活性的五倍子浓度. 2结果 如图1,骨碎补各浓度均可不同程度抑制Pg产生的 rLP活性,终浓度为1.2g/L的骨碎补液可抑制50%的TLP 活性,而终浓度为l1.1g/L的骨碎补液可抑制90%的TLP 活性. 如图2,骨碎补各浓度均可不同程度抑制Pg产生的糖 苷酶活性,终浓度为1.3g/L的骨碎补液可抑制50%的糖 苷酶活 牙龈卟啉单胞菌(Pg)是公认的引起慢性牙周炎的主 要致病菌之一,在正常口腔中主要定植于龈袋和牙周袋内, 以牙菌斑生物膜形式存在….牙菌斑生物膜细菌的生长 有赖于它们能够产生一系列胞外酶(蛋白水解酶和糖苷 酶),这些酶通过去除终端氨基酸,去除旁链单糖和切断蛋 白内的肽键,协同有序地发挥作用降解宿主来源的蛋白和 糖蛋白为可消化基质j.牙龈卟啉单胞菌还能够产生特 异性的胰酶样蛋白酶(TLP),这是一种重要的蛋白水解 中酶,具有很强的蛋白水解活性,可裂解胰蛋白酶特异底物, 苫故称胰酶样蛋白酶.TLP可降解纤维连接蛋白,刺激成纤 医维细胞产生胶原酶,并激活牙周组织中无活性的胶原酶,破 —二.J一坏血清中的胶原酶抑制剂,从而激活胶原酶,降解胶原纤维 2196和基底膜胶原,使牙龈上皮和基底膜的完整性遭到破坏; 堂1I也可降解sIgA,IgA,IgG,降低牙周局部免疫功能,并为 刊牙周局部微环境中微生物的生长繁殖提供多肽和氨基酸等 营养物质,并促进龈下菌斑细菌间的共聚作用,促进牙菌斑 生物膜的形成和成熟;TLP还可激活补体,刺激前列腺素介 导的破骨细胞骨吸收,从而破坏牙周正常的组织结构,诱发 炎症反应,引起龈沟液分泌增加,为龈下菌斑致病菌的过度 生长,龈下菌斑微生态失衡提供条件.抑制Pg胞外酶活力 可以降低Pg毒力及其获得营养的能力,减缓细菌生长和茵 斑的形成,减少对牙周组织的破坏]. 骨碎补为为水龙骨科植物槲蕨Drynariafortunei (Kunze)J.Sm.的干燥根茎.始载于唐《本草拾遗》,味苦, 温,归肝经,肾经,具有补肾强骨,活血止血,续伤止痛之功 效.主治肾虚腰痛,牙齿松动,耳鸣耳聋,跌扑闪挫,筋骨折 伤,是牙周病治疗中常用中药,具有良好的临床疗效.目 前,国内外学者对骨碎补在治疗骨骼疾病方面的研究较多, 研究发现骨碎补能增强成骨细胞的功能和活性,促进新骨 形成’..有研究发现其具有改变软骨细胞功能,可以推迟 细胞退行性变,促进骨对钙的利用,提高血钙血磷水平,有 利于骨骼钙化和骨盐沉积J.关于骨碎补对牙周炎治疗 作用的研究也取得了进展,研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明骨碎补能促进体外培 养的人牙龈成纤维细胞和牙髓细胞的增殖并能增强牙龈成 纤维细胞在牙根面上附着的能力IS】. 但是,以往研究主要关注于骨碎补对牙周组织细胞的 作用,而将骨碎补应用于牙周致病菌,观察其对牙周致病菌 胞外酶的作用还未见报道.本研究发现,骨碎补水提物能 有效抑制牙周主要致病菌Pg产生特异性胞外蛋白水解酶 TLP和糖苷酶的活性,从而达到降低Pg毒力,减缓细菌生 长和菌斑的形成,减少牙周组织破坏的目的,从骨碎补对牙 周致病菌毒力因子的抑制作用方面初步探索了骨碎补治疗 牙周病的作用机制,为骨碎补治疗牙周病的开发利用提供 新的理论依据. 参考文献 [1]史俊南.现代口腔内科学[M].2版.北京:高等教育出版社, 2004:459—461. 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