RACE技术的原理和操作
RACE技术的原理和操作
发布日期:2009-11-27 热门指数:15803 分享 | 收藏 近年来随着生物技术的不断发展,出现了许多克隆新基因的方法和手段,如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术,主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端,包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善,克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3' 端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16-30MN-3',M=A/G/C;N=A/G/C/T】,使引物定位在poly(A)尾的起始点,从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5' 端加尾时,采用poly(C),而不是poly(A);改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温(60? -70?)有效地逆转录mRNA,从而消除了5'端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。
TM随着RACE技术日益完善,目前己有商业化RACE技术产品推出,如CLONTECH的Maratho技术和
TM SMARTRACE技术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应,结果发现使用Ma
TMTM Trathon所得到的片断总是比采用SMARTRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于MarathonMTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5' 末端。所以认为,进行RACE反应应当优选SMART
TMRACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMART RACE试剂盒为例,简要概述RACE技术的原理和操作过程。
TMSMART 3'-RACE的原理
利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成
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第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物,以cDNA第一链为
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,进行PCR循环,把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。(见Figure 1)
Figure 1.
TMSMART 5'-RACE的原理
先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下,反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性,在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个(dC)残基,退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后,转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(见Figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物,用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物,以SMART第一链cDNA为模板,进行PCR循环,把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终,从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA,或者通过
分析
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RACE产物的3'和5'端序列,合成相应引物扩增出全长cDNA。
Figure 2.
实验中发现,做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此,对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为:
第一,在5'-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增),每一步都可能导致失败;
第二,扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性,因而特异性一般很低,常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此,使用RACE技术扩增得到的特异末端片段,所获得的重组克隆最好能够全部测序,以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性,最终有可能获得新基因的全序列。
随着RACE的不断改进和完善,优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高及PCR产物克隆技术的迅速发展,RACE必将在基因克隆及基因
表
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达研究中发挥越来越大的作用。
RACE的另一种代表方法-Self-Ligation法
1. 反转录(RT)反应。
2. Hybrid RNA的分解。
3. 单链cDNA的自身连接。
4. PCR扩增5'未知区域。
5. 目的DNA片段的切胶回收。
6. DNA序列测定。
原理见Figure 3。
Figure 3. , 请您对这篇文章发表看法
, (93)
(65) ,
开放阅读框(ORF)
来源:Biox.cn | 2008-11-25 9:31:27 | 阅读 1881次
1. 如果遗传密码是不重叠的三联体,那么会有三种可能的方式将核苷酸翻译成蛋白质, 这三种可能的读码(Reading frame ) 方式称为读码框架。比如序列:
ACGACGACGACGACGACG,可能的读码框架就有以下三种:
ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG
CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA
GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC
一个由能翻译成氨基酸序列的三联体构成的阅读框称为开放读框(Open reading frame,ORF) 。一段翻译成蛋白质的序列有一个阅读框架,它有一个特殊的起始密码子(AUG),从此延伸出一系列代表氨基酸的三联体,一直到在三种类型的终止密码子上结束(见第5 章)。如果终止密码子频繁出现,就会阻止阅读框被翻译成蛋白质。一个序列的三个阅读框全部被阻断,那么它就会失去翻译成蛋白质的功能。
当获得一个未知的DNA 序列后,就可分析其三个读码框是被阻断的还是开放的。在任何一段DNA 中,通常不会超过一个读码框是开放的(图1.26) ,因为替换的读码框被频繁出现的终止密码子阻断。一般情况,开放读框不可能太长。如果它不翻译成蛋白质,将不存在阻止终止密码子聚集的选择压力。证明序列是开放框是确定该框架能翻译为蛋白质的首要证据。一个不能表达蛋白质的开放读框被称为不确定读框(URF) 。
2. 一个DNA顺序可能有3种阅读框,但只有一种具有编码的作用,称为开放阅读框(open reading frame or ORF)。有的阅读框因终止密码出现频繁故不能生成蛋白,这种阅读框称为封闭阅读框(block reading frame)。若一个顺序所有的三个阅读框都是封闭的,则它无编码蛋白的功能。一个翻译成蛋白的顺序有一个阅读框,开始于AUG起始密码子,通过一系列有义密码子,直到终止密码子结束。通常3个阅读框中总有封闭
阅读框的存在。
当获得了一个未知功能的DNA区域的顺序,要通过分析来确定阅读框是开放的还是封闭的。在任何一个DNA顺序中往往只有一个开放阅读框。ORF似乎并不是随机存在。如果一个顺序不翻译成蛋白质,那么将无选择压力来阻止其中产生无义密码子(有时无义密码子这个词也用于终止密码子。“无义”是个错误的名词,因为这种密码即使在突变基因中中断了蛋白质合成,但仍有含义的),这样一个长ORF的鉴别乍看起来这个
顺序好象是可以翻译的。一个ORF未鉴别出蛋白产物,有时称其为非鉴定阅读框(unidentified reading frame,URF)。
3. 开读框架(Open Reading Frame: ORF)的预测常与第一个ATG和终止密码子的确定相关,但由于EST序列相对较低的测序质量,在测序过程中出现的碱基删除或插入错误(称为indel错误)将引起读框移动,甚至出现假终止密码子,所以,仅凭第一个ATG和终止密码子是不足以确定ORF的